生物制藥工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)

PAGE17/NUMPAGES17生物制藥工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)生物制藥工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

（12個(gè)實(shí)驗(yàn)，36學(xué)時(shí)）

焦飛

生物技術(shù)教研室

實(shí)驗(yàn)一健胃消食片配方及片劑的制備

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握壓片機(jī)壓片的方法及影響片劑成型的主要因素；

2.學(xué)會片劑處方的調(diào)配。

二、實(shí)驗(yàn)材料和儀器

太子參，陳皮，山藥，麥芽（炒），山楂，蔗糖粉，糊精，硬脂

酸鎂，粉碎機(jī)，干燥箱，制片機(jī)

三、實(shí)驗(yàn)原理

健胃消食片為內(nèi)科傷食類非處方藥品，主治健胃消食，用于

脾胃虛弱，消化不良，脾胃虛弱所致的食積，癥見不思飲食，暖

腐酸臭，脘腹脹痛。健胃消食片的配方如下，太子參228.6g，陳皮22.9g，山藥171.4g，麥芽（炒）171.4g，山楂114.3g，蔗糖糊精適量，值得片劑為淡棕黃色的片或薄薄膜片，氣略香，味微甜，酸。制作方法：太子參半量與山藥粉碎成細(xì)粉，其余陳皮三味藥

及剩余的太子參置于燒杯，加3倍量水，煎煮1小時(shí)，濾過，合并兩次煎液，減壓濃縮至浸膏，干燥。將蔗糖粉糊精和生藥粉以

3：1：1的混合粉與浸膏混合制成軟材，軟材的軟硬應(yīng)適當(dāng)，以“手握成團(tuán)，輕壓則散”為宜。采用擠出制粒的方法制成顆粒，

顆粒在60-80攝氏度干燥，干燥時(shí)應(yīng)逐漸升溫，以免因顆粒表面

干燥過快結(jié)成硬殼而影響內(nèi)部水分的蒸發(fā)。顆粒整粒后加入1％硬脂酸鎂混合后壓片。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1.稱取太子參2

2.8g，陳皮2.3g，山藥17.1g，山藥17.1g，麥芽

17.1g，山楂11.4g

2.太子參山藥用粉碎機(jī)粉成細(xì)粉。

3.將上述藥材放入燒杯中，加入3倍量的水，煎煮半小時(shí)，重復(fù)

兩次，將上清液合并，減壓濃縮至浸膏，將所得浸膏放入烘

箱中80度干燥。

4.將蔗糖粉糊精和干燥后的粉末以3：1：1的比例混合制成顆粒

軟材，將軟材放入烘箱中逐漸升溫干燥。

5.干燥后的軟材加入1％硬脂酸鎂放入壓片機(jī)中壓片。

實(shí)驗(yàn)二溶菌酶結(jié)晶的制備

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握鹽析法提取蛋白質(zhì)的原理和過程；

2.學(xué)會溶菌酶的結(jié)晶和精制方法。

二、實(shí)驗(yàn)材料與儀器

新鮮雞蛋，氯化鈉，1氫氧化鈉溶液，醋酸緩沖液，燒杯，玻璃棒，布氏漏斗，干燥箱。

三、實(shí)驗(yàn)原理

溶菌酶又稱細(xì)胞壁質(zhì)酶或N—乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，是一種國內(nèi)外很緊銷的生化物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床。具有多種藥理作用，能抗感染、消炎、消腫、增強(qiáng)體內(nèi)免疫反應(yīng)等，有抗菌

的作用，常用于五官科多種粘膜炎癥，皮膚帶狀瘡疹等疾病。是

優(yōu)良的天然防腐劑，可用于食品的防腐保鮮。尤其重要的是近年來溶菌酶已成為基因工程及細(xì)胞工程必不可少的工具酶。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

（1）收集雞蛋清將新鮮雞蛋兩端各敲一個(gè)小洞，使蛋清流出（最好是新生的雞蛋、值不得低于8，否則不能使用），按其體積的兩倍量加入水，輕輕攪拌5，使蛋清溶液的稠度均勻，注意在攪拌過程中不能起泡，攪拌不宜過快、攪拌棒應(yīng)光滑等，以防

蛋白質(zhì)變性而影響溶菌酶產(chǎn)品的得率及質(zhì)量，最后用雙層細(xì)紗布濾除蛋清溶液中的臍帶塊及碎蛋殼等。

（2）加入氯化鈉按每100蛋清溶液加入2g.氯化鈉的比例，白蛋清溶液中慢慢加入氯化鈉細(xì)粉，邊加邊攪拌，促使氯化鈉細(xì)粉及時(shí)溶解，以避免局部濃度過高或沉淀于容器底部，否則會引起蛋白質(zhì)的變性而產(chǎn)生大量的白色沉淀。

（3）粗制溶菌酶加完氯化鈉細(xì)粉后，再用1的氫氧化鈉溶液小心地將上述蛋清溶液的值調(diào)節(jié)到10.8。在用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)蛋清溶液值時(shí)，用膠頭滴管將其逐漸滴入并不斷攪拌以免局

部過堿而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性，從而影響溶菌酶的得率和質(zhì)量。為加速溶菌酶的結(jié)晶過程，可再加入適量的溶菌酶結(jié)晶體作為晶種。低溫下靜置數(shù)天，溶菌酶結(jié)晶將慢慢析出，于72~96h達(dá)到最高產(chǎn)率。待結(jié)晶完全后，傾去上清液并用布氏漏斗濾出結(jié)晶，即可

得到粗制的溶菌酶晶體。

（4）精制溶菌酶將制得的粗結(jié)晶用值4.6的醋酸溶解，然后

讓酶液靜置2h，接著過濾除去不溶物，收集濾液并量出體積，

按100濾液加5g氯化鈉的比例加入（加入方法與第二步加入氯

化鈉的方法相同）。然后用1的氫氧化鈉溶液緩慢地將其值調(diào)節(jié)

到10.8后，低溫下靜置結(jié)晶。為加速結(jié)晶過程可向酶液中加入

溶菌酶晶種，待結(jié)晶完全后再傾去上清液，用布氏漏斗過濾可得

溶菌酶結(jié)晶，如純度不夠，可重復(fù)操作提純，直至達(dá)到所需要的

純度為止，結(jié)晶于30~40°:烘干后即得溶菌酶產(chǎn)品。

（5）包裝存貯產(chǎn)品應(yīng)裝于玻璃或陶瓷容器中，置于陰冷處

保存，以免溶菌酶受熱后失去活性。

注意事項(xiàng)

（1）整個(gè)過程只能在玻璃或陶瓷容器中進(jìn)行，不可用金屬容

器，以免酶失活而影響產(chǎn)品的得率及質(zhì)量。

（2）操作的全過程要在低溫下進(jìn)行（10°以下），防止原料變質(zhì)和酶失活。

（3）第三步中加入溶菌酶晶種的具體操作是將溶菌酶晶體均

勻地懸浮于少量的值為10.8，濃度為5%氯化鈉溶液中，取幾滴

加入到調(diào)好的值和氯化鈉濃度的蛋清液內(nèi)，再置低溫處結(jié)晶。

實(shí)驗(yàn)三纖維素酶活力的測定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.了解纖維素酶的種類和測定原理，以及纖維素酶的作用特性；

2.掌握3,5-二硝基水楊酸（）法測定纖維素酶活力的原理和方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

纖維素酶是一種多組分酶，包括4種組分：內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和纖維二糖酶（又稱

β-葡聚糖苷酶）。在各種酶組分的協(xié)同作用下，能降解纖維素，

使之變成纖維寡糖、纖維二糖和葡萄糖等還原糖。這些還原糖能

將堿性條件下的3,5-二硝基水楊酸（）還原，生成紅棕色的氨基

化合物，在540波長處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)還原糖的量

與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系。利用比色法測定其還原糖的量

就可測定纖維素酶的活力。

由不同底物測得的酶活力分別稱為（濾紙?zhí)敲富盍Γ┖?/p>

（羧甲基纖維素酶活力）。為了統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，目前通常用濾紙作為

纖維素酶作用的底物。

纖維素酶在一定溫度和條件下，將纖維素底物(濾紙)水解，釋放出還原糖。在堿性、煮沸條件下，3,5-二硝基水楊酸(試劑)與還原糖發(fā)生顯色反應(yīng)，其顏色的深淺與還原糖(以葡萄糖計(jì))含量成

正比。通過在540測其吸光度，可得到產(chǎn)生還原糖的量，計(jì)算出

纖維素酶的濾紙酶活力。濾紙酶活力()指固體酶(或1液體酶)，在(50士0.1)℃,指定條件下(酸性纖維素酶4.8，中性纖維素酶6.0),水解濾紙底物，產(chǎn)生出相當(dāng)于l葡萄糖的還原糖量，為1個(gè)酶活

力單位，以(或)表示。

三、實(shí)驗(yàn)器材和試劑

水浴鍋、分光光度計(jì)、計(jì)時(shí)器、比色皿、移液管、吸耳球

試劑、檸檬酸緩沖液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液、快速定性濾紙

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

取7支具塞刻度試管，編號，按照表一規(guī)定的量，分別吸取

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、緩沖溶液和試劑于各管中，混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)

置于沸水浴中，反應(yīng)10，取出，迅速冷卻至室溫，用水定容至25，蓋塞，混勻。在540處測量吸光度，以葡萄糖量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。

表一葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

管號葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液緩沖液

吸取量（）

試劑吸

取量（）

濃度（）吸取量()

00.00.0023.0

11.00.501.53.0

21.50.501.53.0

32.00.501.53.0

42.

50.501.53.0

53.00.501.53.0

63.50.501.53.0

2.待測酶液的制備

（1）稱取酶樣1.0g，用檸檬酸緩沖液溶解至100（100倍），

之后分別做200倍、400倍和800倍稀釋,混勻。準(zhǔn)確定容放置10，待測。

（2）濾紙條的準(zhǔn)備

濾紙條事先干燥，水分平衡后，將濾紙折成寬1，質(zhì)量為5±0.5的濾紙條，折成M型備用。

（3）酶活力的測定

取四支具塞試管，將折成M型的濾紙條分別放入每支試管底部，其中一支試管空白，分別向四支試管中加入緩沖液1.5，待測酶液0.5（空白管不加），使管內(nèi)溶液浸沒濾紙，蓋塞。

將四支試管同時(shí)置于50℃水浴中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)60，取出，立即向各管中加入試劑3.0。再于空白管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測

酶液0.5，搖勻。將四支管同時(shí)放入沸水浴中，加熱10，取出，迅速冷卻至室溫，加水定容至25，搖勻。

以空白管（對照液）調(diào)儀器零點(diǎn)，在540下，測量三支平行管中樣液的吸光度，取平均值。以平均值查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用回歸方

程求出還原糖含量。

（4）酶活力的計(jì)算

纖維酶活力按以下公式計(jì)算：

×1/0.5×ｎ

式中，樣品的濾紙酶活力，；根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得

的還原糖量，；酶樣的稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)四金銀花、黃芩、川芎和連翹浸膏的制備

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1．掌握提取方法及操作要點(diǎn)。

2．熟悉提取率的測定方法。

3.了解總浸膏量中總黃酮量和總有機(jī)酸量的測定方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

浸膏劑指用適宜溶劑與方法提取中藥中有效成分，蒸去全部

溶劑，調(diào)整濃度至規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)所制成的膏狀或粉狀的固體制劑。除另有規(guī)定外，浸膏劑毎1g相當(dāng)于原有藥材的2~5g。浸膏劑一般用煎煮法或滲漉法制備。煎煮法指將藥材加水煎煮取汁的方法，

一般過程為取規(guī)定藥材，切碎或粉碎成粗粉，置適宜煎器中，加

水浸沒藥材，浸泡適宜時(shí)間后，加熱至煮沸，保持微沸一定時(shí)間，分離煎出液，藥渣依法煎出數(shù)次（一般為2~3次），至煎液味淡為止，合并各次煎出液，濃縮至規(guī)定濃度。煎煮法適用于有效成

分能溶于水，且對濕、熱均穩(wěn)定的藥材。滲漉法是將適度粉碎的

藥材置滲漉筒中，由上部不斷添加溶劑，溶劑滲過藥材層向下流動過程中浸出藥材成分的方法。適用于貴重藥材、毒性藥材及高濃度制劑。

三、實(shí)驗(yàn)材料與器材

金銀花、黃芩、川芎、連翹、酚酞試劑、滴定液、0.6()2甲醇溶液

索氏提取儀、回流冷凝管、加熱套、水浴鍋

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.金銀花提取

取最粗粉金銀花、黃芩、川芎、連翹各20g，加入200蒸餾水，按煎煮法，煎煮3次，每次30，取上清液或過濾取濾液。2.浸膏制備：將濾液濃縮至稀糖漿狀，靜置2周，過濾，即得浸膏。

3.質(zhì)量檢查

（1）觀察浸膏的外觀性狀，本品在水浴上蒸干后，在105℃干燥3小時(shí)，至恒定，測定測定總浸膏量。

（2）含量測定

①總有機(jī)酸的測定：在供試品溶液中加入酚酞試劑2滴，用標(biāo)定好的0.0749的滴定液滴定至溶液顯粉色。毎1滴定液相當(dāng)于9.916的水楊酸，總有機(jī)酸量以水楊酸計(jì)。

②總黃酮的測定：按《中藥化學(xué)》中蘆丁測定方法，0.6()2甲醇溶液為參比，于510處測定各溶液吸光值。

實(shí)驗(yàn)五金銀花、黃芩、川芎和連翹浸膏的純化及丸劑的制備

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握泛制法、塑制法制備丸劑的方法與操作要點(diǎn)。

2.熟悉水丸、蜜丸、滴丸對藥料和輔料的處理原則及各類丸劑的

質(zhì)量要求。

二、實(shí)驗(yàn)原理

丸劑是根據(jù)中醫(yī)辨證論治的原則組方。碾研成細(xì)末，混合均

勻后，根據(jù)處方用蜜、水、黃酒、醋、面糊、米糊、蜂蠟、藥汁、流浸膏、糖漿等為粘合劑，制成圓球形的內(nèi)服固體劑型，如蜜丸、水丸、糊丸、蠟丸、濃縮丸等，以治療疾病的一種療法。丸劑的

制法有泛制法、塑制法和滴制法。泛制法適用于水丸、水蜜丸、

糊丸、濃縮丸的制備，其工藝流程為：原、輔料的準(zhǔn)備→起模→

成型→蓋面→干燥→選丸→質(zhì)量檢查→包裝。塑制法適用于蜜丸、濃縮丸、糊丸、蠟丸等的制備，其工藝流程為：原、輔料的準(zhǔn)備

→制丸塊→制丸條→分粒、搓圓→干燥→質(zhì)量檢查→包裝。供

制丸用的藥粉應(yīng)為細(xì)粉或極細(xì)粉；起模、蓋面、包衣的藥粉，應(yīng)

根據(jù)處方藥物的性質(zhì)選用。丸劑的賦形劑種類較多，選用恰當(dāng)?shù)臐櫇駝ず蟿怪扔欣诔尚?，又有助于控制溶散時(shí)限，

提高藥效。

水丸制備時(shí)，根據(jù)藥料性質(zhì)、氣味等可將藥粉分層泛入丸內(nèi)，

掩蓋不良?xì)馕叮乐狗枷愠煞值膿]發(fā)損失，也可將速效部分泛于外層，緩釋部分泛于內(nèi)層，達(dá)到長效的目的。一般選用黏性適中

的藥物細(xì)粉起模，并應(yīng)注意掌握好起模用粉量。如用水為潤濕劑，必須用8小時(shí)以內(nèi)的涼開水或蒸餾水。水蜜丸成型時(shí)先用低濃度

的蜜水，然后逐漸用稍高濃度的蜜水，成型后再用低濃度的蜜水

撞光。蓋面時(shí)要特別注意分布均勻。

泛制丸因含水分多，濕丸粒應(yīng)及時(shí)干燥，干燥溫度一般為80℃左右。含揮發(fā)性、熱敏性成分，或淀粉較多的丸劑，應(yīng)在60℃

以下干燥，。丸劑在制備過程中極易染菌，應(yīng)采取恰當(dāng)?shù)姆椒?/p>

以控制。5.滴丸的冷卻劑必須對基質(zhì)和主藥均不溶解，其比重

輕于基質(zhì)，但兩者應(yīng)相差極微，使滴丸滴入后逐漸下沉，給予充

分的時(shí)間冷卻。否則，如冷卻劑比重較大，滴丸浮于液面；反之

則急劇下沉，來不及全部冷卻，滴丸會變形或合并。

三、實(shí)驗(yàn)材料與儀器

金銀花、黃芩、川芎、連翹、蜂蜜、純化水

培養(yǎng)皿、小型制丸機(jī)

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.水丸的制備：金銀花、黃芩、川芎、連翹以上4味，各取5g，混合粉碎成細(xì)粉，混勻。①起模：即起母子。可采用藥匾手

工法或包衣鍋機(jī)械法。手工法是以小掃帚蘸少許開水，或其他粘合劑均勻地刷在藥匾上，然后撒上少量藥粉，轉(zhuǎn)動藥匾，使藥粉

全部濕潤，再用干燥棕刷輕輕將藥粉刷離，經(jīng)過再刷水，加藥粉，旋轉(zhuǎn)藥匾，如此反復(fù)多次，使顆粒逐漸呈圓形而增大，過藥篩選

取均勻的顆粒作為母子。機(jī)械法則以包衣鍋代替藥匾起模，其操作方法與手工法基本相同。逐漸加大制成符合要求的丸劑。手工法泛丸是母子的基礎(chǔ)上②泛丸：將篩選的母子。繼續(xù)用藥匾，經(jīng)

過噴水，撒藥粉，利用旋轉(zhuǎn)、推拉、揉滾、翻擺等操作，反復(fù)進(jìn)行，使藥丸加大到一定水平，過篩，即可制成均勻光滑一致的水

泛丸。機(jī)器泛丸基本操作與手工法相同。③干燥：水丸制成后應(yīng)

將其攤布容器中，于陰涼通風(fēng)處及時(shí)干燥，并應(yīng)隨時(shí)加以翻動。

或用低溫烘干。

2.蜜丸:將藥材細(xì)粉用蜂蜜為粘合劑制成的丸劑。分為大蜜丸

及小蜜丸兩種。蜜丸操作主要為煉蜜、丸塊及丸條制備、丸劑分

割與搓圓、干燥、包衣等幾個(gè)步驟。①煉蜜：將蜂蜜置于鍋中加

熱熬煉。撈出漂浮物及浮沫以去除其中的雜質(zhì)，并可殺死微生物，破壞酵素，適當(dāng)減少水分含量，增加粘合力，以適合制丸要求。

煉蜜依據(jù)熬煉時(shí)間長短；分為嫩蜜、中蜜(亦稱煉蜜)老蜜3種二煉蜜水平按藥物性質(zhì)和季節(jié)而定，嫩蜜、煉蜜適用于粘性較強(qiáng)的藥材，老蜜則適用于粘性差的礦物或纖維性較多的藥材；冬季多用嫩蜜，夏季多用老蜜。加入煉好的蜂蜜②丸塊及丸條制備：少

量制備時(shí)將藥物細(xì)粉置于清潔的容器內(nèi)?；旌暇鶆颍瞥绍浻策m宜的可塑性丸塊，然后搓制成粗細(xì)一致的丸條。大量生產(chǎn)時(shí)，則

用機(jī)械完成丸塊及丸條制備。可以手工制丸或機(jī)械制丸。手工制丸按預(yù)定規(guī)格將丸條掐成均勻顆粒⑧丸劑分割與搓圓：丸條制成后。搓圓即成。機(jī)械制丸是丸條制成后自動切割，搓揉，滾圓。干燥方法多用烘干法④干燥：大蜜丸機(jī)蜜丸一般應(yīng)干燥后貯存。

以丸?；ゲ徽尺B，不粘手，手捏之不易變形為度。如不需干燥則

以蠟皮包裹貯存。

實(shí)驗(yàn)六植物油/β-環(huán)糊精包合物的制備

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1．掌握飽和水溶液法制備包合物的工藝；用單凝聚法制備微囊

的方法。

2．熟悉β－環(huán)糊精的性質(zhì)及包合物的其他制備方法；熟悉影響

成囊的因素及控制方法。

3．了解β－環(huán)糊精包合物的應(yīng)用。

二、實(shí)驗(yàn)原理

環(huán)糊精（，）是一種新型的水溶性包合材料，是淀粉經(jīng)酶解

得到的一種產(chǎn)物。這些分子中有6~13個(gè)葡萄糖分子以α－1，4糖苷鍵連接而成的環(huán)筒狀結(jié)構(gòu)的低聚糖化合物，其分子結(jié)構(gòu)中具有一定大小的空穴，有環(huán)筒內(nèi)疏水、環(huán)筒外親水的特性。環(huán)糊精

包合物是指借助分子間的作用力（包括靜電引力、氫鍵、偶極子

間引力等），藥物分子包含或嵌入環(huán)糊精的筒狀結(jié)構(gòu)內(nèi)形成的超

微粒分散物。形成的包合物服用后在體內(nèi)經(jīng)滲透、擴(kuò)散、競爭性

置換等作用釋放出藥物分子而發(fā)揮藥效。環(huán)糊精包合能將一種液體物質(zhì)轉(zhuǎn)變成一種固體復(fù)合物并且固定芳香物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì)。

環(huán)糊精包合物制備方法很多，有飽和水溶液法、研磨法、噴霧干

燥法、冷凍干燥法等，可根據(jù)環(huán)糊精和藥物的性質(zhì)，結(jié)合實(shí)際生

產(chǎn)條件加以選用。藥物制成包合物后可增加藥物的穩(wěn)定性，增加難溶性藥物的溶解度與溶出速度，提高藥物的生物利用度，掩蓋藥物的不良嗅味，降低藥物的刺激性，還可使液體藥物粉末化以便制劑，有些包合物還可作為緩釋和靶向制劑的藥物載體。

微型膠囊（簡稱微囊）是利用天然、半合成或合成的高分子

材料（通稱囊材），將固體或液體藥物（通稱囊心物）包裹而成

的微小膠囊。藥物微囊化后，穩(wěn)定性增加，并

直徑5μm～250μｍ

呈固體粉末狀，可供制備散劑、膠囊劑、片劑、注射劑及軟膏劑

等使用。微囊的制備方法很多，可歸納為物理化學(xué)法、化學(xué)法及

物理機(jī)械法等。本次實(shí)驗(yàn)采用物理化學(xué)法中的單凝聚法和復(fù)凝聚法。本實(shí)驗(yàn)利用兩種具有相反電荷的高分子材料作囊材，將囊心物分散在囊材的水溶液中，在一定條件下，相反電荷的高分子材料互相交聯(lián)形成復(fù)合物后，溶解度降低，自溶液中凝聚析出成囊。本實(shí)驗(yàn)所用阿拉伯膠帶負(fù)電，而A型明膠在等電點(diǎn)以上帶負(fù)電，等電點(diǎn)以下帶正電。如果將待包的藥物先與阿拉伯膠制成乳濁液

或混懸液，然后在一定溫度下與等量明膠溶液混合，用醋酸調(diào)在4.0-4.1左右，則明膠帶正電，與帶負(fù)電的阿拉伯膠相互凝聚而包

在藥物周圍，成為微囊。

三、實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

顯微鏡（10×40倍）、500燒杯、乳缽、溫度計(jì)、水浴、布氏漏斗、100量筒、10量筒、蒸發(fā)皿、阿拉伯膠、明膠、37%甲醛、10%醋酸、10%氫氧化鈉

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與操作

1.薄荷油β-環(huán)糊精包合物

【處方】β-環(huán)糊精4g

植物油1（28d）

蒸餾水50

【制法】稱取β－4g，置100錐形瓶中，加入蒸餾水50，加

熱溶解，降溫至50℃，精密滴加植物油1，恒溫?cái)嚢?.5小時(shí)。冷藏24小時(shí)，待沉淀完全后過濾。用無水乙醇5分三次洗滌沉淀3次，至沉淀表面近無油漬，將包合物置干燥器中干燥，即得。

2.植物油微囊

【處方】

植物油1.0g10%醋酸適量

明膠2.5g20%氫氧化納液

適量

阿拉伯膠2.5g硬脂酸鎂適量

37%甲醛1.25蒸餾水適量

【制法】取阿拉伯膠2.5g，使溶于50蒸餾水中（60℃），加入植物油1.0g于組織搗碎機(jī)中乳化1分鐘。將之轉(zhuǎn)入500燒杯并放入50℃恒溫水浴鍋中。另取明膠2.5g，使溶于60℃50蒸餾水中。將明膠液在攪拌下加入上述乳濁液中，用10%的醋酸調(diào)4.1左右，顯微鏡下觀察見到油珠外層有一層薄薄的膜，即已成囊（此時(shí)囊形并不圓整，大小不一）。加入蒸餾水200（溫度應(yīng)不低于30℃），不斷攪拌直到10℃以下。加入37%甲醛1.25（以蒸餾水1.25稀釋），攪拌15分鐘，用20％氫氧化鈉液調(diào)8～9，繼續(xù)攪拌冷卻半小時(shí)，除去懸浮的泡沫，濾過，用水洗滌至無甲醛臭，

中性即可。抽濾，加３％硬脂酸鎂制粒，過一號篩，于50℃烘干，即得。

五、注意事項(xiàng)

1．成囊時(shí)調(diào)節(jié)不要過高或過低，一般調(diào)至4.0左右，此時(shí)明膠全部帶正電荷。

2.攪拌速度要適宜。速度過快，囊膜易破壞，過慢則微囊易粘連。速度不一，則成囊大小不均勻。

3.加入甲醛使囊膜變性，用量多少直接影響變性程度。用10%氫氧化鈉調(diào)8。攪拌30，以增加甲醛與明膠的交聯(lián)作用，使凝膠的

網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔隙縮小。

六、思考題

1.制備包合物的關(guān)鍵是什么？

2.本實(shí)驗(yàn)為什么選用β－環(huán)糊精為主分子？它有什么特點(diǎn)？

3．除飽和水溶液法外，制備包合物的方法還有哪些？

4．試舉例說明包合物在藥物制劑中的應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)七植物油/β-環(huán)糊精包合物的質(zhì)量檢查

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1．掌握β－環(huán)糊精包合物和微囊的質(zhì)量檢測方法。

2．熟悉藥物溶出度的測定方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

影響包合物的因素包括內(nèi)因和外因。內(nèi)因：主、客分子的大

??；客分子的極性。外因：溫度、附加劑、等。為獲得最佳制備

工藝，以包合物的收得率、包合物中藥物的含量為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，幾

種質(zhì)量評價(jià)方法：顯微鏡法和電鏡掃描法溶解度和溶出度法、紫外分光光度法、熒光光度法、紅外分光光譜法、差示熱分析法、

X射線衍射法、核磁共振法。通過比較包合前后紫外吸收光譜圖，根據(jù)吸收峰的位置和高度來判斷包合是否成功或包合前后主要

成分是否發(fā)生變化。

目前微囊的質(zhì)量評價(jià)，除制成的制劑本身要求應(yīng)符合藥典規(guī)

定外，還包括下述內(nèi)容：（一）形態(tài)、粒徑及其分布，可采用光

學(xué)顯微鏡、掃描或電子顯微鏡觀察形態(tài)并提供照片。微囊形態(tài)應(yīng)為圓整球形或橢圓形的封閉囊狀物，微球應(yīng)為圓整球形或橢圓形的實(shí)體；（二）藥物的含量微囊、微球中藥物含量的測定一般采

用溶劑提取法。溶劑的選擇原則是：應(yīng)使藥物最大限度地溶出而最小限度地溶解載體材料，溶劑本身也不應(yīng)干擾測定。（三）藥物的載藥量與包封率，對于粉末狀微囊，先測定其含藥量后計(jì)算載藥量；對于混懸于液態(tài)介質(zhì)中的微囊，先將其分離，分別測定

液體介質(zhì)和微囊的含藥量后計(jì)算其載藥量和包封率。

三、實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

倍）、溶出儀

電子天平、顯微鏡（10×40

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.包合物質(zhì)量檢查

（1）性狀包合物為白色干燥粉末，無明顯的植物油氣味。

（2）重量：稱量包合物的總質(zhì)量，計(jì)算得率。

2.微囊的質(zhì)量評價(jià)主要檢查膠囊內(nèi)容物微膠囊的粒度分布、顯

微觀察、總油及表面油。

（1）微膠囊的顯微鏡觀察

一滴固化后的微膠囊溶液，將其放于載玻片上，用顯微鏡觀察并測量其粒徑大小。

（２）溶出度：量取200蒸餾水，注入每一個(gè)測定容器內(nèi)，加熱使溶劑溫度保持在37℃±0.5℃，調(diào)整轉(zhuǎn)速使其穩(wěn)定，取微囊試樣置于管內(nèi)，然后進(jìn)行測定。

實(shí)驗(yàn)八金霉素鏈霉菌培養(yǎng)基的制備

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)會鏈霉菌種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配制；

2.掌握實(shí)驗(yàn)室高壓濕熱滅菌的方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

金霉素鏈霉菌（）亦稱“金色鏈霉菌”，放線菌門()，放線菌綱()，放線菌目()，鏈霉菌科()，鏈霉菌屬()。在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生金色色素，故名。其菌落為草帽型,菌落直徑一般為3～5毫米,表面較平坦,中間有隆起。菌落開始為白色，長孢子后變

青色。抗菌素工業(yè)上用以生產(chǎn)金霉素。

放線菌是一類介于細(xì)菌與真菌之間的單細(xì)胞微生物。放線菌

在土壤中分布最多，大多數(shù)生活在含水量較低、有機(jī)質(zhì)豐富和微堿性的土壤中。多數(shù)情況下，泥土中散發(fā)出的“泥腥味”就是由

放線菌中鏈霉菌產(chǎn)生的土腥素造成的。放線菌大都好氧，屬于化能異養(yǎng)，菌絲纖細(xì)，分枝，常從一個(gè)中心向周圍輻射生長。因其

生長具輻射狀，故名放線菌。放線菌能像真菌那樣形成分枝菌絲，

并在菌絲末端產(chǎn)生外生的分生孢子，有些種類甚至形成孢子囊，

因而曾被誤認(rèn)是真菌。但其菌落較小而致密，不易挑取。不少菌

種在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)上廣泛應(yīng)用，可產(chǎn)生抗菌素，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)和

分離出的由放線菌產(chǎn)生的抗生素多達(dá)4000多種，其中，有50多種抗生素已經(jīng)廣泛地得到應(yīng)用，如鏈霉素、紅霉素、土霉素、

四環(huán)素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于臨床治療人的多種疾

??；有些可生產(chǎn)蛋白酶、葡萄糖異構(gòu)酶；有的用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，如

滅瘟素、井岡霉素、慶豐霉素等。

四環(huán)素類抗生素是由鏈霉菌生產(chǎn)或經(jīng)半合成制取的一類廣譜

抗生素。抗菌譜極廣，包括革蘭氏陽性和陰性菌、立克次體、衣

原體、支原體和螺旋體。品種主要包括金霉素、四環(huán)素和土霉素。三、實(shí)驗(yàn)材料與器材

1移液槍、鋁鍋、電爐母液（0.1g／）、母液（0.1g／）、促進(jìn)劑母液（2.5／）

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1．種子培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g／L)：可溶性淀粉40，黃豆餅粉20，酵母粉5，

240.25。

蛋白胨5，34，(4)243，4·7H2O0.25，

先稱取黃豆餅粉20g，單獨(dú)煮沸10分鐘，加入少量涼水降溫，

4層紗布壓榨取汁，與其它稱好的各成分混合，定容至1L。

每50分裝到250三角瓶中，每組2瓶。

2．定向發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基(g／L)：可溶性淀粉100，黃豆餅粉40，蛋白胨15，35，酵母粉2.5，(4)243，4·7H2O0.25，α—淀粉酶0.1。

配制方法同種子培養(yǎng)基，配好后分裝到500三角瓶中，每瓶100，分別加入如下成分，比較它們對四環(huán)素產(chǎn)量的影響：對照(不加其他成分)；

加入母液至終濃度為2g／L；

加入母液至終濃度為2g／L；

加入母液至終濃度為2g／L及促進(jìn)劑母液至終濃度為0.025g／L。

每組各配一瓶。

3．滅菌

將封好口的培養(yǎng)基121℃滅菌30。同時(shí)滅1剪口移液槍頭。

（總過程：稱量——溶化——定容——分裝——封口——滅

菌）

五、注意事項(xiàng)

1．黃豆餅粉煮沸取汁。

2．培養(yǎng)基封口最好用8層紗布或棉花塞，最好不用橡膠塞，以

增加透氣性。

3．滅菌時(shí)鍋內(nèi)要補(bǔ)足水分。由于滅菌鍋較大，升溫排氣一定要

充分（10）。

六、補(bǔ)充閱讀

工業(yè)發(fā)酵中利用生產(chǎn)菌發(fā)酵得出最終產(chǎn)物是一個(gè)逐級放大的

過程，各個(gè)不同的階段對于營養(yǎng)成分的要求也各有特點(diǎn)，根據(jù)發(fā)酵不同階段的要求，培養(yǎng)基可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種。

孢子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培

養(yǎng)基，對這種培養(yǎng)基的要求是能使菌體迅速生長，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，并要求這種培養(yǎng)基不易引起菌種發(fā)生變異。所以對孢子培養(yǎng)基的基本配制要求是：第一，營養(yǎng)不要太豐富（特別是有機(jī)

氮源），否則不易產(chǎn)孢子。如灰色鏈霉在葡萄糖－硝酸鹽－其它

鹽類的培養(yǎng)基上都能很好地生長和產(chǎn)孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只長菌絲而不長孢子。第二，所用無機(jī)鹽的濃

度要適量，不然也會影響孢子量和孢子顏色。第三，要注意孢子

培養(yǎng)基的和濕度。生產(chǎn)上常用的孢子培養(yǎng)基有：麩皮培養(yǎng)基、小

米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米碎屑培養(yǎng)基和用葡萄糖、蛋白胨、

牛肉膏和食鹽等配制成的瓊脂斜面培養(yǎng)基。大米和小米常用作霉菌孢子培養(yǎng)基，因?yàn)樗鼈兒可?，疏松、表面積大，所以是較

好孢子培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲

體，并使菌體長得粗壯，成為活力強(qiáng)的“種子”。所以種子培養(yǎng)

基的營養(yǎng)成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高

些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達(dá)到較高的溶解氧，供大量

菌體生長繁殖。種子培養(yǎng)基的成分要考慮在微生物代謝過程中能

維持穩(wěn)定的，其組成還要根據(jù)不同菌種的生理特征而定。一般種子培養(yǎng)基都用營養(yǎng)豐富而完全的天然有機(jī)氮源，因?yàn)橛行┌被崮艽碳ゆ咦影l(fā)芽。但無機(jī)氮源容易利用，有利于菌體迅速生長，

所以在種子培養(yǎng)基中常包括有機(jī)及無機(jī)氮源。最后一級的種子培養(yǎng)基的成分最好能較接近發(fā)酵培養(yǎng)基，這樣可使種子進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)基后能迅速適應(yīng)，快速生長。

發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物之用。它既要使種子接種后能迅速生長，達(dá)到一定的菌絲濃度，又要使長好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、

前體和促進(jìn)劑等。但若因生長和生物合成產(chǎn)物需要的總的碳源、

氮源、磷源等的濃度太高，或生長和合成兩階段各需的最佳條件

要求不同時(shí)，則可考慮培養(yǎng)基用分批補(bǔ)料來加以滿足。

實(shí)驗(yàn)九金霉素鏈霉菌的定向發(fā)酵

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)和掌握無菌操作技術(shù)。

2.掌握定向發(fā)酵四環(huán)素的原理。

二、實(shí)驗(yàn)原理

定向發(fā)酵是指通過改變培養(yǎng)基組分(加入某些物質(zhì))改變微生

物代謝途徑，使發(fā)酵按主觀要求產(chǎn)生較多的產(chǎn)物。

金霉素、四環(huán)素和土霉素，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似：

R1R2

金霉素H

土霉素H

四環(huán)素HH

金霉菌原是產(chǎn)生金霉素（）的菌種，但因金霉素比四環(huán)素只

多一個(gè)氯離子，所以只要在發(fā)酵液中加入某些物質(zhì)，阻止氯離子進(jìn)入四環(huán)素分子，從而使菌種產(chǎn)生較多的四環(huán)素。另外，金色鏈

霉菌在30℃以下時(shí)，合成的能力較強(qiáng)；當(dāng)溫度超過35℃時(shí)則只合成。

本實(shí)驗(yàn)中，利用溴離子在生物合成過程中對氯離子有競爭性

抑制劑作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即促進(jìn)劑，分子式：C7H52，通常作為橡膠硫化促進(jìn)劑)抑制氯化酶的作用，從而增加四環(huán)素的產(chǎn)量。

三、實(shí)驗(yàn)材料和試劑

金霉素鏈霉菌（購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微

生物中心）、促進(jìn)劑、麩皮、K24、4·7H2O、（4）24、瓊脂

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1.配制斜面培養(yǎng)基

（4）243g，（1）麩皮36.0g，K240.2g，4·7H2O0.1g，

瓊脂15～20g，定容至1L，7。

（2）可溶性淀粉20g，31g，K240.5g，4·7H2O0.5g，0.5g，4·7H2O0.01g，定容至1L，7.2~7.5。

2.制備斜面孢子：將保藏的菌種接種于液體培養(yǎng)基中（不加瓊

脂的斜面培養(yǎng)基），28℃下

200振蕩培養(yǎng)，將活化1d后的金霉

5～7天，待孢子長成灰素鏈霉菌種接入斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)

色，于4℃冰箱中保藏。

3.種子培養(yǎng)：將在斜面上生長良好的菌體用接種鏟挑取12左右接入裝有50四環(huán)素種子培養(yǎng)基的250錐形瓶中，230、28℃下振蕩培養(yǎng)20～24h。

4.發(fā)酵培養(yǎng)：以剪口移液槍頭取10種子液接入裝有100發(fā)酵培養(yǎng)液的500錐形瓶中，230、28℃下振蕩培養(yǎng)5d。用于后面的測定效價(jià)和薄層層析實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)十四環(huán)素、金霉素的薄層層析鑒定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握薄層層析的原理，四環(huán)素族抗生素的定性鑒定方法

二、實(shí)驗(yàn)原理

層析（色譜，）是相當(dāng)重要、且相當(dāng)常見的一種技術(shù)，在把

微細(xì)分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動相的系統(tǒng)中（根據(jù)移動相種類的不同，分為液相層析和氣相層析二種），使試料混合

物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài)邊移動，利用各成分對固定相親和力不同所引起的移動速度差，將它們彼此分離開的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。用作固定相的有

硅膠、、氧化鋁、離子交換樹脂、離子交換纖維等，或是在硅藻

土和纖維素那樣的無活性的載體上附著適當(dāng)?shù)囊后w。將作為固定相的微細(xì)粉末狀物質(zhì)裝入細(xì)長形圓筒中進(jìn)行的層析稱為柱層析（），在玻璃板上涂上一層薄而均的支持物（硅膠、纖維素和

淀粉等）作為固定相的稱為薄層層析（），或者用濾紙作為固定相的紙上層析。層析根據(jù)固定相與溶質(zhì)（試料）間親和力的差

異分為吸附型、分配型、離子交換型層析等三種類型。但這并不

是很嚴(yán)格的，有時(shí)常見到其中間類型。此外，近來也應(yīng)用親和層析，即將與基質(zhì)類似的化合物（通常為共價(jià)鍵）結(jié)合到固定相上，再利用其特異的親和性沉淀與其對應(yīng)的特定的酶或蛋白質(zhì)。

分配層析在支持物上形成部分互溶的兩相系統(tǒng)。一般是水相

和有機(jī)溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等親水物質(zhì)，

這些物質(zhì)能儲留相當(dāng)量的水。被分離物質(zhì)在兩相中都能溶解，但分配系數(shù)不同，展層時(shí)就會形成以不同速度向前移動的區(qū)帶。一種溶質(zhì)在兩種互不混溶的溶劑系統(tǒng)中分配時(shí)，在一定溫度下達(dá)到

平衡后，溶質(zhì)在固定相和流動相溶劑中的濃度之比為一常數(shù)，稱為分配系數(shù)。當(dāng)欲被分離的各種物質(zhì)在固定相和流動相中的分配

系數(shù)不同時(shí)，它們就能被分離開。分配系數(shù)大的移動快（阻力?。?/p>

薄層層析是以薄層材料為支持物，在密閉容器中，樣品在其

上展開。當(dāng)斑點(diǎn)不易為肉眼觀察時(shí)，可利用適當(dāng)?shù)娘@色劑，或通

過紫外燈下產(chǎn)生熒光的方法進(jìn)行觀察。通過這種展開操作，各成分呈斑點(diǎn)狀移動到各自的位置上，再根據(jù)值的測定進(jìn)行鑒定。薄層色譜法具有分離與鑒定的雙重功能，通過薄層圖譜與對照品的

圖譜相比較，除了能鑒出有效成分或特征成分外，還以完整的色譜圖作為一個(gè)整體對制劑加以鑒別。薄層色譜分析法由于簡便、

快速，能有效地、直觀地反映藥品地真實(shí)性、穩(wěn)定性，現(xiàn)已成為

藥物制劑的鑒別和質(zhì)量控制的行之有效的方法之一。薄層層析是鑒別抗生素的方法之一，層析后進(jìn)行顯色，并繪制層析圖譜，根

據(jù)層析圖譜對抗生素進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)以四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為對照對發(fā)酵液進(jìn)行鑒定。

三、實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備

玻璃層析缸、層析板、毛細(xì)玻璃管或微量注射器、紫外投射儀、四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品、正丁醇、醋酸、凡士林

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1．層析板處理

層析板105℃烘烤過夜，均勻噴上0.1磷酸鹽緩沖液(4.5)，于空氣中晾干、備用。

2．點(diǎn)樣

選取兩種定向發(fā)酵液約1于1.5離心管中，10000，5，備用。

在距層析板底邊2.5~3起始線上(用鉛筆劃線，做出點(diǎn)樣點(diǎn)記號)，用毛細(xì)玻璃管在薄層層析板上點(diǎn)四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品和金霉素標(biāo)準(zhǔn)品

溶液3次，發(fā)酵液上清點(diǎn)8～10次，點(diǎn)樣點(diǎn)不大于0.4，每次都

要吹干后再點(diǎn)。（一般效價(jià)在1000u／以上點(diǎn)3次，500～1000u／點(diǎn)4次，200～500u／點(diǎn)5次）。

3.層析（展開）

用正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)的上相作展開劑。層析前需預(yù)先用展開劑預(yù)平衡層析缸，可在缸中倒入2高的展開劑，密閉，

一般保持15－30分鐘。然后將層析板置于盛有展開劑的層析缸

中，在室溫下展層6～8h（與溫度有關(guān)）。封口不嚴(yán)可涂抹凡士

林。

4．熒光顯影

待溶劑前沿展至板的一半以上時(shí)將層析板取出，標(biāo)出溶劑前

沿，于通風(fēng)櫥中晾干，用氨水熏數(shù)秒鐘后即可在紫外燈下顯影，

畫出黃色斑點(diǎn)，分別算出值。（四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品慢和金霉素標(biāo)準(zhǔn)品

快）

無水四環(huán)素在波長365下顯黃色熒光，根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)對照可定

性測定。

五、注意事項(xiàng)

1.要控制好點(diǎn)樣量，樣品太少，斑點(diǎn)不清楚，難以觀察，但樣

品量太多時(shí)往往出現(xiàn)斑點(diǎn)太大或拖尾現(xiàn)象。

2.若因樣品溶液太稀，可重復(fù)點(diǎn)樣，但應(yīng)待前次點(diǎn)樣的溶劑揮

發(fā)后方可重新點(diǎn)樣，以防樣點(diǎn)過大，造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，而

影響分離效果。

3.點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。

4.作展開劑中極少量強(qiáng)極性溶劑(0.5％)或值的改變可顯著改善拖尾現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)十一四環(huán)素效價(jià)測定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1.了解抗生素效價(jià)的表示方法

2.學(xué)習(xí)抗生素的測定方法

二、實(shí)驗(yàn)原理：

實(shí)驗(yàn)利用比色法測定四環(huán)素和金霉素的效價(jià)。效價(jià)(或)是評價(jià)抗生素效能的標(biāo)準(zhǔn)，它代表抗生素對微生物的抗菌效力，也是衡量發(fā)酵液中抗生素含量的尺度，人們以1μｇ金霉素或四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品為1個(gè)單位，0.6μｇ

青霉素G鈉鹽為1個(gè)單位。

四環(huán)素和金霉素在酸性條件下，加熱，可產(chǎn)生黃色的脫水金

霉素和脫水四環(huán)素，其色度與含量成正比。

在堿性條件下，四環(huán)素較穩(wěn)定，而金霉素則生成無色的異金

霉素：

根據(jù)上述原理，可以在酸性條件下，利用比色法測定四環(huán)素、金霉素混合液的總效價(jià)；而四環(huán)素效價(jià)的測定可在堿性條件下，

使金霉素生成無色的異金霉素，然后再在酸性條件下，使四環(huán)素生成黃色的脫水四環(huán)素，經(jīng)比色測得四環(huán)素效價(jià)?？傂r(jià)與四環(huán)素效價(jià)二者之差即為金霉素的效價(jià)。本實(shí)驗(yàn)只測定四環(huán)素的效價(jià)。

發(fā)酵液中，由于雜質(zhì)的干擾，將影響比色的正確性，因此加

入乙二胺四乙酸二鈉鹽()作為螯合劑，掩飾金屬離子的干擾，改

變四環(huán)素脫水條件(降低酸度或延長加熱時(shí)間)，可以減少雜質(zhì)對比色反應(yīng)的干擾。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

取各定向發(fā)酵液10于50容量瓶中，加入l濃度為／l00溶液，

加蒸餾水5，再加入5濃度為3／L的，在20~25℃下保溫15后，加入5濃度為6／L的，水浴煮沸15后，冷卻，稀釋至刻度，在分光光度計(jì)上于380處測定其吸光度值。

對照樣品（不加誘導(dǎo)劑）的前處理方法與上述步驟一樣，只是在加入后，不加熱，稀釋至刻度，作為測定樣品的空白對照,調(diào)

零。

四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（1000）取1于50容量瓶中，加1濃度為6／L的，水浴煮沸15后，冷卻，稀釋至

50，380測吸光度。（以蒸餾水作為空白測定）

以定向發(fā)酵培養(yǎng)基中的對照組作為空白對照，測定其它三個(gè)處理組的吸光度。（有時(shí)可能因?qū)φ战M處理不當(dāng)而使其它組的讀數(shù)為負(fù)值，這時(shí)可以以蒸餾水作為空白。）計(jì)算公式：

發(fā)酵液A

發(fā)

酵

中

四

環(huán)

素的效價(jià)=A

四

環(huán)

素

標(biāo)

準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)十二

人參細(xì)胞培養(yǎng)與人參皂苷提取

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握人參皂甙的提取、精制方法，進(jìn)一步鞏固和熟悉人參皂甙的性質(zhì)。

2.熟悉和掌握人參皂甙的水解條件和方法。

3.熟悉和掌握柱層析分離人參皂甙元的原理方法及基本操作技術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

人參的主要成分為人參皂苷，總皂苷含量約4％，人參皂苷大多數(shù)是白色無定形粉末或無色結(jié)晶，味微甘苦，具有吸濕性。

人參皂苷易溶于水，甲醇、乙醇，可溶于正丁醇、乙酸、乙酸乙

酯，不溶于乙醚、苯等親脂性有機(jī)溶劑。水溶液經(jīng)振搖后可產(chǎn)生

大量的泡沫。人參總皂苷無溶血作用，分離后，B型和c型人參皂苷有顯著的溶血作用，而A型人參皂苷有抗溶血作用。

人參中除含有皂苷外，還含有脂溶性成分如揮發(fā)油，脂肪、

甾體化合物及大量的糖類等，這些類成分對人參皂苷的分離和精

制有干擾，所以必須除去，方可得到純度較高的皂苷。

人參皂甙元與多個(gè)分子糖結(jié)合成甙，具有較強(qiáng)的親水性，易溶于水和低級醇類，實(shí)驗(yàn)室采用熱水提取人參皂甙，提取液加堿（）

除雜。再用酸調(diào)至