實(shí)驗(yàn)一-雞新城疫疫苗(一)課件

實(shí)驗(yàn)一雞新城疫油乳劑滅活苗的制備技術(shù)（一）

新城疫病毒可以在雞胚中大量增殖，收獲的雞胚尿囊液中即含有新城疫活病毒，將收獲的尿囊液經(jīng)過(guò)滅活，并加入佐劑，便制成了新城疫滅活疫苗。目的和要求：1.掌握雞胚的孵化過(guò)程和雞胚的接種途徑、接種方法；2.掌握新城疫病毒在雞胚尿囊腔的增殖過(guò)程，掌握接毒和收毒的方法。實(shí)驗(yàn)材料：白殼雞胚、孵化箱、１mL注射器、蛋托、新城疫Ⅳ系弱毒苗、注射用生理鹽水、青霉素、鏈霉素等實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1.雞胚的選擇和孵化：孵育前的雞胚先用清水以布洗凈，再用干布擦干，放入孵卵器內(nèi)進(jìn)行孵育（37℃，相對(duì)濕度45%～60%），孵育三日后，雞卵每日翻動(dòng)1～2次。孵至第4日，用檢卵燈觀察雞胚發(fā)育情況，未受精卵，只見(jiàn)模糊的卵黃黑影，不見(jiàn)雞胚的形跡，這種雞卵應(yīng)淘汰?；钆呖煽吹角逦难芎碗u胚的暗影，比較大一些的可以看見(jiàn)胚動(dòng)，隨后每日觀察一次，將胚動(dòng)呆滯或沒(méi)有運(yùn)動(dòng)的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或?qū)⑺赖碾u胚，要隨時(shí)加以淘汰。生長(zhǎng)良好的蛋胚一直孵育到接種前，具體胚齡視所擬培養(yǎng)的病毒種類和接種途徑而定。2.接種材料的制備：將青霉素和鏈霉素分別注入注射用生理鹽水瓶中，使兩種抗生素在生理鹽水中的含量均達(dá)到1000-2000IU(μg)/ml。將注射用生理鹽水3-4ml注入一瓶新城疫Ⅳ系弱毒疫苗中，稀釋。3.照蛋定位：接種前應(yīng)在照蛋器下檢查雞胚，挑出死胚和弱胚。對(duì)所有健康胚應(yīng)先用紅鉛筆畫(huà)出氣室位置，再于胚胎側(cè)畫(huà)出接種位點(diǎn)（進(jìn)針點(diǎn)），接種點(diǎn)應(yīng)避開(kāi)大血管，靠近氣室邊緣處，離胚頭約1cm左右。4.病料接種：若用雞胚分離、培養(yǎng)病毒，則應(yīng)選9～12日齡之間的發(fā)育雞胚。許多病毒，特別是大多數(shù)禽病毒都能在雞胚或鴨胚中生長(zhǎng)繁殖。接種時(shí)應(yīng)先在照蛋器下檢查雞胚是否健康、活潑，并劃出氣室和接種部位。然后嚴(yán)格消毒接種部位和氣室（先用碘酊消毒，再用70%酒精消毒），用打孔器打孔后，每胚接種處理好的接種材料0.2mL。接種后要用石蠟將孔口封死，放37℃環(huán)境中繼續(xù)孵育96h。不同病毒其接種部位、方法和培養(yǎng)時(shí)間不盡一樣。（1）尿囊腔接種這是最常用的接種方法，雞新城疫、減蛋綜合征病毒、傳染性支氣管炎病毒、法氏囊病毒等均可采用這種方法。蛋殼消毒后，先在氣室上打一小孔，再于胚胎一側(cè)靠近氣室處所畫(huà)位點(diǎn)打一小孔，用帶5～7號(hào)針頭的注射器插入孔內(nèi)約1.5cm，接種材料0.2mL。進(jìn)針時(shí)針頭與蛋殼應(yīng)保持30℃角，不應(yīng)垂直進(jìn)針，注射完畢，立即用溶化的熱石蠟將注射口和氣室上小孔密封，然后放回37℃孵化箱孵化96h。并保證氣室朝上。（2）絨毛尿囊膜接種該方法主要用于痘病毒、喉氣管炎病毒和馬立克氏病毒等的分離培養(yǎng)。將卵殼消毒后，先在氣室上打一小孔，再于胚胎側(cè)靠近氣室處避開(kāi)大血管用鋼鋸條將蛋殼打開(kāi)一個(gè)4ｍm見(jiàn)方的小口，用刀尖小心撬開(kāi)蛋殼，不能損傷卵殼膜，形成卵窗。用針尖輕輕挑破卵窗中心的卵殼膜，但不能損傷卵殼膜下的絨毛尿囊膜。在針尖挑破處滴一滴滅菌生理鹽水或甘油，然后用吸頭在氣室小孔上吸氣，使胚內(nèi)造成負(fù)壓，這時(shí)卵窗處絨毛尿囊膜下陷而形成人工氣室，此時(shí)可見(jiàn)生理鹽水或甘油迅速滲入。用注射器滴加2～3滴接種物于卵窗的絨毛尿囊膜上，以透明膠紙封住卵窗。氣室小孔用石臘密封，接種后的雞胚平放在孵化箱中，卵窗向上，不要轉(zhuǎn)動(dòng)。（3）卵黃囊接種此法適用于馬立克氏病毒、披膜病毒、衣原體及立克次氏體的分離、培養(yǎng)。接種方法：氣室端蛋殼消毒后，在氣室中央打一小孔，用帶7號(hào)針頭的注射器垂直刺入約3cm，注射接種物0.1～0.2mL。石蠟封口，繼續(xù)在37℃孵化，每天翻蛋2次。6.接種后的孵化和觀察接種后繼續(xù)在37℃孵化，每天照蛋2次，死胚隨時(shí)取出。一般24h內(nèi)死亡的胚多因創(chuàng)傷或細(xì)菌污染所致，故棄去不用。24h以后死亡的胚，取出后放4℃冰箱，并作上記號(hào)。接種后的孵化時(shí)間長(zhǎng)短隨病毒種類不同而不同，一般新城疫病毒、支氣管炎病毒、減蛋綜合征病毒和法氏囊病毒要孵化48～120h，喉氣管炎病毒、馬立克氏病毒要孵化48～96h，痘病毒要孵化4～5ｄ，腦脊髓炎病毒要孵化至小雞出殼。7.收毒

接種雞胚孵化到規(guī)定時(shí)間后，應(yīng)從孵化器中取出放4℃環(huán)境冷凍36h左右，或在-10℃以下速凍4h左右，但不得使雞胚凍結(jié)，否則易發(fā)生溶血。冷凍完畢按下列步驟收毒：（1）雞胚放于蛋盤(pán)或蛋架上，氣室向上，用碘酊、酒精消毒后，以無(wú)菌鑷子敲開(kāi)氣室蛋殼或去掉人工卵窗的透明膠紙，暴露卵膜。注意不要讓卵殼碎屑掉入雞胚內(nèi)。（2）根據(jù)接種部位，病毒種類或需要，收獲相應(yīng)的雞胚材料如尿囊液、羊水、絨毛尿囊膜、胎兒、卵黃囊等，有時(shí)需要收獲全胚（除去卵黃和蛋白），如新城疫病毒、馬腦炎病毒等。尿囊液：氣室打開(kāi)后，用無(wú)菌眼科鑷子慢慢撕去卵殼膜，然后夾住絨毛尿囊膜輕輕提起，用巴氏吸管刺破絨毛尿膜直接吸取尿囊液。為防止羊膜堵住吸管口，可用鑷子輕輕壓下羊膜及胎兒，然后再吸。每個(gè)雞胚一般可收8mL左右尿囊液。羊水：吸完尿囊液后，可用鑷子夾住羊膜，將巴氏吸管直接插入羊膜腔吸取羊水，然后再用鑷子提起羊膜或壓住胎兒，直至羊水收獲干凈。相當(dāng)一部分病毒其羊水和尿囊液可以混合，如新城疫，支氣管炎、法氏囊病毒等。有些不能混合，則應(yīng)將兩者單收、單放。

絨毛尿囊膜：如要收獲整個(gè)尿囊膜，則在消毒、打開(kāi)蛋殼、撕去殼膜后，將整個(gè)卵內(nèi)容物倒出，這時(shí)絨毛尿囊膜貼在卵殼內(nèi)壁上，用鑷子夾住將其撕脫下來(lái)即可。胚胎：消毒、打開(kāi)氣室卵殼后，用鑷子撕破卵殼膜和絨毛尿囊膜，夾起胚胎，用剪刀剪斷卵黃帶，將胎兒放滅菌容器內(nèi)即可。8.雞胚接種注意事項(xiàng)（1）接種材料一般都應(yīng)按每毫升1000ＩＵ或μg加入青、鏈霉素。（2）接種位點(diǎn)應(yīng)避開(kāi)雞胚、血管和胚頭，以免針頭刺傷雞胚而造成接種后的損傷性死亡。（3）接種點(diǎn)最好選在胚頭左側(cè)，因