酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法課件

酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法

測定血清中甲胎蛋白含量

臨床八年1205班2組陳旭陳楷李皓一、實驗?zāi)康?/p>

1掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的原理2熟悉酶聯(lián)免疫吸附實驗的操作方法二、實驗原理基礎(chǔ)知識

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者Van

Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)。原理一

ELISA的基礎(chǔ)是抗原（或抗體）的固相化及抗原（或抗體）的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原（或抗體）仍保持其免疫學(xué)活性。原理二

抗原(或抗體)可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性。原理三

固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。ELISA的三條基本原理雙抗體夾心法方法

用已知抗體包被，加入待測抗原，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色。

固相(包被)抗體Ab+樣品(抗原Ag)+酶標(biāo)抗體Ab*→Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)→顯色應(yīng)用

這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結(jié)合的部位，因為其一端要與包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。雙抗體夾心法圖示1、已知抗體包3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的底物2、加腫瘤患者血4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包2、加健康人血清3、加酶標(biāo)抗體+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY三、實驗儀器&試劑儀器

全自動酶標(biāo)儀、全自動酶標(biāo)洗板機(jī)四、實驗步驟獲得AFP未標(biāo)定抗體將AFP抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白加血清形成固相抗體－抗原復(fù)合物詳細(xì)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μ，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。辣根過氧化物酶(HRP)常用底物：(1)鄰苯二胺(OPD)：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性。(2)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：TMB是一種脂溶性較強(qiáng)的基團(tuán)，由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深藍(lán)色沉淀物反應(yīng)后呈藍(lán)色。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，最適吸收波長為450nm。五、結(jié)果分析以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。六、思考題試驗中哪些因素可能會對實驗結(jié)果造成影響？（一）固相載體（二）抗原（三）試驗樣品（四）結(jié)合物(五）洗滌劑與稀釋劑（六）底物（七）作用時間(八)試驗的重復(fù)性（精確度）（九）對使用儀器要求六、應(yīng)用檢查抗原半抗原1.內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等2.在血液學(xué)方面可用于檢查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、紅細(xì)胞抗原及結(jié)合球蛋白（HaptoGlobin）等檢查抗體1.在寄生蟲病方面，它用于對瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、旋毛蟲病等