免疫學(xué)實驗技術(shù)概述課件

第九章免疫學(xué)實驗技術(shù)概述血清學(xué)反應(yīng)：體外發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)。第一節(jié)體液免疫的檢測——血清學(xué)反應(yīng)所有血清學(xué)反應(yīng)類型的基本原理都萬變不離其宗：抗原抗體反應(yīng)的特異性。二、血清學(xué)反應(yīng)的一般規(guī)律(一)特異性Ab只能與相應(yīng)Ag特異結(jié)合。Ag表面常具有多個(多種)不同表位，所以免疫血清中也應(yīng)含有相應(yīng)多種特異性Ab。（二）交叉性交叉抗原：不同的Ag物質(zhì)之間存在相同的Ag表位時，稱為交叉抗原。交叉反應(yīng)：用不同抗原制備的抗血清除與各自的相應(yīng)Ag發(fā)生反應(yīng)外，尚能與對方Ag發(fā)生反應(yīng)。通常兩種Ag之間親緣關(guān)系越近，交叉反應(yīng)程度越高。AB抗原與抗體的結(jié)合的交叉性(三)用已知測未知所有血清學(xué)反應(yīng)都毫無例外地是用已知Ag測未知Ab或用已知Ab測未知Ag。用已知測未知的依據(jù)：抗原抗體的反應(yīng)是特異的。正確理解實驗原理或進(jìn)行試驗設(shè)計的關(guān)鍵是搞清楚什么是已知，什么是未知，誰是抗原身份，誰是抗體身份，誰是身兼兩職的。IBV包被雞抗NP蛋白IgG加IBV或被檢加兔抗IBVIgG加羊抗兔IgG-HRP加底物顯色夾心ELISA競爭ELISA3．氫鏈此力由兩個共價結(jié)合的氫原子間發(fā)生，H原子與一個帶負(fù)電荷的原子共價結(jié)合，與另一個帶負(fù)電荷的非共價電子對相互作用，形成了氫鏈。

此力較弱，但較特異，此外還有疏水作用(如苯環(huán)具有疏水性)?？傊瓵g-Ab結(jié)合不僅要求結(jié)構(gòu)上互補，構(gòu)型上適應(yīng)，電荷上相反，方能結(jié)合，結(jié)合后，由親水膠體→憎膠體，此時如果Ag·Ab復(fù)合物電荷相同，則同性相斥，仍分散于溶媒中，如果有適當(dāng)濃度電介質(zhì)存在，可消除電荷，從而促進(jìn)其凝集或沉淀。任何抗血清中均含高親合力Ab和低親合力Ab，上述親合力在生理性pH離子強度中通常最大。

Ag-Ab結(jié)合的離解力，指Ag-Ab結(jié)合具有可逆性，因為Ag-Ab之間靠非共價結(jié)合，因此在一定條件下可使其解離。解離后的Ag-Ab仍保留其原有活性。

(六)結(jié)合比例

Ag與Ab的結(jié)合常需適當(dāng)比例才出現(xiàn)可見反應(yīng)，在最適比例時反應(yīng)最明顯；這種現(xiàn)象可以用“格子學(xué)說”來解釋：Ab(1gG)為二價，Ag通常為多價，只有Ag，Ab結(jié)合形成大的復(fù)合物，肉眼才可見；(七)血清學(xué)反應(yīng)的影響因素1．電介質(zhì)：生理鹽水，緩沖鹽水，少數(shù)動物(禽)血清用8.5％NaCl；2．溫度；3．pH：pH6.0～8.0四、血清學(xué)試驗的制定原則制定特定的或建立新的血清學(xué)方法時，應(yīng)注意以下原則：(一)Ag準(zhǔn)備和提純1．購自試劑公司：如半Ag、激素、酶、農(nóng)藥、抗生素、昂貴的天然Ag等。2．自制：一般天然Ag、動物血清、組織Ag等，(二)Ab制備提純1．顆粒性Ag，遞增3～4次、間隔一周可溶性Ag，加佐劑2．提純：用作標(biāo)準(zhǔn)、致敏或特殊用途(七)敏感性試驗最小檢測量或最小反應(yīng)靈敏度(八)重復(fù)性試驗：該試驗是結(jié)果可信度和試驗標(biāo)準(zhǔn)化程度的重要指標(biāo)之一。每批材料對每份樣品至少做四個重復(fù)。計算批內(nèi)變異系數(shù)。不同批的材料，應(yīng)對同樣樣本進(jìn)行復(fù)試，計算批間變異系數(shù)。(九)穩(wěn)定性試驗提供商品試劑盒所必須五、血清學(xué)試驗的應(yīng)用(一)血清學(xué)診斷(二)生物活性物質(zhì)超微定量(三)Ag/Ab亞細(xì)胞、細(xì)胞水平定位(四)Ag組分分析，如病毒結(jié)構(gòu)蛋白可用免疫轉(zhuǎn)印，免疫沉淀(瓊擴、電泳、交叉免疫電泳等)(五)物種鑒定分型

六、血清學(xué)試驗的類型（一）沉淀反應(yīng)：環(huán)狀沉淀試驗雙向瓊脂擴散免疫電泳原理：

可溶性Ag與Ab在含有電解質(zhì)的半固體（1%）瓊脂內(nèi)進(jìn)行自由擴散，當(dāng)兩者由高濃度向低濃度擴散相遇時，如果二者相對應(yīng)而且比例適當(dāng)，則可在相遇處形成白色的沉淀線，為陽性反應(yīng)。另外，沉淀帶對于組成它的Ag、Ab具有特異地不可透過性，而對其它的Ag與Ab是可透過的，所以一條沉淀帶僅代表一種AgAb系統(tǒng)的沉淀物。雙向瓊脂擴散試驗（二）凝集反應(yīng)：原理：顆粒性抗原（如細(xì)菌、立克次氏體、螺旋體、紅細(xì)胞或細(xì)胞懸液）或表面覆蓋抗原或抗體的顆粒狀物質(zhì)，與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合后，在有電解質(zhì)存在時，抗原（顆粒）互相凝集成肉眼可見的凝集小塊，稱為凝集反應(yīng)。直接凝集：平板、試管間接凝集：間接血凝、炭凝、乳膠凝集病毒的血凝和血凝抑制試驗玻片凝集試驗血凝和血凝抑制試驗Hemagglutination(HA)andHemagglutinationInhibition(HI)原理許多病毒（正粘病毒、副粘病毒等）能凝集某些動物（雞、人等）的紅細(xì)胞，這種現(xiàn)象稱為紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，簡稱血凝。當(dāng)這些病毒與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，失去了與紅細(xì)胞凝集的能力，稱為紅細(xì)胞凝集抑制。血凝和血凝抑制試驗Hemagglutination(HA)andHemagglutinationInhibition(HI)HIHA棄501．做標(biāo)記；2．加生理鹽水；3.第1孔加NDV，然后倍比稀釋；4．加紅細(xì)胞；5．立即振蕩2min，靜置20－30min；6.觀察結(jié)果。++++為全部血球發(fā)生凝集，呈顆粒狀薄膜鋪于孔底；

+++約有75％血球發(fā)生凝集；

+約有25％血球發(fā)生凝集；

++約有50％血球發(fā)生凝集；－不凝集，表現(xiàn)為血球沉于孔底，呈一致密小圓點，與對照孔相同。（一）血凝試驗（HA）（二）血凝抑制試驗（HI）棄50μL1．做標(biāo)記；2.第1孔加8U抗原和被檢血清；3.從第1孔取樣50μL，然后倍比稀釋；4.室溫靜置10min；5．加紅細(xì)胞,立即振蕩2min，靜置20－30min;6.觀察結(jié)果。結(jié)果記錄中的-、+、++、+++、++++和HA中的相同

（三）補體結(jié)合反應(yīng)技術(shù)

（complementfixationreactiontechnique）（四）標(biāo)記技術(shù)：同位素標(biāo)記熒光標(biāo)記：化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)酶標(biāo)記：組化法、測定法（ELISA）膠體金標(biāo)記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），簡稱ELISA。原理：簡單地說是利用抗原-抗體反應(yīng)的高度特異性和酶反應(yīng)的高度敏感性，進(jìn)行對抗原或抗體的檢測，是一種定性或定量的綜合性技術(shù)。IBV包被雞抗NP蛋白IgG加IBV或被檢加兔抗IBVIgG加羊抗兔IgG-HRP加底物顯色夾心ELISA夾心ELISA間接ELISA競爭ELISA

20世紀(jì)80-90年代在酶聯(lián)免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展了新型體外診斷技術(shù)。具有簡單、快速、成本低、可通過肉眼判定結(jié)果、無需特殊設(shè)備、攜帶方便等和無污染等優(yōu)點，有濃縮的ELISA之稱，。膠體金免疫層析技術(shù)90年代傳入我國以來，在醫(yī)學(xué)方面得到了日益廣泛的應(yīng)用。已經(jīng)用于檢測HBsAg（乙肝）、HCG（早孕）、HIV（艾滋?。?、梅毒等疾病的快速診斷，我國已經(jīng)有幾十家藥廠生產(chǎn)醫(yī)學(xué)檢驗用的金標(biāo)試紙。目前，該項技術(shù)已被應(yīng)用于動物疫病的檢測與藥物殘留分析等。

膠體金（colloidalgold）也稱金溶膠（goldsol），是金鹽被還原成原子金后形成的金顆粒懸液。HAuCl4溶液還原劑膠體金膠體金

膠體金顆粒對蛋白質(zhì)有很強的吸附功能，而不被壞其生物活性，可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白等非共價結(jié)合，形成膠體金標(biāo)記物。用于免疫測定時膠體金多與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）結(jié)合，這類膠體金結(jié)合物常稱為免疫金復(fù)合物，或簡稱免疫金（immunogold）。

類別應(yīng)用領(lǐng)域檢測的物質(zhì)人類醫(yī)學(xué)各級醫(yī)院,血站,CDC,防疫站,診斷中心；家庭自檢；商檢系統(tǒng)；邊檢口岸；公安系統(tǒng).傳染?。ㄒ腋挝屙?HIV,SARS等）標(biāo)志物（AFP、肌鈣蛋白、糞便血紅蛋白等）女性妊娠hCG(早孕)毒品（嗎啡,K粉,搖頭丸,冰毒）農(nóng)牧業(yè)畜牧獸醫(yī)站,商檢系統(tǒng),邊檢口岸,農(nóng)牧類院系和研究所傳染?。ㄇ萘鞲?鏈球菌等）病毒（煙草花葉病毒、犬細(xì)小病毒等）環(huán)境環(huán)保監(jiān)測部門,研究機構(gòu)有害物質(zhì)超標(biāo)食品安全食品安全檢測中心,各監(jiān)管部門農(nóng)獸藥殘留（磺胺類、瘦肉精等）,大腸桿菌,黃曲霉素應(yīng)用

目前，膠體金免疫層析法在獸醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用也越來越廣泛，主要在通過抗原及抗體的檢測由于疾病的診斷，如雞傳染性法氏囊?。ㄓ诤５龋?004；張改平等，2004）、雞新城疫（高玲美等，2004；戴榮四等，2006；李希友等，2006）、禽流感（沈浩龍等，2006；蔡家利等，2006）、雞減蛋綜合征（王愛華等，2005）、鴿禽Ⅰ型副黏病毒病（郝桂蘭等，2005）、豬圓環(huán)病毒（金顏輝等，2007）、豬瘟（金顏輝等，2004；鄭鳴等，2006）、偽狂犬?。S印堯等，2004；邊傳周等，2006）、豬繁殖與呼吸綜合征（崔尚金等，2005）、口蹄疫（張長弓等，2004）、豬囊蟲病（唐雨德等，2003）、豬旋毛蟲(Zhangetal.，2006）、犬細(xì)小病毒?。ㄍ踔辛Φ?，2004）、牛布魯氏菌?。ㄌ凭胺宓?，2007；洪林娣等2007）、牛病毒性腹瀉病毒（Kameyamaetal.，2006）、羊布魯氏菌?。ㄌ凭胺宓?，2006）、沙門氏菌（Kun-HoSeoetal.，2003；陳瓊等，2006）、大腸桿菌（諶志強等，2005；王靜等，2006）、利什曼原蟲（Robertoetal.，2003；Mohebalietal.，2004）、炭疽桿菌芽孢（李偉等，2004）；以及用于牛初乳中IgG含量（劉春龍等，2006；李忠秋等，2006）。夾心法反應(yīng)原理（檢測抗原）C陰性B陽性GICA有三種反應(yīng)模式：夾心法，間接法，競爭抑制法。H9亞型AIV抗原檢測試紙條ThereferenceH9AIVtiterwas26andthe