crisper-cas9技術(shù)篩選基因敲除細(xì)胞系陽(yáng)性克隆protocol

ZFN、TALENZFN、TALEN、篩選敲除細(xì)胞系陽(yáng)性克隆[深夜吐血整理，有一無(wú)二2011TALEN技術(shù)，2013CRISPR/Cas9技術(shù)，這些技術(shù)的迅速成來(lái)給科學(xué)研究及治療研究帶來(lái)更為廣泛的發(fā)力這在2014年以來(lái)的頻頻出現(xiàn)的Cas9技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展中可以清晰看到。歡迎感的朋友交流這些方面的進(jìn)展。注出來(lái)剔除篩選之外。傳兩代后，取出單個(gè)克隆的一部分細(xì)胞提取組DNA。分析敲除位點(diǎn)的上下游序列，設(shè)計(jì)合適的引物，并從提取的組中擴(kuò)出目的片段，然后選擇部分陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR產(chǎn)物或做T載克隆送進(jìn)行最終確認(rèn)。Surveyorassay試劑盒由于假陽(yáng)性過高及過于昂甄別，土豪請(qǐng)忽略。(*^^*)ZFN、TALEN、敲除細(xì)胞系陽(yáng)性克隆ZFN、TALEN、敲除細(xì)胞系陽(yáng)性克隆Protocol[有一無(wú)二篩[深夜吐血整理，有一無(wú)二戰(zhàn)友可以參考認(rèn)真閱讀一下。其他如下，供參考。歡迎戰(zhàn)友們補(bǔ)充。土豪Surveyorassay的kit/diagnostic-tools/genetic-ysis-kits/surveyor-mutation-detection-kits轉(zhuǎn)染的時(shí)候就按照轉(zhuǎn)染試劑的DNA用量轉(zhuǎn)染就可以目前有Cas9和gRNA分別在兩個(gè)不同DNA用量摩爾比例1：1。設(shè)計(jì)上下游引物時(shí)，PCR產(chǎn)物的大小最好是四五百bp長(zhǎng)比較合適，gRNA的ing位點(diǎn)并不需要正好在PCR產(chǎn)物的中間。做surveyorassay時(shí)用的Pix就是用的Sigma的JumpStartReadyMix這個(gè)是熱啟動(dòng)的96孔板之后大概一個(gè)星期能長(zhǎng)出大小比較合適的單克隆，因?yàn)榉旨?xì)胞的時(shí)候不能保證完全們將96孔板里的單克隆消化下來(lái)再轉(zhuǎn)到一個(gè)新的96孔板里，長(zhǎng)滿之后1/4-1/5再傳代，剩下的細(xì)胞裂解之后提組DNA做surveyorassay。挑克隆鑒定的工作量比較大。收藏給您的好友、同事、同學(xué)及等。好東西請(qǐng)別自己獨(dú)自藏著掖著。[深夜吐血整理，有一無(wú)二科學(xué)研究之我見，供參考。歡迎戰(zhàn)友們補(bǔ)充。土豪做朋友吧。嘻嘻！現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)被很快開發(fā)并運(yùn)用到的敲低工作中來(lái)，雖然不能達(dá)到徹底敲除的目的，但至少在做過癌細(xì)胞株相關(guān)的工作的科學(xué)家一定看過或者一定知道癌組的Variety是非常大的，很多時(shí)候?qū)﹂T養(yǎng)的Hela細(xì)胞或者293T細(xì)胞和自己養(yǎng)的情況都不一定一樣。的各種針對(duì)2中的考慮，如果所研究的恰恰與癌細(xì)胞株的種種變異相關(guān)上，在此癌細(xì)胞株上做所感的功能對(duì)于癌細(xì)胞本身的生長(zhǎng)等是否會(huì)造成影響，這點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)其實(shí)對(duì)于做敲除數(shù)據(jù)參考，有時(shí)或高或低。如果一次很難獲得敲除純合子的癌細(xì)胞克隆，癌細(xì)胞無(wú)法實(shí)現(xiàn)小鼠繁育類似的雜合子間交配shRNA，費(fèi)有限情況下的特殊時(shí)期的“無(wú)奈”選擇。那個(gè)年代獲得修飾動(dòng)物及飼養(yǎng)動(dòng)物成本要肯定遠(yuǎn)RNAi技術(shù)所在的一個(gè)特殊歷史階段，科學(xué)家無(wú)法很快及較低成本做到細(xì)胞系或小鼠水皮上如果土豪您有能力請(qǐng)告訴您的心聲截止2014年獲得CRIS