杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥與遺傳

關(guān)于杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥與遺傳2022/10/25第1頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五疾病概述第2頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五DystrophiemusculairedeDuchenneDMD，杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良，假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良Dystrophine（Dys）抗肌萎縮蛋白缺失MaladiemonogeniqueHétédité:XRDuchenne,unneurologiste

fran?ais,adonnéunedescriptioncomplètede13maladiesattaints第3頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五PhénotypeCliniquedelaDMDLesmusclesjumeauxdesjambsdesgar?onsatteintsapparaissentqu’ilssoientdéveloppésMaisasthéniques假性肌肥大Tissuconjonctifetlagraisse第4頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五PhénotypeCliniquedelaDMD1~2ansnormal3~5ansdéveloppeunefaiblessemusculaireDèsl’agede12ansconfinéenchaiseroulantAu-delàdel’agede20ansnesurvivraQI智商unechutemodéréd’environ20points第5頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五LabCréatinekinase(niveausérique)血清濃度50~100foislalimitesupérieuredelanormaledanslesstadesprécoces第6頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五DystrophiemusculairedeBeckerlegènedeladystrophieBeaucoupplusatténué緩和

Aprèsl’agede16ansparvientàmarcher之后多年也可行走第7頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五DMD與BMD的差異DMD——致死BMD——存活率非常高(70%),易產(chǎn)生新的突變第8頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五遺傳第9頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五遺傳特征Hétédité:XR親代生殖細(xì)胞子代XH

Xh

YXH

×XH

Xh

YXH

XH

XH

XH

Xh

YXH

YXh

正常女性正常男性女性攜帶者男性患者第10頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五遺傳特征（1）系譜中常常只有男性患者（2）父母都無(wú)病時(shí)，女兒則不會(huì)發(fā)病，兒子可能發(fā)病；（3）由于交叉遺傳，患者的同胞、舅舅、姨表兄弟、外甥常常為本病患者；（4）由于男性患者的子女都正常，故可見(jiàn)隔代遺傳；（5）女性患者的父親一定是患者,母親一定是攜帶者。第11頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五DMD—男女差異男性致死1/3néomutation,2/3mèreporteuse女性攜帶者

Majorité無(wú)任何臨床表現(xiàn)，70%肌酸激酶(Créatinekinase)增高8%輕微的肌肉癥狀,有些還有嚴(yán)重的近心端肌肉障礙。女性很少患有DMD第12頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五母系鑲嵌某男性是家族中DMD的先證者他的母親沒(méi)有攜帶突變基因遺傳位點(diǎn)上發(fā)生了新近的突變大約5%-15%的這些發(fā)生的例子是由于母系生殖鑲嵌第13頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五DMD—發(fā)病率較高Gar?onsnouveau-nés：1/3300Untauxdemutation：1/10000每天一個(gè)男性每11-12秒會(huì)產(chǎn)生1個(gè)新突變的精子（8x107parjour）

第14頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五基因與蛋白第15頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五GèneDMD人類(lèi)最大的基因之一，2300kb

位于Xp??占X染色體全長(zhǎng)的1.5%99%的序列由內(nèi)含子組成編碼區(qū)包括79個(gè)外顯子及7個(gè)組織特異性的啟動(dòng)子其mRNA序列長(zhǎng)114kb主要表達(dá)于骨骼肌、心肌，少量表達(dá)于腦組織第16頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五7個(gè)組織特異性的啟動(dòng)子,B(腦皮質(zhì))、M(肌組織)、P(蒲肯野纖維)、R(視網(wǎng)膜)、B3(腦組織)、S(施旺細(xì)胞)和G(肌組織之外的多種組織器官)B型：大腦皮層、海馬回神經(jīng)元P型：小腦蒲肯野細(xì)胞,在骨骼肌也有極少量的表達(dá)M型：骨骼肌、心肌組織,同時(shí)在腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也有少量表達(dá)第17頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五Dystrophin抗肌萎縮蛋白全長(zhǎng)型dystrophin是一種427kDa的棒狀蛋白,長(zhǎng)約150nm,分為4個(gè)區(qū)域，氨基端區(qū)域中央棒狀區(qū)富含半胱氨酸區(qū)域羧基端區(qū)域第18頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五A.位于Xp21,黑色的豎線代表分布于整個(gè)基因上的79個(gè)外顯子,黑色箭頭指示各組織特異性啟動(dòng)子不同的啟動(dòng)位點(diǎn),分別以不同的字母縮寫(xiě)來(lái)代表,B(腦皮質(zhì))、M(肌組織)、P(蒲肯野纖維)、R(視網(wǎng)膜)、B3(腦組織)、S(施旺細(xì)胞)和G(肌組織之外的多種組織器官)。B.不同形式的dystrophin蛋白及其區(qū)域組成,氨基端、中央棒狀區(qū)域、富含半胱氨酸區(qū)域及羧基端區(qū)域第19頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五DMD患者：60%基因突變表現(xiàn)為缺失一般在基因的5’端和中央棒區(qū)兩個(gè)區(qū)域BMD患者：可能缺失了一個(gè)或者幾個(gè)基因序列dystrophine蛋白的特點(diǎn)DMD患者體內(nèi)很少或者沒(méi)有BMD患者體內(nèi)有表達(dá)，但是仍然比正常人少第20頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五第21頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五臨床治療第22頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五DMD治療目前為止尚無(wú)治療DMD的有效方法藥物治療（對(duì)癥治療）：糖皮質(zhì)激素治療短期口服激素治療可增強(qiáng)骨骼肌力量和功能，并可能在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定骨骼肌力量和功能基因治療：利用不直接引起人類(lèi)疾病，免疫原性較小的腺相關(guān)病毒（AAV）為載體，導(dǎo)入人工剪裁的Dys基因修正肌肉組織(占全身體重40％)的基因缺陷遇到各種各樣的困難康復(fù)治療、矯形治療、社會(huì)心理治療等第23頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五臨床檢測(cè)第24頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五產(chǎn)前診斷和雜合子診斷90%攜帶者孕婦中產(chǎn)前診斷可能有至少95%的精確度由于基因突變導(dǎo)致基因的缺失或者多倍體的家庭中，60%-70%可以直接通過(guò)southern印跡雜交技術(shù)或者PCR技術(shù)來(lái)測(cè)量胎兒的DNA得到在其余的基因缺失不能明確診斷出來(lái)的家庭中，可以通過(guò)鍵的標(biāo)記來(lái)完成產(chǎn)前診斷與患病男性結(jié)婚的女性中75%的女性：DNA檢查、CK血清濃度檢查——胎兒是否攜帶25%女性難檢測(cè)：第一，在病程的一些時(shí)期，基因缺陷是無(wú)法被檢查出來(lái)的（可能情況就是等位基因是正常的或者突變的等位基因位于另外一條X染色體上）第二，一些家庭的一些成員的樣本丟失了第三，兩個(gè)標(biāo)記基因之間的基因重組在X染色體傳入下一代之前發(fā)生了（母系鑲嵌）

第25頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五產(chǎn)前檢測(cè)生物化學(xué)檢查——CK血清濃度基因診斷多重PCRSouthernblot探針連接多重?cái)U(kuò)增(MLPA)變性高效液相色譜(DHPLC)抗肌萎縮蛋白的免疫組化第26頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五多重PCR方法——DMD、BMD相關(guān)基因的缺失、重復(fù)可直接檢出DMD／BMD的缺失型突變65％的患者為基因缺失所致多重PCR:使用多對(duì)引物的針對(duì)DMD基因的缺失熱區(qū)，利用多對(duì)PCR引物在一個(gè)PCR管中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)外顯子，通過(guò)和正常對(duì)照相比較而判斷外顯子的缺失情況第27頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五多重PCR方法優(yōu)點(diǎn)：1、具有敏感、特異性強(qiáng)和可重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)2、需要的DNA量少、操作簡(jiǎn)單局限性:1.女性攜帶者——正常x染色體的屏蔽效應(yīng)，無(wú)法檢出2.多重PCR體系內(nèi)，由于引物之間的相互競(jìng)爭(zhēng)，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)個(gè)別片段擴(kuò)增的假陰性結(jié)果。（對(duì)初次擴(kuò)增呈陰性結(jié)果的片段進(jìn)行再次擴(kuò)增，以驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性）第28頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五Southernblot方法——DMD、BMD相關(guān)基因的缺失、重復(fù)是一種常用的DNA定量的分子生物學(xué)方法原理將待測(cè)的DNA樣品固定在固相載體(硝酸纖維膜或尼龍膜)上與同位素標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號(hào)通過(guò)檢測(cè)信號(hào)的有無(wú)、強(qiáng)弱可以對(duì)樣品定性、定量，從而計(jì)算出轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù)第29頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五Southernblot方法優(yōu)點(diǎn)：Southern雜交準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)缺點(diǎn)：1、不經(jīng)過(guò)靶片段的擴(kuò)增(PCR)，一般每個(gè)電泳通道需要10~30μg的DNA，在實(shí)際操作中就需較大量的DNA樣品2、Soutllem雜交不能確定缺失的準(zhǔn)確外顯子范圍，對(duì)檢測(cè)女性重復(fù)突變(duplication)或三重重復(fù)(triplication)攜帶者存在困難3、由于DMD基因很大，需要6到8個(gè)cDNA探針，雜交反應(yīng)才能覆蓋整個(gè)DMD基因，要1～2周時(shí)間用來(lái)分析，勞動(dòng)量大4、需要使用放射性同位素作為示蹤物，會(huì)對(duì)工作環(huán)境帶來(lái)污染第30頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五多重探針連接依賴(lài)性擴(kuò)增技術(shù)MLPA

multiplexprobeligationdependentamplification原理針對(duì)所有需要檢測(cè)突變的DNA序列，設(shè)計(jì)多對(duì)特異探針固定在尼龍膜上和待測(cè)樣品DNA雜交然后洗膜（正常序列和探針雜交后不被洗脫）利用連接酶把探針連接起來(lái)使用一套通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR產(chǎn)物用PCR儀進(jìn)行分析，DNA片段的缺失／重復(fù)以及拷貝數(shù)以測(cè)序儀得到信號(hào)的有無(wú)及信號(hào)的峰高或面積進(jìn)行計(jì)算第31頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五優(yōu)點(diǎn)：可以在1個(gè)PCR管中完成多達(dá)40個(gè)外顯子的缺失／重復(fù)檢測(cè)專(zhuān)門(mén)用于DMD缺失／重復(fù)檢測(cè)的試劑盒，通過(guò)2個(gè)PCR反應(yīng)就可以完成79個(gè)外顯子及其非翻譯序列的缺失／重復(fù)突變篩查靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)快捷第32頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五DMD患者(A)及其母親(B)的20-47號(hào)外顯子的MLPA檢測(cè)結(jié)果第33頁(yè)，共36頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)26分，星期五變性高效液相色譜DHPLCdenaturinghighperformanceliquidchromatography原理用離子對(duì)逆向?qū)游龇ǚ蛛x并檢測(cè)異源雙鏈通過(guò)三乙基醋酸鈉（TEAA)作為橋分子，帶正電的氨基與核酸分子帶負(fù)電電荷的磷酸基相互作用，烷基端與色譜柱基質(zhì)表面的疏水基團(tuán)相