單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)文本（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)）

GB4789.30-201XPAGE16食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的定性檢驗(yàn)；第二法適用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù)；第三法適用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌含量較低而雜菌含量較高的食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的計(jì)數(shù)。設(shè)備和材料注:除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1冰箱：2℃～5℃。2.2恒溫培養(yǎng)箱：30℃±1℃、36℃±1℃、20℃±1℃。2.3均質(zhì)器。2.4顯微鏡：10倍～100倍。2.5電子天平：感量0.1g。2.6錐形瓶：100mL、500mL。2.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。2.8無菌平皿：直徑90mm。2.9無菌試管：16mm×160mm。2.10離心管：30mm×100mm。2.11無菌注射器：1mL。2.12單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ListeriamonocytogenesATCC19111或CMCC54004）、英諾克李斯特氏菌（ListeriainnocuaATCC33090）、伊氏李斯特氏菌（ListeriaivanoviiATCC19119）、斯氏李斯特氏菌（ListeriaseeligeriATCC35967）或具相同效果的標(biāo)準(zhǔn)株。2.13金黃色葡萄球菌（StaphylococcusaureusATCC25923或其他產(chǎn)β-溶血環(huán)金葡菌）。2.14馬紅球菌（RhodococcusequiATCC6939或NCTC1621）。2.15小白鼠：ICR體重18g～22g。2.16全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。3培養(yǎng)基和試劑3.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）：見附錄A中A.1。3.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）：見附錄A中A.2。3.3李氏增菌肉湯LB（LB1，LB2）：見附錄A中A.3。3.41%鹽酸吖啶黃（acriflavineHCl）溶液：見附錄A中A.3.2.1、A.3.2.2。3.51%萘啶酮酸鈉鹽（naladixicacid）溶液：見附錄A中A.3.2.1、A.3.2.2。3.6PALCAM瓊脂：見附錄A中A.4。3.7ALOA（AgarListeriaaccordingtoOttavianiandAgosti）瓊脂：見附錄A中A.5。3.8革蘭氏染液：見附錄A中A.6。3.9SIM動力培養(yǎng)基：見附錄A中A.7。3.10緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅（MR）和V-P試驗(yàn)用]：見附錄A中A.8。3.115%～8%羊血瓊脂：見附錄A中A.9。3.12糖發(fā)酵管：見附錄A中A.10。3.13過氧化氫試劑：見附錄A中A.11。3.14李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基。3.15生化鑒定試劑盒或全自動微生物鑒定系統(tǒng)。3.16緩沖蛋白凍水：見附錄A中A.12

第一法單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)4.檢驗(yàn)程序單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序見圖1。3030℃±1℃，24h±2h30℃±1℃，24h±2h檢樣25g（mL）樣品+LB1增菌液225mL，均質(zhì)0.1mL+10mLLB2增菌液接種木糖、鼠李糖，36℃±1℃，24h±2h；同時(shí)于TSA-YE平板劃線純化，30℃±1℃，24h～48h木糖－，鼠李糖＋鑒定結(jié)果報(bào)告36℃±1℃，24h～48h李斯特顯色（或ALOA）平板PALCAM平板ALOA圖1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗(yàn)程序5操作步驟5.1增菌以無菌操作取樣品25g（mL）加入到含有225mLLB1增菌液的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min～2min；或放入盛有225mLLB1增菌液的均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min。于30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，移取0.1mL，轉(zhuǎn)種于10mLLB2增菌液內(nèi)，于30℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。5.2分離取LB2二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色（或ALOA）平板和PALCAM瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，觀察各個(gè)平板上生長的菌落。典型菌落在ALOA瓊脂平板上為藍(lán)綠色菌落周圍有不透明暈圈；在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；在李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征，參照產(chǎn)品說明進(jìn)行判定。注：ALOA平板上的典型菌落為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌或伊氏李斯特氏菌；如果ALOA平板上菌落不典型，可繼續(xù)培養(yǎng)48h，再觀察。部分菌株不產(chǎn)生透明暈圈。5.3初篩自選擇性瓊脂平板上分別挑取3個(gè)～5個(gè)典型或可疑菌落，在TSA-YE平板上劃線純化，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，分別接種在木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。5.4鑒定5.4.1染色鏡檢：李斯特氏菌為革蘭氏陽性短桿菌，大小為（0.4μm～0.5μm）×（0.5μm～2.0μm）；用生理鹽水制成菌懸液，在油鏡或相差顯微鏡下觀察，該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣的運(yùn)動。5.4.2動力試驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落穿刺半固體或SIM動力培養(yǎng)基，于25℃～30℃培養(yǎng)48h，李斯特氏菌有動力，在半固體或SIM培養(yǎng)基上方呈傘狀生長，如傘狀生長不明顯，可繼續(xù)培養(yǎng)5d，再觀察結(jié)果。5.4.3生化鑒定：挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)，過氧化氫酶陽性反應(yīng)的菌落繼續(xù)進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)和MR-VP試驗(yàn)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見表1。5.4.4溶血試驗(yàn)：將新鮮的羊血瓊脂平板底面劃分為20個(gè)～25個(gè)小格，挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落刺種到血平板上，每格刺種一個(gè)菌落，并刺種陽性對照菌（單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌）和陰性對照菌（英諾克李斯特氏菌），穿刺時(shí)盡量接近底部，但不要觸到底面，同時(shí)避免瓊脂破裂，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，于明亮處觀察，單增李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈，斯氏李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周圍產(chǎn)生弱的透明溶血圈，英諾克李斯特氏菌無溶血圈，伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的β-溶血區(qū)域，若結(jié)果不明顯，可置4℃冰箱24h～48h再觀察。注：也可用劃線接種法。5.4.5協(xié)同溶血試驗(yàn)cAMP（可選項(xiàng)目）：在羊血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌，挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落垂直劃線接種于平行線之間，垂直線兩端不要觸及平行線，距離1mm～2mm，同時(shí)接種單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌，于36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現(xiàn)約2mm的β-溶血增強(qiáng)區(qū)域，斯氏李斯特氏菌也出現(xiàn)微弱的溶血增強(qiáng)區(qū)域，伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現(xiàn)約5mm～10mm的“箭頭狀”β-溶血增強(qiáng)區(qū)域，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。若結(jié)果不明顯，可置4℃冰箱24h～48h再觀察。5.5可選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物鑒定系統(tǒng)等對木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。表1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化特征與其他李斯特氏菌的區(qū)別菌種溶血反應(yīng)葡萄糖麥芽糖MR-VP甘露醇鼠李糖木糖七葉苷單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes）＋＋＋＋/＋－＋－＋格氏李斯特氏菌（L.grayi）－＋＋＋/＋＋－－＋斯氏李斯特氏菌（L.seeligeri）＋＋＋＋/＋－－＋＋威氏李斯特氏菌（L.welshimeri）－＋＋＋/＋－V＋＋伊氏李斯特氏菌（L.ivanovii）＋＋＋＋/＋－－＋＋英諾克李斯特氏菌（L.innocua）－＋＋＋/＋－V－＋注：＋陽性；－陰性；V反應(yīng)不定。5.6小鼠毒力試驗(yàn)（可選項(xiàng)目）將符合上述特性的純培養(yǎng)物接種于TSB-YE中，于36℃±1℃培養(yǎng)24h，4000r/min離心5min，棄上清液，用無菌生理鹽水制備成濃度為1010CFU/mL的菌懸液，取此菌懸液對3只～5只小鼠進(jìn)行腹腔注射，每只0.5mL，同時(shí)觀察小鼠死亡情況。接種致病株的小鼠于2d～5d內(nèi)死亡。試驗(yàn)設(shè)單增李斯特氏菌致病株和滅菌生理鹽水對照組。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌對小鼠有致病性。5.7結(jié)果與報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)的結(jié)果，報(bào)告25g（mL）樣品中檢出或未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。第二法單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法6.檢驗(yàn)程序單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)程序見圖2。25g（mL）樣品+25g（mL）樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋計(jì)數(shù)及確證試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告36℃±1℃，24h～48h選擇2個(gè)～3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種李斯特氏菌顯色平板或ALOA平板圖2單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)程序7操作步驟7.1樣品的稀釋7.1.1以無菌操作稱取樣品25g（mL），放入盛有225mL緩沖蛋白胨水或無添加劑的LB肉湯的無菌均質(zhì)袋內(nèi)（或均質(zhì)杯）內(nèi)，連續(xù)均質(zhì)1min～2min或以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min。液體樣品，振蕩混勻，制成1:10的樣品勻液。7.1.2用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL緩沖蛋白胨水或無添加劑的LB肉湯的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。7.1.3按7.1.2操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。7.2樣品的接種根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），每個(gè)稀釋度的樣品勻液分別吸取1mL以0.3mL、0.3mL、0.4mL的接種量分別加入3塊李斯特氏菌顯色（或ALOA）平板中，用無菌L棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如瓊脂平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。7.3培養(yǎng)7.3.1在通常情況下，涂布后，將平板靜置10min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱36℃±1℃培養(yǎng)1h；等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h。7.4典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)7.4.1單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在ALOA平板上為藍(lán)綠色菌落，周圍有不透明暈圈；在其他李斯特氏菌顯色平板上的菌落特征以產(chǎn)品說明為準(zhǔn)。7.4.2選擇有典型單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落的平板，且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在15CFU～150CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。如果：a）只有一個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；b）所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于15CFU且有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)最低稀釋度平板上的典型菌落；c）某一稀釋度的平板菌落數(shù)大于150CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；d）所有稀釋度的平板菌落數(shù)大于150CFU且有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)最高稀釋度平板上的典型菌落；e）所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在15CFU～150CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于15CFU或大于150CFU時(shí)，應(yīng)計(jì)數(shù)最接近15CFU或150CFU的稀釋度平板上的典型菌落。以上按公式（1）計(jì)算。f）2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在15CFU～150CFU之間，按公式（2）計(jì)算。7.4.3從典型菌落中任選5個(gè)菌落（小于5個(gè)全選），分別按5.3、5.4或5.5進(jìn)行鑒定和確認(rèn)試驗(yàn)。8.結(jié)果計(jì)數(shù)公式（1）：…………………（1）式中：T——樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù)；A——某一稀釋度典型菌落的總數(shù)；B——某一稀釋度確證為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù)；C——某一稀釋度用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌確證試驗(yàn)的菌落數(shù)；d——稀釋因子。公式（2）：………..……………（2）式中：T——樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌落數(shù)；A1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù)；A2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）典型菌落的總數(shù)；B1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）確證為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù)；B2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）確證為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌落數(shù)；C1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌確證試驗(yàn)的菌落數(shù)；C2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌確證試驗(yàn)的菌落數(shù)；1.1——計(jì)算系數(shù)；d——稀釋因子（第一稀釋度）。9.結(jié)果報(bào)告報(bào)告每g（mL）樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌菌數(shù)，以CFU/g（mL）表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。

第三法單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)法10檢驗(yàn)程序單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序見圖3。LB2LB2檢樣檢樣25g（mL）樣品+225mLLB1，均質(zhì)10倍系列稀釋選取3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液，各吸取1mL，分別接種于3管選取3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液，各吸取1mL，分別接種于3管LB1肉湯30℃30℃±1℃，24h±2h每管各每管各移取0.1mL，轉(zhuǎn)種于10mLLB230℃30℃±1℃，24h±2h接種李斯特氏菌顯色（或ALOA）平板接種李斯特氏菌顯色（或ALOA）平板36℃36℃±1℃，24h～48h確證實(shí)驗(yàn)確證實(shí)驗(yàn)查MPN表查MPN表結(jié)果報(bào)告結(jié)果報(bào)告圖3單核細(xì)胞增生李斯特氏菌MPN計(jì)數(shù)程序11．操作步驟11.1樣品的稀釋按7.1進(jìn)行。11.2接種和培養(yǎng)11.2.1根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，選取3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），接種于10mLLB1肉湯，每一稀釋度接種3管，每管接種1mL（如果接種量需要超過1mL，則用雙料LB1增菌液）于30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。每管各移取0.1mL，轉(zhuǎn)種于10mLLB2增菌液內(nèi)，于30℃±1℃培養(yǎng)24±2h。11.2.2用接種環(huán)從各管中移取1環(huán)，分別接種李斯特氏菌顯色（或ALOA）平板，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h。11.3確證試驗(yàn)自每塊平板上挑取5個(gè)典型菌落（5個(gè)以下全選），按照5.3、5.4或5.5進(jìn)行鑒定。12結(jié)果與報(bào)告根據(jù)證實(shí)為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽性的試管管數(shù)，查MPN檢索表（見附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的最可能數(shù)，以MPN/g（mL）表示。

附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑A.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）A.1.1成分胰胨17.0g多價(jià)胨3.0g酵母膏6.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g蒸餾水1000mLpH7.2～7.4A.1.2制法將上述各成分加熱攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。A.2含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）A.2.1成分胰胨17.0g多價(jià)胨3.0g酵母膏6.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g瓊脂15.0g蒸餾水1000mLpH7.2～7.4A.2.2制法將上述各成分加熱攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。A.3李氏增菌肉湯（LB1，LB2）A.3.1成分胰胨5.0g多價(jià)胨5.0g酵母膏5.0g氯化鈉20.0g磷酸二氫鉀1.4g磷酸氫二鈉12.0g七葉苷1.0g蒸餾水1000mLpH7.2～7.4A.3.2制法將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。A.3.2.1李氏Ⅰ液（LB1）225mL中加入：1%萘啶酮酸（用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制）0.5mL1%吖啶黃（用無菌蒸餾水配制）0.3mLA.3.2.2李氏Ⅱ液（LB2）200mL中加入：1%萘啶酮酸0.4mL1%吖啶黃0.5mLA.4PALCAM瓊脂A.4.1成分酵母膏8.0g葡萄糖0.5g七葉甙0.8g檸檬酸鐵銨0.5g甘露醇10.0g酚紅0.1g氯化鋰15.0g酪蛋白胰酶消化物10.0g心胰酶消化物3.0g玉米淀粉1.0g肉胃酶消化物5.0g氯化鈉5.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mLpH7.2～7.4A.4.2制法將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。A.4.2.1PALCAM選擇性添加劑多粘菌素B5.0mg鹽酸吖啶黃2.5mg頭孢他啶10.0mg無菌蒸餾水500mLA.4.2.2制法將PALCAM基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶化后冷卻到50℃，加入2mlPALCAM選擇性添加劑，混勻后傾倒在無菌的平皿中，備用。A.5ALOA（AgarListeriaaccordingtoOttavianiandAgosti（ALOA）瓊脂A.5.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基A.5.1.1成分動物組織的酶消化物18g酪蛋白胰酶消化物6g酵母提取物10g丙酮酸鈉2g葡萄糖2g甘油磷酸鎂1g無水硫酸鎂0.5g氯化鈉5g氯化鋰10g無水磷酸氫鈉2.5g5-溴-4-氯-3吲哚-β-D吡喃葡萄糖苷0.05g瓊脂12g～18g（a）蒸餾水930ml（b）a按瓊脂強(qiáng)度確定b如果用兩性霉素B為925ml蒸餾水（見A.5.5.2）.A.5.1.2制法上述成分進(jìn)行加熱溶解，調(diào)pH值7.2±0.2，121°C高壓滅菌15min。A.5.2萘啶酮酸溶液萘啶酮酸鈉鹽0.02g0.05mol/l的氫氧化鈉5ml溶解萘啶酮酸鈉于5ml氫氧化鈉溶液中，通過0.45μm膜過濾，4°C保存?zhèn)溆?。A.5.3頭孢他啶溶液頭孢他啶0.02g無菌蒸餾水5ml溶解頭孢他啶于5ml無菌蒸餾水中，通過0.45μm膜過濾，4°C保存?zhèn)溆?。A.5.4多粘菌素B多粘菌素B硫酸鹽76700IU無菌蒸餾水5ml溶解多粘菌素B于5ml無菌蒸餾水中，通過0.45μm膜過濾，4°C保存?zhèn)溆?。A.5.5抗生素添加劑A.5.5.1放線菌酮溶液放線菌酮0.05g乙醇2.5ml無菌蒸餾水2.5ml溶解放線菌酮于2.5ml乙醇溶液中，然后加入2.5ml的無菌蒸餾水混勻。通過0.45μm膜過濾，4°C保存?zhèn)溆?。A.5.5.2兩性霉素B溶液（可以替代放線菌酮溶液）兩性霉素B0.01g1mol/l鹽酸（HCl（1mol/l））2.5ml二甲基甲酰胺（DMF））7.5ml溶解兩性霉素在鹽酸/二甲基甲酰胺溶液中，通過0.45μm膜過濾，4°C保存?zhèn)溆谩Ｗ⒁恹}酸/二甲基甲酰胺溶液有毒，小心使用。A.5.6補(bǔ)充劑溶解2gL-α-磷脂酰肌醇于50ml蒸餾水中，攪拌30min制成均勻懸浮液。121°C高壓滅菌15min。冷卻至48°C～50°C，4°C保存?zhèn)溆?。A.5.7完全培養(yǎng)基A.5.7.1成分基礎(chǔ)培養(yǎng)基930ml（a）萘啶酮酸鈉溶液5ml頭孢他啶溶液5ml多粘菌素B溶液5ml放線菌酮溶液5ml或兩性霉素B溶液10ml補(bǔ)充劑50mla如果使用兩性霉素B溶液就需要925mlA.5.7.2制法將基礎(chǔ)培養(yǎng)基完全溶解，冷卻到50℃，加入上述各種溶液，混勻后傾倒在無菌的平皿中，備用。完全培養(yǎng)基的pH值應(yīng)為7.2±0.2。A.6革蘭氏染色液A6.1結(jié)晶紫染色液A.6.1.1成分結(jié)晶紫1.0g95％乙醇20.0mL1％草酸銨水溶液80.0mLA6.1.2制法將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。A6.2革蘭氏碘液A.6.2.1成分碘1.0g碘化鉀2.0g蒸餾水300mLA.6.2.2制法將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。A.6.3沙黃復(fù)染液A.6.3.1成分沙黃0.25g95％乙醇10.0mL蒸餾水90.0mLA.6.3.2制法將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。A.6.4染色法A.6.4.1涂片用火焰固定后滴加結(jié)晶紫染液，作用1min，水洗。A.6.4.2滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。A.6.4.3滴加95％乙醇脫色，約15s～30s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。A.6.4.4滴加復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。A.7SIM動力培養(yǎng)基A7.1成分胰胨20.0g多價(jià)胨6.0g硫酸鐵銨0.2g硫代硫酸鈉0.2g瓊脂3.5g蒸餾水1000mLpH7.2A.7.2制法將上述各成分加熱混勻，調(diào)節(jié)pH，分裝小試管，121℃高壓滅菌15min，備用。A.7.3試驗(yàn)方法挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落穿刺接種到SIM培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)24h～48h，觀察結(jié)果。A.8緩沖葡萄糖蛋白胨水（MR和VP試驗(yàn)用）A.8.1成分多胨7.0g葡萄糖5.0g磷酸氫二鉀5.0g蒸餾水1000mLpH7.0成分A.8.2制法溶化后調(diào)節(jié)pH，分裝試管，每管1mL，121℃高壓滅菌15min，備用。A.8.3甲基紅（MR）試驗(yàn)A.8.3.1甲基紅試劑A.8.3.1.1成分甲基紅10mg95%乙醇30mL蒸餾水20mLA.8.3.1.2制法10mg甲基紅溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸餾水。A.8.3.1.3試驗(yàn)方法取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白凍水中，36℃±1℃培養(yǎng)2d～5d。滴加甲基紅試劑一滴，立即觀察結(jié)果。鮮紅色為陽性，黃色為陰性。A.8.4V-P試驗(yàn)A.8.4.16%α-萘酚-乙醇溶液成分及制法：取α-萘酚6.0g，加無水乙醇溶解，定容至100mL。A.8.4.240%氫氧化鉀溶液成分及制法：取氫氧化鉀40g，加蒸餾水溶解，定容至100mL。A.8.4.3試驗(yàn)方法取適量瓊脂培養(yǎng)物接種于緩沖葡萄糖蛋白凍水中，36℃±1℃培養(yǎng)2d～4d。加入6%α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氫氧化鉀溶液0.2mL，充分振搖試管，觀察結(jié)果。陽性反應(yīng)立刻或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色，如為陰性，應(yīng)放在36℃±1℃繼續(xù)培養(yǎng)1h再進(jìn)行觀察。A.9血瓊脂A.9.1成分蛋白胨1.0g

牛肉膏0.3g

氯化鈉0.5g

瓊脂1.5g

蒸餾水100mL脫纖維羊血5mL～8mLA9.2制法除新鮮脫纖維羊血外，加熱溶化上述各組分，121℃高壓滅菌15min，冷到50℃，以無菌操作加入新鮮脫纖維羊血，搖勻，傾注平板。A.10糖發(fā)酵管A.10.1成分牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g氯化鈉3.0g磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）2.0g0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液12.