043項(xiàng)目文章JEV（IF21.224）外泌體內(nèi)容物新發(fā)現(xiàn)lncRNA編碼微蛋白或代表細(xì)胞間通訊的一種全新機(jī)制

項(xiàng)目文章JEV（IF21.224）|外泌體內(nèi)容物新發(fā)現(xiàn)！lncRNA編碼微蛋白或代表細(xì)胞間通訊的一種全新機(jī)制lncRNAs是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)堿基且不編碼蛋白的RNAs轉(zhuǎn)錄本。實(shí)驗(yàn)表明，lncRNAs中的小開放閱讀框可以編碼多肽，即微蛋白。微蛋白在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、代謝和發(fā)育、應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)和DNA修復(fù)等過程中發(fā)揮作用，也會(huì)影響腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程，但微蛋白的作用機(jī)制尚不清楚。2021年7月中科院生物物理所楊福全研究員團(tuán)隊(duì)、陳潤(rùn)生院士團(tuán)隊(duì)及北京三博腦科醫(yī)院張宏偉教授合作在JournalofExtracellularVesicles（IF21.224）雜志上發(fā)表題目為《LncRNA-encodedmicroproteins:Anewformofcargoincellculture-derivedandcirculatingextracellularvesicles》的研究成果，利用蛋白組學(xué)、免疫共沉淀-質(zhì)譜法技術(shù)揭示膠質(zhì)瘤細(xì)胞衍生的外泌體中的微蛋白轉(zhuǎn)移可能代表了細(xì)胞間通訊的新機(jī)制。中科新生命在本次研究中提供了外泌體表征服務(wù)?！狙芯坎牧稀考?xì)胞和人血漿外泌體【實(shí)驗(yàn)分組】蛋白組學(xué)、免疫共沉淀-質(zhì)譜法(CoIP-MS)、RT-PCR和免疫共沉淀

實(shí)驗(yàn)方法步驟1：lncRNA編碼的微蛋白理論數(shù)據(jù)庫構(gòu)建；步驟2：細(xì)胞衍生外泌體的提取和微蛋白鑒定及驗(yàn)證；步驟3：蛋白質(zhì)組學(xué)揭示外泌體中微蛋白的潛在功能；步驟4：血漿外泌體中的微蛋白鑒定及驗(yàn)證。

研究結(jié)果1.lncRNA編碼的微蛋白理論數(shù)據(jù)庫構(gòu)建為在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及衍生的外泌體中鑒定更多的新的微蛋白，作者優(yōu)化了基于質(zhì)譜的微蛋白分析流程，并構(gòu)建了人類理論微蛋白數(shù)據(jù)庫。最近報(bào)道的功能微蛋白都可以在該數(shù)據(jù)庫中找到，驗(yàn)證了該數(shù)據(jù)庫的高質(zhì)量和全面性。圖1lncRNA編碼的微蛋白的鑒定流程2.膠質(zhì)瘤細(xì)胞及其衍生外泌體中的微蛋白鑒定為鑒定膠質(zhì)瘤細(xì)胞及衍生的外泌體中新的微蛋白，作者提取了膠質(zhì)瘤細(xì)胞衍生的外泌體，通過透射電子顯微鏡（TEM）和標(biāo)記蛋白（CD9，CD63，CD81和Alix）的WB實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證外泌體的純度，利用納米顆粒跟蹤分析(NTA)測(cè)定顆粒濃度和粒徑分布。利用TMT標(biāo)記蛋白組技術(shù)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和衍生的外泌體中分別鑒定到了84個(gè)和29個(gè)微蛋白，其中9個(gè)微蛋白是共有的。鑒定的大多數(shù)微蛋白長(zhǎng)度小于100個(gè)氨基酸，最短的20個(gè)氨基酸。鑒定出的微蛋白中，只有不到15%是從AUG密碼子啟始的，32%的微蛋白起始密碼子相近，而大多數(shù)微蛋白的起始密碼子未知。為確定微蛋白的進(jìn)化保守性，作者對(duì)多個(gè)物種基因組進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物中微蛋白有一半以上也存在于嚙齒類動(dòng)物中。圖2膠質(zhì)瘤細(xì)胞及衍生的外泌體微蛋白3.細(xì)胞及衍生的外泌體微蛋白驗(yàn)證為驗(yàn)證編碼微蛋白的lncRNAs在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是否表達(dá)，作者從膠質(zhì)瘤細(xì)胞中提取核糖體，用RT-PCR檢測(cè)單體和多聚體相關(guān)的lncRNAs，發(fā)現(xiàn)8個(gè)測(cè)試的lncRNA都與核糖體相關(guān)，其中7個(gè)與核糖體結(jié)合的lncRNA的含量明顯高于游離的，表明lncRNA處于活躍翻譯的狀態(tài)。為研究微蛋白115127的小開放閱讀框（smORF）是否具有翻譯活性，作者構(gòu)建了融合表達(dá)載體115127-GFP，發(fā)現(xiàn)115127-GFP融合蛋白大量表達(dá)，用WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)115127-GFP融合蛋白大小與預(yù)測(cè)的分子量一致，進(jìn)一步利用質(zhì)譜分析了GFP抗體富集的沉淀蛋白，確證了微蛋白115127的存在，這些結(jié)果表明微蛋白115127的smORF具有翻譯活性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證微蛋白是否能被包裝到外泌體中，作者構(gòu)建了115127-FLAG融合載體，從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中收集外泌體，利用免疫熒光染色和WB檢測(cè)到115127-FLAG融合蛋白大量表達(dá)，115127-FLAG大小與預(yù)測(cè)的分子量一致，這表明微蛋白115127可以被分選到外泌體中。為研究微蛋白115127的潛在功能，作者利用免疫共沉淀-質(zhì)譜法(CoIP-MS)分析115127-GFP的相互作用蛋白，發(fā)現(xiàn)與氧化還原應(yīng)激相關(guān)的蛋白PrDX1、PrDX2、PrDX4及MAPK1和XPO1等顯著上調(diào)，且這些蛋白質(zhì)可以形成PPI網(wǎng)絡(luò)，由此推測(cè)微蛋白115127可能參與了氧化還原應(yīng)激過程。圖3細(xì)胞及衍生的外泌體中微蛋白的驗(yàn)證4.血漿外泌體中微蛋白的鑒定為鑒定人血漿中的微蛋白，作者利用蛋白質(zhì)組學(xué)分別鑒定了三名健康人和三名膠質(zhì)瘤患者血漿外泌體的微蛋白、以及健康人的血漿和無外泌體的血漿微蛋白，發(fā)現(xiàn)健康人血漿外泌體中包含48種微蛋白，高于血漿和無外泌體血漿微蛋白數(shù)量，這可能與外泌體的保護(hù)作用有關(guān)。在膠質(zhì)瘤患者的血漿EVS中發(fā)現(xiàn)64個(gè)微蛋白，大多數(shù)微蛋白的長(zhǎng)度都在100個(gè)氨基酸左右。作者進(jìn)一步使用合成肽對(duì)鑒定到的微蛋白進(jìn)行了靶向蛋白組驗(yàn)證，選擇的13個(gè)微蛋白中有12個(gè)成功匹配，說明微蛋白鑒定的準(zhǔn)確性非常高。利用主成分分析發(fā)現(xiàn)健康人與膠質(zhì)瘤患者明顯分開，表明血漿外泌體中的微蛋白含量存在明顯差異，是潛在的有價(jià)值的標(biāo)志物。圖4血漿外泌體中的微蛋白

小編小結(jié)本研究首次發(fā)現(xiàn)并證明了在細(xì)胞和血漿外泌體中存在豐富的微蛋白，通過免疫共