分子克隆技術步驟

分子克隆技術步驟分子克隆技術步驟分子克隆技術步驟xxx公司分子克隆技術步驟文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準審核制定方案設計，管理制度分子克隆技術步驟

在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉化與轉導的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復制與擴增，然后再從篩選的寄主細胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。

克隆在生物學中其名詞含義系指一個細胞或個體以無性繁殖的方式產(chǎn)生一群細胞或一群個體，在不發(fā)生突變的情況下，具有完全相同的遺傳性狀，常稱無性繁殖(細胞)系；其動詞(clone,cloned,cloning)含義指在生物體外用重組技術將特定基因插入載體分子中，即分子克隆技術。

將DNA片段(或基因)與載體DNA分子共價連接，然后引入寄主細胞，再篩選獲得重組的克隆，按克隆的目的可分為DNA和cDNA克隆兩類。

cDNA克隆是以mRNA為原材料，經(jīng)體外反轉錄合成互補的DNA(cDNA)，再與載體DNA分子連接引入寄主細胞。每一cDNA反映一種mRNA的結構，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特點是：

①有些生物，如RNA病毒沒有DNA，只能用cDNA克??；

②cDNA克隆易篩選，因為cDNA庫中不包含非結構基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一個mRNA的信息；

③cDNA能在細菌中表達。cDNA僅代表某一發(fā)育階段表達出來的遺傳信息，只有基因文庫才包含一個生物的完整遺傳信息。

1.方法：

(1)DNA片段的制備：常用以下方法獲得DNA片段：①用限制性核酸內(nèi)切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超聲波)取得DNA隨機片段；③在已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對應的基因片段；④從mRNA反轉錄產(chǎn)生cDNA。

(2)載體DNA的選擇：

①質(zhì)粒：質(zhì)粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環(huán)狀，大小為1-200千堿基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質(zhì)粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態(tài)，一是“緊密型”；二是“松馳型”。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質(zhì)粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用于構建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。

②噬菌體DNA：常用的λ噬菌體的DNA是雙鏈，長約49kb，約含50個基因，其中50%的基因對噬菌體的生長和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體DNA兩端。中間是非必需區(qū)，進行改造后組建一系列具有不同特點的載體分子。λ載體系統(tǒng)最適用于構建真核生物基因文庫和cDNA庫。

M13噬菌體是一種獨特的載體系統(tǒng)，它只能侵襲具有F基因的大腸桿菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌內(nèi)是雙鏈環(huán)狀分子，象質(zhì)粒一樣自主制復，制備方法同質(zhì)粒。寄主菌可分泌含單鏈DNA的M13噬菌體，又能方便地制備單鏈DNA，用于DNA順序分析、定點突變和核酸雜交。

③拷斯(Cos)質(zhì)粒：是一類帶有噬菌體DNA粘性末端順序的質(zhì)粒DNA分子。是噬菌體－質(zhì)?；旌衔?。此類載體分子容量大，可攜帶45kb的外源DNA片段。也能象一般質(zhì)粒一樣攜帶小片段DNA，直接轉化寄主菌。這類載體常被用來構建高等生物基因文庫。

(3)DNA片段與載體連接：DNA分子與載體分子連接是克隆過程中的重要環(huán)節(jié)之一，方法有：①粘性末端連接，DNA片段兩端的互補堿基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內(nèi)切酶消化DNA可產(chǎn)生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復原樣，有些限制性內(nèi)切酶雖然識別不同順序，卻能產(chǎn)生相同末端。②平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產(chǎn)生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端連接。④人工接頭分子連接，在平頭DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性內(nèi)切酶識別位點的寡核苷酸片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶作用后就會產(chǎn)生粘性末端。

連接反應需注意載體DNA與DNA片段的比率。以λ或Cos質(zhì)粒為載體時，形成線性多連體DNA分子，載體與DNA片段的比率高些為佳。以質(zhì)粒為載體時，形成環(huán)狀分子，比率常為1∶1。

(4)引入寄主細胞：常用兩種方法：①轉化或轉染，方法是將重組質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA(M13)與氯化鈣處理過的宿主細胞混合置于冰上，待DNA被吸收后鋪在平板培養(yǎng)基上，再根據(jù)實驗設計使用選擇性培養(yǎng)基篩選重組子，通常重組分子的轉化效率比非重組DNA低，原因是連接效率不高，有許多DNA分子無轉化能力，而且重組后的DNA分子比原載體DNA分子大，轉化困難。②轉導，病毒類侵染宿主菌的過程稱為轉導，一般轉導的效率比轉化高。

(5)克隆的選擇：①直接篩選：有些載體帶有可辨認的遺傳標記，能有效地將重組分子與本底區(qū)分。例如：有些λ噬菌體攜帶外源基因后形成的噬菌斑就會從原來的混濁變?yōu)榍辶?；還有些載體分子攜帶外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯變化，如藍色變?yōu)闊o色；有些λ噬菌體能侵染甲菌而不能侵染乙菌，攜帶外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌釋放的噬菌體均為重組分子。②間接篩選：有引起載體分子帶有一個或多個抗藥性標記基因，當外源DNA插入到抗藥基因區(qū)后，基因失活，抗性消失。如一質(zhì)粒有A和B兩個抗藥性基因，當外源基因插入到B基因區(qū)后，便只抗A藥而不抗B藥。因此能在A藥培養(yǎng)基上正常生長而不能在B藥培養(yǎng)上生長的便是重組分子。③核酸雜交：廣泛用于篩選含有特異DNA順序的克隆。方法是將菌落或噬菌斑“印跡”到硝酸纖維膜等支持物上，變性后固定在原位，然后與標記的核酸探針進行雜交。陽性點的位置就是所需要的克隆。④免疫學方法：如果重組克隆能在宿主菌中表達，就可以用特異的蛋白質(zhì)抗體為探針，進行原位雜交，選擇特異的克隆。2.重要意義與應用：分子克隆技術是70年代才發(fā)展起來的，它的出現(xiàn)和應用開辟了分子遺傳學研究的新領域，打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創(chuàng)造新物種的大門。它的成就對于工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)和醫(yī)學產(chǎn)生深遠影響，并將為解決世界面臨的能源、食品和環(huán)保三大危機開拓一條新的出路。在醫(yī)學方面，利用分子克隆技術已將胰島素，人、牛和雞的生長激素、人的干擾素、松馳素、促紅細胞生長激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用發(fā)酵工業(yè)進行了大規(guī)模生產(chǎn)。還可提高微生物本身所產(chǎn)生的蛋白酶類和抗生素類藥物的產(chǎn)量。在基因治療方面。通過遺傳工程看到癌細胞具有逆轉為正常細胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠腫瘤細胞，在溫度高時可逆轉為正常細胞。為治療半乳糖血癥，用帶有大腸桿菌乳糖操縱子的λ噬菌體去感染半乳糖血癥患者的離體培養(yǎng)細胞，發(fā)現(xiàn)這種細胞的半乳糖苷酶達到了正常水平，并確實能代謝半乳糖。在工業(yè)生產(chǎn)方面，以分子克隆技術為主體的基因工程、細胞工程、酶工程和發(fā)酵工程，四者緊密聯(lián)系、常綜合利用。許多化學試劑如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、環(huán)氧乙烷、烏頭酸和水楊酸等都可能利用分子克隆技術得到產(chǎn)品。在環(huán)境保護方面，人們根據(jù)需要進行基因操作，將某種微生物的基因轉入另一微生物，創(chuàng)造一些對有害物質(zhì)降解能力更強的新菌種，以分解工業(yè)污水中的有毒物質(zhì)。在食品工業(yè)方面，細菌可為人類生產(chǎn)有價值的蛋白質(zhì)、氨基酸和糖等。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，植物遺傳工程對提高農(nóng)作物的產(chǎn)量、培育新的農(nóng)作物品種提供了可能。有許多外源基因導入植物獲得成功。分子克隆——主要步驟分子克隆可以分為以下幾個步驟：（1）帶有目的基因的DNA片段的獲得（2）重組DNA分子的構建（3）重組DNA分子的轉化和重組克隆的篩選（4）特定重組克隆的鑒別1.帶有目的基因的DNA片段的獲得：可以用限制內(nèi)切酶降解基因組DNA，再配合使用其他實驗手段得到待定的DNA片段，可以用超速離心的方法分離出具有特定核苷酸組成的DNA片段，可以用mRNA做模板，用反轉錄酶合成互補DNA，即cDNA，也可以用化學合成的方法直接合成一段DNA。2.重組DNA分子的構建：重組DNA分子中包括兩部分，一部分是外源DNA，即目的DNA片段，另一部分是載體DNA。用作載體的，有質(zhì)粒、噬菌體或病毒DNA。它們的基本特征是能夠獨立復制。如果用同一種限制性內(nèi)切酶切割這兩種DNA，則它們的末端完全相同，由于有互補的單鏈末端序列存在，在連接酶的作用下，就可以形成重組DNA分子。在沒有互補單鏈末端的情況下，也可以用酶學方法造成一個互補單鏈末端之后再進行連接。3.重組DNA分子的轉化和重組克隆的篩選：重組DNA分子必須進入宿主細胞中，才能得到擴增和表達．這個過程叫做轉化。大腸桿菌是目前使用最廣泛的宿主細胞。除此以外．其他細菌、酵母、哺乳動物細胞等也可作為宿主細胞，可以根據(jù)實驗的需要加以選擇。在被轉化的宿主細胞中，不同的單個細胞(在平板上表現(xiàn)為單個菌落，亦稱克隆)中可能含有不同的重組質(zhì)粒或非重組質(zhì)粒，因此必須進行篩選，以便確定哪些是重組克隆。篩選可以使用抗菌素抗性或其他方法，依載體的性質(zhì)而定。4.特定重組克隆的鑒別：由于重組克隆往往是較多的，而在某一克隆實驗中，我們感興趣的目的克隆只有一個或幾個，所以需要進一步鑒別。使用的方法主要有核酸雜交法和免疫化學法。此外，找出了目的克隆之后，還需要根據(jù)實驗的目的，進一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的結構和功能。主要有酶切圖譜的制定，基因在DNA片段上的精確定位，確定是否有內(nèi)含子，DNA序列分析，離體翻譯實驗，外源基因在某些宿主細胞中的表達及產(chǎn)物的提純等。分離制備待克隆的DNA片段————將靶DNA片段與載體在體外進行連接————重組DNA分子轉入宿主細胞————篩選、鑒定陽性重組子————重組子的擴增。分子克隆方法DNA片段的制備常用以下方法獲得DNA片段：①用限制性核酸內(nèi)切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超聲波)取得DNA隨機片段；③在已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對應的基因片段；④從mRNA反轉錄產(chǎn)生cDNA。載體DNA的選擇①質(zhì)粒：質(zhì)粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環(huán)狀，大小為1-200千堿基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質(zhì)粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態(tài)，一是“緊密型”；二是“松弛型”。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質(zhì)粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用于構建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。②噬菌體DNA：常用的λ噬菌體的DNA是雙鏈，長約49kb，約含50個基因，其中50%的基因對噬菌體的生長和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體DNA兩端。中間是非必需區(qū)，進行改造后組建一系列具有不同特點的載體分子。λ載體系統(tǒng)最適用于構建真核生物基因文庫和cDNA庫。M13噬菌體是一種獨特的載體系統(tǒng)，它只能侵襲具有F基因的大腸桿菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌內(nèi)是雙鏈環(huán)狀分子，象質(zhì)粒一樣自主制復，制備方法同質(zhì)粒。寄主菌可分泌含單鏈DNA的M13噬菌體，又能方便地制備單鏈DNA，用于DNA順序分析、定點突變和核酸雜交。③拷斯(Cos)質(zhì)粒：是一類帶有噬菌體DNA粘性末端順序的質(zhì)粒DNA分子。是噬菌體－質(zhì)粒混合物。此類載體分子容量大，可攜帶45kb的外源DNA片段。也能象一般質(zhì)粒一樣攜帶小片段DNA，直接轉化寄主菌。這類載體常被用來構建高等生物基因文庫。DNA片段與載體連接DNA分子與載體分子連接是克隆過程中的重要環(huán)節(jié)之一，方法有：①粘性末端連接，DNA片段兩端的互補堿基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內(nèi)切酶消化DNA可產(chǎn)生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復原樣，有些限制性內(nèi)切酶雖然識別不同順序，卻能產(chǎn)生相同末端。②平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產(chǎn)生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端連接。④人工接頭分子連接，在平頭DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性內(nèi)切酶識別位點的寡核苷酸片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶作用后就會產(chǎn)生粘性末端。連接反應需注意載體DNA與DNA片段的比率。以λ或Cos質(zhì)粒為載體時，形成線性多連體DNA分子，載體與DNA片段的比率高些為佳。以質(zhì)粒為載體時，形成環(huán)狀分子，比率常為1∶1。引入寄主細胞常用兩種方法：①轉化或轉染，方法是將重組質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA(M13)與氯化鈣處理過的宿主細胞混合置于冰上，待DNA被吸收后鋪在平板培養(yǎng)基上，再根據(jù)實驗設計使用選擇性培養(yǎng)基篩選重組子，通常重組分子的轉化效率比非重組DNA低，原因是連接效率不高，有許多DNA分子無轉化能力，而且重組后的DNA分子比原載體DNA分子大，轉化困難。②轉導，病毒類侵染宿主菌的過程稱為轉導，一般轉導的效率比轉化高?？寺〉倪x擇①直接篩選：有些載體帶有可辨認的遺傳標記，能有效地將重組分子與本底區(qū)分。例如：有些λ噬菌體攜帶外源基因后形成的噬菌斑就會從原來的混濁變?yōu)榍辶?；還有些載體分子攜帶外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯變化，如藍色變?yōu)闊o色；有些λ噬菌體能侵染甲菌而不能侵染乙菌，攜帶外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌釋放的噬菌體均為重組分子。②間接篩選：有引起載體分子帶有一個或多個抗藥性標記基因，當外源DNA插入到抗藥基因區(qū)后，基因失活，抗性消失。如一質(zhì)粒有A和B兩個抗藥性基因，當外源基因插入到B基因區(qū)后，便只抗A藥而不抗B藥。因此能在A藥培養(yǎng)基上正常生長而不能在B藥培養(yǎng)上生長的便是重組分子。③核酸雜交：廣泛用于篩選含有特異DNA順序的克隆。方法是將菌落或噬菌斑“印跡”到硝酸纖維膜等支持物上，變性后固定在原位，然后與標記的核酸探針進行雜交。陽性點的位置就是所需要的克隆。④免疫學方法：如果重組克隆能在宿主菌中表達，就可以用特異的蛋白質(zhì)抗體為探針，進行原位雜交，選擇特異的克隆。分子克隆技術(質(zhì)粒DNA和DNA插入片段的制備、連接反應以及重組質(zhì)粒的轉化)分子克?。∕olecularCloning）是指由一個祖先分子復制生成的和祖先分子完全相同的分子群，發(fā)生在基因水平上的分子克隆稱基因克?。―NA克?。?。（一）質(zhì)粒DNA的制備（二）DNA插入片段的制備1、逆轉錄反應2、DNA聚合酶鏈式反應（PCR）（三）連接反應（四）重組質(zhì)粒的轉化關鍵詞：分子克隆質(zhì)粒DNADNA插入片段連接反應重組質(zhì)粒轉化克隆（Clone）是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。分子克隆（MolecularCloning）是指由一個祖先分子復制生成的和祖先分子完全相同的分子群，發(fā)生在基因水平上的分子克隆稱基因克?。―NA克?。?。其基本原理是：將編碼某一多肽或蛋白質(zhì)的基因（外源基因）組裝到細菌質(zhì)粒（質(zhì)粒是細菌染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子）中，再將這種質(zhì)粒（重組質(zhì)粒）轉入大腸桿菌體內(nèi)，這樣重組質(zhì)粒就隨大腸桿菌的增殖而復制，從而表達出外源基因編碼的相應多肽或蛋白質(zhì)。由于質(zhì)粒具有不相容性，即同一類群的不同質(zhì)粒常不能在同一菌株內(nèi)穩(wěn)定共存，當細胞分裂時就會分別進入到不同的子代細胞中，所以來源于一個菌株的質(zhì)粒是一個分子克隆，而隨質(zhì)粒復制出的外源基因也就是一個分子克隆。（一）質(zhì)粒DNA的制備質(zhì)粒是存在于細菌染色體外的能獨立復制的雙鏈閉環(huán)DNA分子，它能賦予細菌（宿主細胞）某些特定的遺傳表型。質(zhì)粒并非細菌生長所必需，但由于其編碼一些對宿主細菌有利的酶類，從而使宿主細菌具有抵抗不利自身生長的因素如抗藥性等的能力。目前發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒主要分為F質(zhì)粒（性質(zhì)粒），R質(zhì)粒（抗藥性質(zhì)粒），質(zhì)粒（大腸桿菌腸毒素質(zhì)粒）。根據(jù)質(zhì)粒在一個細胞周期內(nèi)產(chǎn)生拷貝的數(shù)量，可將質(zhì)粒分為嚴緊型（低拷貝，復制1-2次）和松弛型（高拷貝，復制10-200次）。由于質(zhì)粒的不相容性細菌經(jīng)分裂后就只留下了拷貝數(shù)較高的一種質(zhì)粒，例如R1和R2兩種抗藥性質(zhì)粒同屬于一類，由于不相容性使它們不能共存于同一細菌中，但不同類群的質(zhì)?？梢栽谝粋€細菌中共存。質(zhì)粒存在于細菌中，所以制備質(zhì)粒DNA時，首先應將含有質(zhì)粒的細菌在含有相應抗生素的液體培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期,使質(zhì)粒在細菌中得到擴增。通過離心收集細菌，經(jīng)堿裂解細菌，使質(zhì)粒和細菌染色體DNA變性，然后再加中和液，使溶液PH值恢復到中性，這樣質(zhì)粒DNA又可以復性至天然雙鏈構象狀態(tài)，而細菌染色體DNA不能或很難復性所以仍處在變性狀態(tài)，這些變性的染色體DNA與變性蛋白質(zhì)纏繞在一起，易被離心去處，而質(zhì)粒DNA仍存在于水相中，再用無水乙醇沉質(zhì)粒DNA，最后經(jīng)離心即可得到質(zhì)粒DNA。（二）DNA插入片段的制備DNA插入片段是指我們所要研究或應用的基因，也就是將要克隆或表達的基因。獲得DNA插入片段是分子克隆過程中的第一步。目前有幾種方法，如限制性內(nèi)切酶直接分離法、文庫篩選法、體外擴增法、人工合成法等，下面以逆轉錄-DNA聚合酶鏈式反應為例介紹獲得外源基因DNA插入片段的方法。1、逆轉錄反應所謂逆轉錄，就是以mRNA為模板合成一條互補DNA鏈(即cDNA)的過程，在逆轉錄反應中所用的是逆轉錄酶，即以RNA為模板的DNA聚合酶，它也具有5′-3′DNA聚合酶活性，在合成新的核苷酸鏈時也需要引物。由于真核基因組DNA由內(nèi)含子和外顯子組成，內(nèi)含子不編碼蛋白質(zhì)，因此體外擴增基因組DNA會給某些研究造成困難，以mRNA為模板的基因擴增可避免這種問題的發(fā)生，因此從某種意義上來說，逆轉錄反應更具實用性。制備cDNA時，首先要從細胞中提取mRNA，以mRNA為模板，在mRNA的poly(A)尾上結合12-18個寡聚（dT）片段作為合成的起始引物，在逆轉錄酶的作用下合成第一條cDNA鏈。然后用RNA酶消化DNA-RNA雜交鏈中的RNA，剩下的單鏈DNA的3′端往往有自發(fā)回折形成的發(fā)夾結構，正好可以作為合成第二條DNA鏈的引物。第二條DNA鏈的合成可以用DNA聚合酶Ⅰ，也可以用逆轉錄酶。雙鏈DNA合成后，用S1核酸酶切去發(fā)夾結構，即獲得平端的雙鏈cDNA。2、DNA聚合酶鏈式反應（PCR）PCR技術是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核酸存在下，DNA聚合酶催化的一種體外酶促反應。PCR技術的特異性取決于引物和模板DNA結合的特異性。反應由三個步驟組成：1、變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈DNA解離成單鏈DNA；2、退火：當溫度突然降低時，使含量遠遠多于模板DNA的引物與模板DNA在局部形成雜交雙鏈；3、延伸：在4種dNTP底物和Mg2+存在的條件下，DNA聚合酶由5'-3'方向合成新的與模板DNA互補的DNA鏈。以上反應為一個循環(huán)，通常進行25-30個循環(huán)，由此介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到大量復制，數(shù)量可達2×107-8拷貝。PCR引物決定PCR的特異性，引物的設計就顯得尤為重要。下面以已知DNA序列設計引物為例介紹設計引物應考慮的幾個方面：1、GC比值：眾所周知,堿基對中的GC之間有三條氫鍵，AT之間有兩條氫鍵，GC和AT在引物序列中的合理比例是設定PCR中退火溫度的重要依據(jù)。通常在一個引物中GC和AT各半即可。2、長度：通常15-20bp即可。由于目的不同，有時引物長些，但太短會影響引物的特異性。3、方向：設計出的引物永遠是5'-3'方向,所以正向引物是與一股模板DNA序列相一致的，而反向引物則與這股模板DNA序列相互補。4、酶切位點：如果想克隆所放大的DNA片段，通常在引物的5'端設計適當?shù)南拗菩悦盖形稽c，使進一步的克隆工作更容易。一對引物可用一種或兩種酶切位點，這取決于設計者，兩種不同的酶切位點使克隆具有方向性。5、啟始和終止密碼：如果想表達所放大的DNA片段，所用的克隆載體又不含啟始密碼和終止密碼，應將其設計在引物的酶切位點之后，特異性DNA序列之前。6、其它：如果表達的融合蛋白用親合層析方法純化，可將必要的序列設計在引物中以使所表達的融合蛋白易于純化。（三）連接反應將載體質(zhì)粒DNA和外源基因DNA在DNA連接酶的作用下，雙鏈DNA片段相鄰的5'端磷酸與3'端羥基之間形成磷酸二酯鍵，形成重組質(zhì)粒，這是分子克隆技術的核心步驟。在連接反應進行之前，質(zhì)粒和外源基因DNA分別用同樣的限制性內(nèi)切酶消化，使它們成為含有同樣粘性末端或鈍端的線性DNA，這是連接成功的先決條件。下面介紹連接反應的程序。1、模板DNA的準備在進行DNA重組以前，通常要先將DNA分子用限制性內(nèi)切酶消化，使兩種DNA分子的末端產(chǎn)生相同的粘性末端或平齊末端。通常按下列比例進行：1.雙蒸溜水適量2.10×酶緩沖液1/10容量3.DNA多少μl4.限制性內(nèi)切酶1/10容量（每微克DNA用1-10單位）總容量（根據(jù)DNA分子量來確定，通常10-100μl）?；旌虾?7℃溫育30-120min。2、連接反應在DNA連接酶的作用下，將外源基因DNA片段和線性質(zhì)粒DNA連接起來構成重組質(zhì)粒的過程。通常按下列比例進行：1.雙蒸溜水適量2.10×酶緩沖液1/10容量3.質(zhì)粒DNA適量4.DNA插入片段適量5.限制性內(nèi)切酶1/10容量(每微克DNA用1-10單位)總容量（根據(jù)DNA分子量來確定，通常10-20μl）。混合后置14-16℃水浴6-12小時。[注意]通常DNA插入片段的量是載體DNA的3倍，這需根據(jù)DNA分子量計算，而不取決于濃度。（四）重組質(zhì)粒的轉化DNA插入片段和質(zhì)粒DNA在體外連接形成重組質(zhì)粒后，需要被導入到細胞內(nèi)才能進行擴增和表達。接受重組DNA分子的細胞稱作受體細胞或宿主細胞。受體細胞分為原核細胞（如大腸桿菌）和真核細胞（如酵母、哺乳動物細胞及昆蟲細胞）。原核細胞即可作為基因復制擴增的場所，也可作為基因表達的場所；真核細胞一般