利用殼聚糖涂層的自身免疫活性促進帶孔聚己內(nèi)酯支架中血管、骨和軟骨的生成

17/17利用殼聚糖涂層的自身免疫活性促進帶孔聚己內(nèi)酯支架中血管、骨和軟骨的生成

聚(ε-己內(nèi)酯)(PCL)作為性能良好的聚合物受到了廣泛關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)非炎性殼聚糖涂層促進軟骨浸潤到PCL支架內(nèi)及其上方，并且與骨小梁整合兼容。體外成骨試驗預測骨整合到多孔支架中的能力有限，因為在體內(nèi)，編織骨從再生骨小梁的前緣整合，而不是從粘附在支架表面的間充質(zhì)細胞整合，并且生物活性涂層吸引炎癥細胞而誘導骨吸收。

01、研究內(nèi)容簡介

骨組織工程（BTE）策略旨在控制聚合物結(jié)構(gòu)和生物活性，以促進骨生長成多孔支架。盡管在結(jié)構(gòu)設計方面取得了很大進展，但在理解如何引導骨髓細胞和血管向內(nèi)遷移和分化，以在多孔支架深處形成礦化組織方面仍然存在挑戰(zhàn)。PCL作為首選的生物相容性聚合物受到了廣泛關(guān)注，部分原因是生物塑料可以熔化形成不同的形狀，支持間充質(zhì)干細胞(MSCs)在體外的細胞浸潤和成骨，并允許體內(nèi)編織骨沉積（在外源細胞或生物活性因子的幫助下）?？讖绞怯绊戵w內(nèi)骨整合到不同材料中的一個重要因素?？讖健?00μm的支架顯示出有限的血管化，同時促進軟骨形成。血管化的骨會自發(fā)地滲入具有>100μm-850μm孔的支架中，但通常僅限于外孔。

此前的研究開發(fā)了具有完全互連孔和精確孔徑的PCL支架，以評估其潛力在BTE應用中。PCL具有抑制細胞附著的疏水表面，這是體外成骨所必需的。因此，制定了一種用親水性陽離子材料涂覆PCL支架孔表面的方法。這是通過聚電解質(zhì)（PDADMAC作為聚陽離子和PSS作為聚陰離子）的逐層自組裝實現(xiàn)的。當PCL支架涂有99%脫乙酰度(DDA)殼聚糖時，骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)滲入PCL孔，在3D體外成骨試驗中產(chǎn)生更多礦化基質(zhì)?；谶@些有希望的結(jié)果，本研究的目的是使用已建立的骨骼成熟的兔骨軟骨修復模型，評估99%DDA殼聚糖涂層對PCL支架體內(nèi)成骨的影響。

在這項研究中，作者認為血腫是植入后第一個占據(jù)BTE支架的組織。最近的數(shù)據(jù)表明，結(jié)構(gòu)不同的殼聚糖具有不同的先天免疫激活潛力，可用于指導骨折修復反應。99%DDA殼聚糖微粒在體外可在人巨噬細胞中誘導抗炎反應，包括釋放干擾素α和白細胞介素1受體拮抗劑。因此，作者使用99%DDA10kDa殼聚糖來涂覆PCL支架，因為它具有細胞粘附性、非炎癥性和體內(nèi)潛在的抗炎活性。相比之下，約80%DDA殼聚糖微粒（但不大于95%DDA）在摻入血腫時會特異性吸引中性粒細胞和巨噬細胞并刺激血管生成。因此作者通過將不同的PCL支架壓入骨骺微鉆缺損中以驗證以下假設：當涂有99%DDA殼聚糖時，具有完全連通孔的PCL支架在體內(nèi)骨整合更多，而當涂有99%DDA殼聚糖+83%DDA殼聚糖微粒時，血管生成和成骨更多。僅鉆孔缺陷作為自發(fā)修復的對照并在手術(shù)后6周分析了每種情況下6個骨軟骨缺損的初始缺損和修復組織。

多孔PCL和殼聚糖涂層的制備：淬火后的45vol%PCL/55vol%PEO混合物分別退火1.5、2.0和2.5小時制造具有完全互連孔的PCL支架圓柱體，其中2小時退火周期獲得的155μm±8μm孔徑符合目標（圖1a和b）。直徑3毫米，厚2毫米的PCL圓柱體用交替的聚電解質(zhì)逐層處理，然后用99%DDA殼聚糖與結(jié)構(gòu)匹配的殼聚糖熒光示蹤劑相結(jié)合(99PCL)。所有99-PCL支架表面均涂有99%DDA殼聚糖（約1-3μm厚的涂層，圖1c）。將不含熒光示蹤劑99-PCL支架浸泡在含有83%DDARITC-殼聚糖示蹤劑（83-99-PCL）的稀釋83%DDA殼聚糖中，在99PCL支架表面上獲得了均勻的83%DDA殼聚糖表面涂層（圖1d）。可溶性83%DDA殼聚糖留在83-99-PCL孔隙空間中，以生產(chǎn)殼聚糖微粒。

Fig.1.FabricationofporousPCLandchitosancoatings.(a)Scaffoldblendsof45%PCL/55%PEOannealedfor1.5,2or2.5hyieldedaverageporesizesof95±4μm,155±8μmand182±10μm,respectively.(b)SEMimageat75×magnificationofaPCLscaffoldwithaverage155μmporediameter.Epifluorescentimagesof(c)99-PCL(withRITC-99%DDAchitosantracer)and(d)8399-PCL(coatedwithunlabeled99%DDAchitosanandthen83%DDAchitosancontainingRITC83%DDAchitosantracer).

“不對稱”凝塊趨化性測定：

分析先天免疫細胞-支架相互作用（圖2）。在37°C的1小時內(nèi)，外周血凝塊細胞“蜂擁”到83-99-PCL支架上，與99PCL和PCL相比，支架周邊的細胞密度高出2倍（p<0.05，圖2a-c)，83-99-PCL凝塊收縮卻與另外3組凝塊收縮相似（圖2d）。如圖2e和2f所示，凝塊細胞可以吞噬部分99%DDA殼聚糖涂層。至于83%DDA殼聚糖微粒，接近支架時越來越多地被吞噬細胞清除，最強烈的紅色熒光細胞占據(jù)孔隙并沿著83-99-PCL支架周邊聚集（圖2g），即在體外血腫中對83-99-PCL有選擇性促炎趨化反應。

Fig.2.Invitrobloodclot-scaffoldinteractionsafter1hofinvitrocultureat37?C.Rabbitbloodclot/scaffoldcryosections(a)unstainedor(b)SafraninO/Fastgreenstained,(c)clotcelldensity(n=6)and(d)%clotretraction(n=3).EpifluorescentimagesofclotsamplesshowingRITC-chitosan(red)andHoechst33258-stainedcellnuclei(greyscale),for(e)PCL/clot,(f)99-PCL/clotand(g)83-99-PCL/clotwithchitosanmicroparticles(arrowheads,g1inset),clotcells(arrows,openarrowheads),andcellclustersattheedge(g2,inset).Symbols:opentriangles:clotcellsinsidethepores,whitearrows:clotcellsnearthescaffoldedge,whitearrowheads:83%DDAchitosanmicroparticles.Scalebars:(a,b)1mm,(c,d)200μm,(e,f,g)100μm.

宏觀表現(xiàn)：

在將支架植入出血滑車微鉆孔后，軟骨下血液以與缺陷出血強度（輕、中、重）平行的不同速率滲入PCL孔，與殼聚糖涂層無關(guān)（圖3）。在術(shù)后第1天，與支架相比，骨軟骨缺損術(shù)中出血、血腫形成和術(shù)后短暫的膝關(guān)節(jié)積液對6周修復組織的宏觀外觀影響較小(圖3a-d)。修復6周后，對照組被白色修復組織覆蓋，該組織也覆蓋了大部分99-PCL支架。許多單純PCL和83-99-PCL植入物具有暴露的支架（空心箭頭，圖3f-h）。83-99-PCL修復組織呈紅色，提示血管生成（粗黑箭頭，圖3h）。股骨遠端外緣偶爾可見骨贅。所有膝關(guān)節(jié)滑液清澈，無積液跡象，外周血細胞計數(shù)正常。愈合6周后，兔子活動正常，膝蓋沒有感染跡象。

Fig.3.Osteochondraldefectintra-operativebleeding,hematomaformationandtransientpost-operativekneeeffusionhadminoreffectscomparedtoscaffoldonmacroscopicappearanceof6weekrepairtissues.Panelsshowvariablebleedingindrillholes(a-b)beforeandafterimplantingthescaffolds,(c)hematomaformationatday1,and(d)cumulativepost-operativekneeeffusionscoresandrepresentativemacroscopicappearanceofrepairtissuesfor(e)83-99-PCL,(d)99-PCL,(g)PCL,(h)drill-only.Symbols(e-h)Thickblackarrow:angiogenictissue;openarrows:exposedPCLbioplastic,thinarrows:cartilagerepairtissue.

組織學及影像學表現(xiàn)：植入體內(nèi)一天后，PCL支架孔表面檢測到殼聚糖涂層，而83%DDA殼聚糖微粒被置換到孔中支架凝塊的頂部，這表明來自關(guān)節(jié)腔方向的軟骨下出血的壓力將顆粒向上推到骨板區(qū)域（圖4紅色信號）。在83-99PCL、99-PCL和PCL支架下方鉆孔的彎曲底部形成血腫（圖4c，f，圖5）。在該區(qū)域，細胞在83-99-PCL下方被耗盡，只在支架邊緣發(fā)現(xiàn)（圖4c黑色箭頭）。骨折血腫細胞更均勻地分布在99-PCL、PCL和單純鉆孔缺陷的下方（圖4f）。在83-99-PCL和99-PCL支架內(nèi)和周圍觀察到含有熒光RITC-殼聚糖的吞噬細胞（圖4a，d白色箭頭）。這些數(shù)據(jù)進一步支持了這樣的假設，即83-99-PCL支架對血腫吞噬細胞具有趨化性，并且吞噬細胞可以攝取兩種殼聚糖涂層。

Fig.4.Hematomaphagocytesswarmedto(a-c)83-99-PCLandnot(d-f)99-PCLscaffoldsafter1dayinvivo.Theredsignalshows(a)83%DDAor(d)99%DDAchitosanand(b,e)matchingnonspecificgreenepifluorescenceofthehematomaofthesamefield.Panels(c&f)showToluidineblue/vonKossastainedhematomabelowthescaffolds(PCLpolymerisindicatedby(*)wherehematomacells(bluestain)weredisplacedtowards(c)83-99PCLandnot(f)99-PCL.Symbols:(a,b,d,e)openarrows:chitosancoating;*=PCLpolymer;openarrowheads:detachedchitosancoating;thinwhitearrows:phagocyteswithinternalizedRITCchitosan;(c,f)blackarrows:hematomacells.Scalebars:250μm.

術(shù)后6周，純鉆頭缺損顯示出持續(xù)的經(jīng)典自發(fā)性軟骨內(nèi)修復反應，其中鈣化軟骨的核心正經(jīng)歷著來自周圍骨小梁的強烈的血管性骨入侵（圖5，6a-b）。當分析平均橫截面積時，單純?nèi)睋p在缺損邊緣和中部附近時軟骨下鈣化軟骨較多（圖7a）。發(fā)現(xiàn)主要是軟骨組織從骨板的孔隙中浸潤出來，并不同程度地覆蓋在PCL和99-PCL支架上（圖5和6）。這些修復組織的形態(tài)表明，軟骨是由緊鄰骨小孔的間充質(zhì)干細胞生長形成的。與PCL相比，軟骨下軟骨平均滲入99-PCL孔隙更遠（圖5和6c-d&7a）。83-99PCL支架孔隙以及支架中間明顯沒有軟骨，邊緣有0.2mm2的軟骨下軟骨（圖5和6f-g&7a）。

觀察到83-99-PCL有強烈的血管生成反應，血管圍繞著整個支架的孔隙并完全浸潤其中（圖5o、5和6g紅色組織）。單純?nèi)睋p和83-99-PCL缺損的血管長度密度（Lv）相似（圖7b），然而單純?nèi)睋p的血管被礦化組織包裹（圖6b），而83-99-PCL的血管則被非礦化纖維組織或未分化的間質(zhì)包裹（圖6g1，g2）。與PCL或99-PCL相比，單純?nèi)睋p修復組織和83-99-PCL孔隙組織所含的血管Lv明顯升高（圖7b）。綜上所述，親炎癥的83%DDA殼聚糖刺激了整個PCL支架孔的血管生成，并抑制了軟骨生成和成骨。

SafraninO（SafO）染色的軟骨修復組織重現(xiàn)缺陷與作為解釋變量的軟骨下面積呈正相關(guān)（R2=0.44，P<0.0001）。在這項研究中，單純?nèi)睋p在修復6周后顯示出良好的SafO染色的軟骨再生（圖5、6a和7c）。覆蓋支架的軟骨修復組織較少，83-99-PCL上的軟骨最少，PCL中間的軟骨較少（圖7c）。99%DDA殼聚糖的主要影響是，在支架中間上方的SafO+軟骨復位與單獨的PCL相比，保持3倍以上的SafO+軟骨復位（圖7c）。這種效果部分是由于純PCL支架中間的軟組織重鋪不理想（圖7d）。

根據(jù)對鉆孔中礦化組織再生的顯微CT測量（圖8），初始缺損的骨量分數(shù)在單純?nèi)睋p修復6周后顯著增加，用PCL或99-PCL的缺損略高，而83-99-PCL則較低（圖8f）。最初的缺損鉆孔橫截面積為7.5mm2，在單純?nèi)睋p中，頂部縮小到3.5mm2，在0.5mm深的骨小梁處縮小到1mm2（圖8g）。在6周修復的PCL和99-PCL缺損中，殘留的鉆孔面積略微縮小至6.5mm2，與第1天的缺損沒有明顯區(qū)別。相比之下，83-99-PCL缺損的鉆孔橫截面積凈增1毫米（圖8g）。在6個支架中的4個中，編織的骨質(zhì)滲入99-PCL和PCL孔隙深處0.3-1毫米。在所有的支架孔隙表面（99-PCL、PCL和83-99-PCL）都檢測到骨髓來源的細胞附著。因此，殼聚糖涂層對于細胞在體內(nèi)粘附到疏水性PCL孔隙表面是不必要的。

Fig.5.NondecalcifiedhistologyatthedefectedgeormiddleshowingahematomafillingPCLporesatDay1andbonemarrowderivedrepairtissuesfillingtheporesat6weekspost-operative.Panelsshow(a-d)Drill-only,(e-h)PCL,(i-l)99-PCL,(m-p)8399-PCLnon-decalcifiedplasticsections,stainedwithSafO-fastgreen(Edge:a1,c1,e1,g1,i1,k1,m1),vonKossa/Toluidineblue(edgeandmiddle:b,d,f,h,j,l,n,p)orGoldnerTrichrome(Edge:o1;Middle:a2,c2,e2,g2,i2,k2,m2,o2).SafOstainscartilagetissuered,GoldnerTrichromestainsbonegreenandnewlydepositedbone,bloodvesselsandcartilagepink/red,vonKossa/Toluidinebluestainsmineralizedcartilageandboneblack,cartilagetissuepurple.Scalebar:1mm.

Fig.6.High-magnificationhistologyofrepresentative6weeksubchondralrepairtissuesstainedwithToluidineblue-vonKossa(a,c,d,e,g2)orGoldnertrichrome(b,f,g1).Drill-onlydefects(a-b)wereundergoingendochondralossificationwhereboneandbloodvesselsinvadecalcifyingcartilage.Scaffoldporetissues,hereshownfor99-PCL,included(c)cartilage,(d)calcifyingcartilage(CC),and(e-f)vascularnewwovenbone(NWB)orunmineralizedangiogenictissue.Angiogenicbloodvesselsin83–99-PCLwereoftenenvelopedinfibroustissue(F,inpanelsg1-g2).Symbols:Arrows:bloodvessels.CC:calcifiedcartilage;NWB:newwovenbone.F:fibroustissue.Scalebars:(a,f,g1,g2)250μm,(b,c,d,e)50μm.

Fig.7.Histomorphometryofsubchondral(a1-a2)cartilageinfiltration,(b1-b2)bloodvesselstereologyofangiogenesis(vessels/mm2),and%defectresurfacingwith(c1-c2)SafraninO+cartilageor(d1-d2)allsoftrepairtissuefromtransversesectionsnearthedefectedge(a1-d1)andmiddle(a2-d2).Graphsshowindividualdatapoints(dots),median(horizontalline),interquartilerange(box)andmin-max(whiskers),N=6.

Fig.8.Examplemicro-CTimagesofmineralizedtissueformationinmicrodrilldefectsatday1(a)and6weeks(b-e,conditionsasindicated),(f)measuresofbonevolumefraction(%)ina3mmdiameter2mmdeepvolumeofinterest,and(g)residualdrillholearea(mm2)atthedrillholetopand?0.5mmbelowthechondralosseousjunction(labeledas0,-0.5mm,panelg).Graphsshowindividualdatapoints(dots),median(horizontalline),interquartilerange(box)andmin-max(whiskers),N=6.Scalebar:1mm.

本研究受到少量生物復制、鉆孔中植入物位置相對于軟骨-骨連接處的微小差異以及6周終點持續(xù)修復的限制。關(guān)節(jié)運動產(chǎn)生的機械剪切力對支架表面重修具有可變且不受控制的影響，并且在解剖學上彎曲成滑車槽形狀的支架形狀可能改善了支架上的軟骨修復（圖9）。

Fig.9.Diminishedresurfacingoversomeproximaldefectswaspotentiallyduethecurvatureofthetrochleaa