實驗三、細胞中酸性磷酸酶的定位課件

實驗三、細胞中酸性磷酸酶的定位

一、實驗?zāi)康?.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作步驟。2.觀察酸性磷酸酶在細胞中的分布。二、實驗原理

酸性磷酸酶（ACP）是溶酶體的特征性酶，主要存在于巨噬細胞,定位于溶酶體內(nèi)。正常條件下,巨噬細胞處于休止狀態(tài),酶活性很低。但在合適的pH條件下，經(jīng)過活化，其形態(tài)、代謝和功能上表現(xiàn)出一系列顯著的變化，如膜活性增高和酸性磷酸酶活性增強，從而改變其滲透性底物可以滲入,酶活力被顯示。三、實驗材料、試劑和儀器1.材料

小白鼠2.試劑1)甲醛鈣固定液：甲醛10ml,10%氯化鈣10ml,蒸餾水80毫升。2)酸性磷酸酶作用液:稱取硝酸鉛25mg,加0.05mol/L乙酸緩沖液22.5ml,攪動使之全部溶解后,再緩慢地滴加3%β-甘油磷酸鈉液2.5ml,邊加邊攪動防止產(chǎn)生沉淀,總量25ml.(現(xiàn)配制,不能儲存)。3)2％硫化銨溶液：硫酸銨2毫升＋98毫升水。4)0.05mol／L乙酸緩沖液。A液（0.2mol/L乙酸液）：冰醋酸1.2ml加蒸餾水100ml。

B液（0.2mol/L乙酸鈉液）：NaAc.3H2O2.72g加蒸餾水至１00毫升。取A液３０毫升＋B液70毫升＋蒸餾水300毫升。6)6%淀粉肉湯:牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g,NaCl0.5g,可溶性淀粉６.0g，蒸餾水１00ml，煮沸滅菌，４℃保存，使用時熱水浴融化。

3.儀器、用具：注射器、恒溫水箱、顯微鏡、擦鏡紙、

解剖盤、解剖剪、蓋玻片、吸水紙。四、實驗方法與步驟１.前處理

（１）小白鼠每日腹腔注射６％淀粉肉湯１ml，連續(xù)注射３天．

（２）在第３－４天,再向腹腔注射１ml生理鹽水，過３～５min用頸椎脫臼法處死小鼠，剖開腹腔，把內(nèi)臟推向一側(cè)，用不帶針頭的注射器或吸管吸取腹腔液．２.制片1.將腹腔液滴一滴于冰凍的干凈載玻片上，涂開，自然干燥。2.放入作用液中，37℃保溫30min。3.蒸餾水漂洗片刻。4.放入甲醛鈣固定液中固定5min。5.蒸餾水漂洗片刻。6.放入2%硫化銨液3-5min。7.蒸餾水漂洗,鏡檢。3.對照實驗:

標本放入作用液前先用高溫（50℃）處理30min,使酶失去活性，做好標記，其它步驟同上3-7步。2.腹腔注射1.小鼠腹腔注射可以用5ml的注射器，配合5.5～7號針頭。

2.腹腔注射時右手持注射器，左手的小指和無名指抓住小鼠的尾巴，另外三個手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下。這樣腹腔中的器官就會自然倒向胸部，防止注射器刺入時損傷大腸、小腸等器官。進針的動作要輕柔，防止刺傷腹部器官。

3.尤其是對于體重較小的小鼠，腹腔注射時針頭可以在腹部皮下穿行一小段距離，最好是從腹部一側(cè)進針，穿過腹中線后在腹部的另一側(cè)進入腹腔。

3.小鼠的處死脊柱脫臼法用左手拇指和食指捏住小白鼠頭的后部，并用力下壓，右手抓住鼠尾，用力向后上方拉，即可使頸椎脫臼，瞬間死亡。皮膚和腹膜要分別剪開，并確保皮膚血液不流入腹腔。腹腔內(nèi)的沖洗液要全部吸干。七、相關(guān)理論知識巨噬細胞（MΦ）發(fā)育：骨髓多能干細胞→定向干細胞（髓樣干細胞）→單核母細胞→前體單核細胞→單核細胞→血液→組織（分化為巨噬細胞）MΦ分布：單核細胞主要于血液中，巨噬細胞幾乎存在于所有表皮和黏膜下組織。MΦ形態(tài)：有偽足，馬蹄狀單核，細胞形體大。MΦ分離純化：小鼠和大鼠腹腔內(nèi)有豐富的巨噬細胞，可用腹腔清洗的方法獲得較多細胞懸液。正常小鼠每只可收集腹腔滲出細胞106，其中30%為巨噬細胞，如果給小鼠腹腔注射某種刺激物，可使巨噬細胞滲出增加，易于分離更多的巨噬細胞。

2.巨噬細胞的特性

組織中的巨噬細胞則呈顯著的多形性，在培養(yǎng)條件下對塑料或玻璃表面具有極強的粘附性，一次可利用這一特性分離巨噬細胞并與非粘附性細胞分開，但其作用機制不詳。巨噬細胞在體內(nèi)可借其表面粘附分子與其它細胞或細胞外基質(zhì)黏附在一起。

巨噬細胞的另一特性是對異物通過不同機制具有吞噬作用（phagocytosis）,吞飲（endocytosis）或胞飲作用（pinocytosis）?？蓪愇锿倘氚麅?nèi)，并借其胞漿內(nèi)的大量液泡及顆粒中的內(nèi)含物和代謝產(chǎn)