抑制性消減雜交技術介紹課件

抑制性消減雜交抑制性消減雜交主要內容2

3

4

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抑制性差減雜交技術概述October27,20222

抑制性差減雜交原理抑制性差減雜交流程主要內容2341抑制定義：抑制差減雜交（SSH）SSH是一種基于抑制PCR和差減雜交技術建立的,在轉錄水平上研究基因表達的技術。抑制差減雜交技術SSHOctober27,20223

定義：抑制差減雜交（SSH）SSH是一種基于抑制PCR和差減不同豐度的單鏈DNA得到均衡雜交動力學目的基因得到富集抑制性PCR抑制性消減雜交—原理October27,20224

不同豐度的單鏈DNA得到均衡雜采用兩次消減雜交和兩次PCR，保證了高特異性；通過雜交操作，可以獲得低豐度差異表達基因；操作簡便，實用有效，全過程僅需3

-

4天。假陽性率低、特異性高、靈敏度高、操作簡便、周期短抑制性消減雜交—特點October27,20225

采用兩次消減雜交和兩次PCR，保證了高特異性；假陽性率低、特

構建消減cDNA文庫研究細菌毒力的相關基因研究病原體感染后的應答基因鑒定抗病毒相關基因......抑制性消減雜交—應用October27,20226

構建消減cDNA文庫抑制性消減雜交—應用Octob處理組非處理組TesterDriver正向消減DriverTester反向消減抑制性消減雜交實驗方法October27,20227

處理組非處理組TesterDriver正向消減DriverT0.5～2μgpolyA+

RNA0.01～1μg總RNA傳統(tǒng)方法合成cDNASMARTerTMPCR方法合成cDNA

RsaI限制性內切酶酶切cDNA末端接頭連接兩次消減雜交兩次PCR擴增富集差異表達基因SMARTer?PCRcDNASynthesisKit(634925/26):從2

ng總RNA中合成cDNASMARTer?Pico

PCRcDNASynthesisKit(634928):從低至1

ng的總RNA中合成cDNA實驗流程October27,20228

雜交動力學抑制性PCR0.5～2μgpolyA+RNA0.01～1由RNA合成cDNARsaI限制性內切酶酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程Tester

cDNA+

Adaptor1Tester

cDNA+Adaptor2ROctober27,20229

由RNA合成cDNARsaI限制性內切酶酶切cDNA末由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程Tester

cDNA

with

Adaptor1Tester

cDNAwith

Adaptor2RDriver

cDNA（過量）ABCDABCDOctober27,202210

由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程ABCDTester雜交液（Adaptor

1）ABCDTester雜交液（Adaptor

2R）Driver

cDNA（加熱變性）A,B,C,DEOctober27,202211

由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程A,B,C,DABCDE末端補齊EEOctober27,202212

由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程ABCDE加入共用PCR引物A,D:不能被擴增C:線性擴增B:擴增受到抑制E5’3’3’5’EEOctober27,202213

由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接非特異性表達基因得到極大的扣除，高效地富集了差異表達基因。由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程E5’3’3’5’加入巢式PCR引物EOctober27,202214

非特異性表達基因得到極大的扣除，由RNA合成cDNARsa由RNA合成cDNARsaI

酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊瓊脂糖凝膠電泳檢測，RNA有兩條明顯的帶28S和18S，亮度在2:1左右。OD260/OD280

為1.8～2.2。哺乳動物poly＋ARNA

0.5～12kb，非哺乳動物0.5～3kb。M小鼠肝臟總RNA28S18S5S實驗過程要點分析October27,202215

由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接M:

Marker1:未酶切的ds

cDNA2:酶切后的ds

cDNA人類骨骼肌dscDNA如果酶切效果不好，需要重新抽提純化cDNA，重新進行酶切。由RNA合成cDNARsaI

酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊October27,202216

實驗過程要點分析M:Marker人類骨骼肌dscDNA如果酶切效果不好如果1和3的亮度低于2和4的1/4，那么接頭連接效率小于25％。提供了人類、鼠類的G3PDH基因的PCR擴增引物。人類G3PDH基因檢測結果750bp450bpcDNA在沉淀過程中被鹽污染了，或者是第二鏈的合成效率低。由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊October27,202217

實驗過程要點分析如果1和3的亮度低于2和4的1/4，那么接頭連接效率小于25M:ФX174-HeaⅢ消化。1:雜交骨骼肌肉tester二次PCR產物2:未雜交的骨骼肌肉testerG3PDH基因得到了極大的扣除消減雜交效率分析抑制性消減雜交結果分析October27,202218

M:ФX174-HeaⅢ消化。G3PDH基因得到了極大-以2ug/ml

PHA和2ng/ml

PMA處理72小時后的人類Jurkat

T細胞的cDNA作為Tester，未處理的cDNA作為Driver。Tester

cDNA、DrivercDNA及消減后的cDNA擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳（每個孔上樣量為0.3ug）并轉移到尼龍膜上，分別與已知活性的IL-2Rα基因和看家基因G3PDH核酸探針進行雜交。差異表達基因的富集與看家基因的扣除October27,202219

-以2ug/mlPHA和2ng/mlPMA處理72小時后純化二輪PCR產物（cDNA消減庫）T/A克隆，特異位點或平末端克隆到相關載體中，轉化大腸桿菌藍白斑篩選和瓊脂糖凝膠電泳檢測初步篩選出陽性重組克隆BlAST同源性分析確認差異表達基因的EST序列根據EST序列設計引物，利用Clontech產品RACE試劑盒獲得全長cDNA將獲得全長cDNA克隆到相關表達載體上，進行基因功能分析。測序后獲得EST序列利用Clontech差異篩選試劑盒（637403）進行點雜交分析（

32P同位素標記）篩選出差異表達基因后續(xù)實驗流程October27,202220

純化二輪PCR產物（cDNA消減庫）T/A克隆，特異位點或平抑制性消減雜交抑制性消減雜交主要內容2

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抑制性差減雜交技術概述October27,202222

抑制性差減雜交原理抑制性差減雜交流程主要內容2341抑制定義：抑制差減雜交（SSH）SSH是一種基于抑制PCR和差減雜交技術建立的,在轉錄水平上研究基因表達的技術。抑制差減雜交技術SSHOctober27,202223

定義：抑制差減雜交（SSH）SSH是一種基于抑制PCR和差減不同豐度的單鏈DNA得到均衡雜交動力學目的基因得到富集抑制性PCR抑制性消減雜交—原理October27,202224

不同豐度的單鏈DNA得到均衡雜采用兩次消減雜交和兩次PCR，保證了高特異性；通過雜交操作，可以獲得低豐度差異表達基因；操作簡便，實用有效，全過程僅需3

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4天。假陽性率低、特異性高、靈敏度高、操作簡便、周期短抑制性消減雜交—特點October27,202225

采用兩次消減雜交和兩次PCR，保證了高特異性；假陽性率低、特

構建消減cDNA文庫研究細菌毒力的相關基因研究病原體感染后的應答基因鑒定抗病毒相關基因......抑制性消減雜交—應用October27,202226

構建消減cDNA文庫抑制性消減雜交—應用Octob處理組非處理組TesterDriver正向消減DriverTester反向消減抑制性消減雜交實驗方法October27,202227

處理組非處理組TesterDriver正向消減DriverT0.5～2μgpolyA+

RNA0.01～1μg總RNA傳統(tǒng)方法合成cDNASMARTerTMPCR方法合成cDNA

RsaI限制性內切酶酶切cDNA末端接頭連接兩次消減雜交兩次PCR擴增富集差異表達基因SMARTer?PCRcDNASynthesisKit(634925/26):從2

ng總RNA中合成cDNASMARTer?Pico

PCRcDNASynthesisKit(634928):從低至1

ng的總RNA中合成cDNA實驗流程October27,202228

雜交動力學抑制性PCR0.5～2μgpolyA+RNA0.01～1由RNA合成cDNARsaI限制性內切酶酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程Tester

cDNA+

Adaptor1Tester

cDNA+Adaptor2ROctober27,202229

由RNA合成cDNARsaI限制性內切酶酶切cDNA末由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程Tester

cDNA

with

Adaptor1Tester

cDNAwith

Adaptor2RDriver

cDNA（過量）ABCDABCDOctober27,202230

由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程ABCDTester雜交液（Adaptor

1）ABCDTester雜交液（Adaptor

2R）Driver

cDNA（加熱變性）A,B,C,DEOctober27,202231

由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程A,B,C,DABCDE末端補齊EEOctober27,202232

由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程ABCDE加入共用PCR引物A,D:不能被擴增C:線性擴增B:擴增受到抑制E5’3’3’5’EEOctober27,202233

由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接非特異性表達基因得到極大的扣除，高效地富集了差異表達基因。由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊實驗流程E5’3’3’5’加入巢式PCR引物EOctober27,202234

非特異性表達基因得到極大的扣除，由RNA合成cDNARsa由RNA合成cDNARsaI

酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊瓊脂糖凝膠電泳檢測，RNA有兩條明顯的帶28S和18S，亮度在2:1左右。OD260/OD280

為1.8～2.2。哺乳動物poly＋ARNA

0.5～12kb，非哺乳動物0.5～3kb。M小鼠肝臟總RNA28S18S5S實驗過程要點分析October27,202235

由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接M:

Marker1:未酶切的ds

cDNA2:酶切后的ds

cDNA人類骨骼肌dscDNA如果酶切效果不好，需要重新抽提純化cDNA，重新進行酶切。由RNA合成cDNARsaI

酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊October27,202236

實驗過程要點分析M:Marker人類骨骼肌dscDNA如果酶切效果不好如果1和3的亮度低于2和4的1/4，那么接頭連接效率小于25％。提供了人類、鼠類的G3PDH基因的PCR擴增引物。人類G3PDH基因檢測結果750bp450bpcDNA在沉淀過程中被鹽污染了，或者是第二鏈的合成效率低。由RNA合成cDNARsaI酶切cDNA末端接頭連接第一次消減雜交第二次消減雜交第一次PCR擴增第二次PCR擴增富集差異表達基因末端補齊October27,202