分子生物學(xué)常用技術(shù)課件

第19章：分子生物學(xué)常用技術(shù)－－4學(xué)時分子雜交、PCR、基因測序蛋白質(zhì)研究技術(shù)(雙向電泳，酵母雙雜交)基因轉(zhuǎn)移與基因剔除(含RNA干擾)第20章：基因工程－－4學(xué)時第21章：基因診斷與基因治療－－4學(xué)時第四篇：分子生物學(xué)技術(shù)與應(yīng)用1ppt課件第19章：分子生物學(xué)常用技術(shù)－－4學(xué)時第四篇：分子生物學(xué)技術(shù)第十九章分子生物學(xué)常用技術(shù)2ppt課件第十九章分子生物學(xué)常用技術(shù)2ppt課件分子生物學(xué)技術(shù)能幫助我們干什么？揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)與功能DNA

水平：基因序列分析、拷貝數(shù)和染色體定位RNA

水平：定量分析、基因表達(dá)產(chǎn)物的可變剪接分析蛋白質(zhì)水平：蛋白質(zhì)定量、定位、功能細(xì)胞與整體水平：基因在活體中的功能目的：了解疾病發(fā)生的規(guī)律，提供治療與預(yù)防手段3ppt課件分子生物學(xué)技術(shù)能幫助我們干什么？揭示生物大分子(DNA、RN我們需要了解和掌握哪些基本技術(shù)？基本技術(shù)：核酸：測序、印跡、雜交、體外擴(kuò)增技術(shù)蛋白質(zhì)：電泳與印跡、組學(xué)技術(shù)、相互作用綜合技術(shù)：基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)基因生物與基因敲除技術(shù)應(yīng)用技術(shù)：基因診斷基因治療4ppt課件我們需要了解和掌握哪些基本技術(shù)？基本技術(shù)：4ppt課件Molecularhybridization:利用已知核酸序列(探針/probe)檢測與其互補(bǔ)的未知核酸序列用途：確認(rèn)核酸序列間同源性對特定核酸序列進(jìn)行定量自核酸混合體中辨認(rèn)特定核酸序列第一節(jié)：核酸分子雜交5ppt課件Molecularhybridization:第一節(jié)：核酸一、基本原理變性(denature)復(fù)性(renature)雜交(hybiridization)6ppt課件一、基本原理變性(denature)6ppt課件核酸變性在特定變性因素作用下，DNA雙螺旋解離的過程破壞氫鍵與疏水作用可導(dǎo)致變性熱變性：高溫可使核酸變性，溫度高于90℃時任何核酸雙鏈都將變性酸堿變性：pH<3或pH>11時核酸將變性，DNA使用堿變性，RNA則不可化學(xué)試劑變性：能夠破壞氫鍵的化學(xué)試劑如尿素或甲酰胺可使核酸變性7ppt課件核酸變性在特定變性因素作用下，DNA雙螺旋解離的過程7ppt變性溫度Tm：meltingtemperature，解鏈溫度或變性溫度影響變性溫度的因素：溶液的離子強(qiáng)度變性溫度與離子強(qiáng)度正相關(guān)，低鹽利于變性DNA分子的GC含量GC％＝(Tm－69.3)×2.248ppt課件變性溫度Tm：meltingtemperature，解鏈溫核酸復(fù)性變性的DNA單鏈相互識別并結(jié)合，恢復(fù)其天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程復(fù)性類似與化學(xué)反應(yīng)，需要一定反應(yīng)時間9ppt課件核酸復(fù)性變性的DNA單鏈相互識別并結(jié)合，恢復(fù)其天然雙螺旋影響DNA復(fù)性速度的因素DNA分子的濃度：濃度高，復(fù)性快DNA分子的長度：長片段復(fù)性速度慢DNA分子的復(fù)雜性：重復(fù)序列復(fù)性速度快不同物種C0t曲線比較

人類基因組C0t曲線10ppt課件影響DNA復(fù)性速度的因素DNA分子的濃度：濃度高，復(fù)性二、核酸探針Probe：用于測定未知核酸片段的已知序列探針為DNA

或RNA，可以為單鏈或雙鏈探針必需經(jīng)過標(biāo)記：放射性標(biāo)記或非放射性標(biāo)記11ppt課件二、核酸探針Probe：用于測定未知核酸片段的已知序列11p1.探針有哪些種類？DNA探針：常規(guī)探針利用基因組DNA序列或cDNA序列合成的探針，一般為雙鏈，也可制備成單鏈RNA探針：高靈敏度探針

一般是通過體外轉(zhuǎn)錄而來，均為單鏈寡核苷酸探針(oligo-nucleotide)：用于點(diǎn)突變檢測人工合成的短序列(~20nt)，可自由選擇序列12ppt課件1.探針有哪些種類？DNA探針：常規(guī)探針12ppt課件2.標(biāo)記物有哪些？標(biāo)記物的要求：高度的靈敏性：足以檢測到極微量的核酸序列高度的特異性：足以在大量非特異性序列中檢測到特異的靶序列標(biāo)記物的種類：放射性同位素(radioisotope)非放射性標(biāo)記物(non-radioactivelabel)13ppt課件2.標(biāo)記物有哪些？標(biāo)記物的要求：13ppt課件放射性同位素特點(diǎn)：靈敏度最高的標(biāo)記物，足以檢測到飛克級微量的核酸序列

g→mg→μg→ng→pg→fg常用的放射性同位素14ppt課件放射性同位素特點(diǎn)：靈敏度最高的標(biāo)記物，足以檢測到飛克級微量的放射性標(biāo)記的核苷酸單體dNTPorNTP5’or3’P32labelling15ppt課件放射性標(biāo)記的核苷酸單體dNTPorNTP15ppt課件非放射性標(biāo)記物特點(diǎn)：安全且易于存放，但靈敏度與特異性均不及放射性同位素地高辛：通過地高辛抗體結(jié)合并檢測生物素：結(jié)合親和素/鏈親和素(avidin/streptavidin)化學(xué)發(fā)光物質(zhì)：通過紫外激發(fā)或化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光電子密度標(biāo)記物：金等重金屬16ppt課件非放射性標(biāo)記物特點(diǎn)：安全且易于存放，但靈敏度與特異性均不及放3.如何檢測雜交信號？同位素標(biāo)記物：蓋革計數(shù)器、液體閃爍計數(shù)器放射自顯影(autoradiography)17ppt課件3.如何檢測雜交信號？同位素標(biāo)記物：17ppt課件如何檢測雜交信號？非放射性標(biāo)記物：酶聯(lián)免疫技術(shù)(enzymelinkedimmuno-assay)化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence)18ppt課件如何檢測雜交信號？非放射性標(biāo)記物：18ppt課件三、如何對核酸探針進(jìn)行標(biāo)記？19ppt課件三、如何對核酸探針進(jìn)行標(biāo)記？19ppt課件1.缺口平移nicktranslation:適用于標(biāo)記雙鏈DNA控制DNaseI的用量，可以控制探針的長度20ppt課件1.缺口平移nicktranslation:20ppt課2.非放探針的酶促標(biāo)記生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸單體通過酶促反應(yīng)可以參入探針21ppt課件2.非放探針的酶促標(biāo)記生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸單體通過3.非放探針的化學(xué)標(biāo)記利用光敏基因經(jīng)可見光照射直接與核酸結(jié)合22ppt課件3.非放探針的化學(xué)標(biāo)記利用光敏基因經(jīng)可見光照射直接與核酸結(jié)四、如何進(jìn)行雜交？樣品(DNAorRNA)吸附于支持物尼龍膜、硝酸纖維膜、載玻片等與標(biāo)記的探針雜交封閉液封閉后雜交，雜交爐中進(jìn)行緩沖液清洗控制溫度與變性劑濃度顯色放射自顯影/酶聯(lián)顯色23ppt課件四、如何進(jìn)行雜交？樣品(DNAorRNA)吸附于支持物2五、雜交有哪些不同的方式？斑點(diǎn)雜交：dothybridizationSouthern印跡雜交：SouthernblotNorthern印跡雜交：NorthernblotWesternblotting：不是雜交原位雜交：insituhybridization反Northern印跡雜交：reverseNorthernblot基因芯片/DNA微陣列：Genechip/DNAmicroarray24ppt課件五、雜交有哪些不同的方式？斑點(diǎn)雜交：dothybridizdothybridization將核酸樣品直接點(diǎn)在雜交膜上與探針進(jìn)行雜交特點(diǎn)：簡便但特異性不高可探測核酸含量，但無法得知分子大小25ppt課件dothybridization將核酸樣品直接點(diǎn)在雜交膜上SouthernblotEdwinSouthern創(chuàng)立的方法電泳技術(shù)與雜交結(jié)合，可顯示靶DNA序列的長度可進(jìn)行毛吸管轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移與電轉(zhuǎn)移26ppt課件SouthernblotEdwinSouthern創(chuàng)立電泳轉(zhuǎn)膜雜交27ppt課件電泳轉(zhuǎn)膜雜交27ppt課件Northernblot類似于Southern印跡雜交的方法，用于RNA檢測28ppt課件Northernblot類似于Southern印跡雜交insituhybridization原位雜交：特定mRNA的組織細(xì)胞分布29ppt課件insituhybridization原位雜交：特定mFISHFluorescenceinsituhybridization

(FISH)：特定基因的染色體定位30ppt課件FISHFluorescenceinsituhybri反Northern雜交與DNA芯片反Northern雜交：將探針DNA片段固定在雜交膜上，利用標(biāo)記物標(biāo)記的RNA進(jìn)行雜交31ppt課件反Northern雜交與DNA芯片反Norther第二節(jié)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR，polymerasechainreaction在體外選擇性擴(kuò)增特定DNA片段的高效手段70年代有人提出PCR的設(shè)想，因缺乏寡核苷酸的合成手段和適合的酶而無法進(jìn)行1984年KaryMullis發(fā)明PCR，并因此獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎全自動的熱循環(huán)儀和多種PCR衍生技術(shù)使其成為重要的科學(xué)研究手段32ppt課件第二節(jié)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR，polymerasechai一、PCR的基本原理在體外，以特定引物引導(dǎo)，通過DNA

聚合酶選擇性擴(kuò)增特定區(qū)域變性(denature)退火(anneal)延伸(extension)33ppt課件一、PCR的基本原理在體外，以特定引物引導(dǎo)，通過DNADNA的體內(nèi)復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈34ppt課件DNA的體內(nèi)復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’AUCGCG5’引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNA解旋解鏈引物合成DNA的體內(nèi)復(fù)制35ppt課件ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’AUCGCG5’TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶DNA解旋解鏈引物合成新鏈延伸DNA的體內(nèi)復(fù)制36ppt課件ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’變性復(fù)性加熱退火DNA加熱解鏈37ppt課件ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3模板DNA94℃38ppt課件模板DNA94℃38ppt課件55℃引物1引物2DNA引物39ppt課件55℃引物1引物2DNA引物39ppt課件引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶40ppt課件引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶40ppt課件第1輪結(jié)束94℃第2輪開始41ppt課件第1輪結(jié)束94℃第2輪開始41ppt課件72℃TaqTaqTaqTaq55℃42ppt課件72℃TaqTaqTaqTaq55℃42ppt課件第2輪結(jié)束43ppt課件第2輪結(jié)束43ppt課件重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

44ppt課件重復(fù)30輪后模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1-3步25-30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性新鏈延伸DNA的體外擴(kuò)增熱循環(huán)DNA解鏈45ppt課件1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200μmol/L引物各0.1-0.5μmol/L模板DNA

0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+

1.5mmol/LDNA的體外擴(kuò)增46ppt課件PCR反應(yīng)體系DNA的體外擴(kuò)增46ppt課件PCR技術(shù)的特點(diǎn)高度的靈敏性：理論上經(jīng)20循環(huán)可將目的基因片段擴(kuò)增220＝1000000倍高度的特異性：利用引物與模板的特異性配對，可保證擴(kuò)增的特異性一對20堿基長引物的多樣性為440＝1024應(yīng)用的廣泛性：目前已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究必不可少的手段操作的簡便性：不需要復(fù)雜的設(shè)備和繁瑣的流程47ppt課件PCR技術(shù)的特點(diǎn)高度的靈敏性：理論上經(jīng)20循環(huán)可將目的二、做PCR要有什么條件？酶：TaqDNA聚合酶模板DNA：可以為基因組DNA或cDNA引物：人工合成的寡核苷酸片段dNTP：聚合反應(yīng)的核苷酸單體緩沖液：包含特定的pH、離子強(qiáng)度和Mg2+反應(yīng)程序：變性、退火、延伸組成的循環(huán)儀器：DNA熱循環(huán)儀，或稱PCR儀48ppt課件二、做PCR要有什么條件？酶：TaqDNA聚合酶48DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)dNTP49ppt課件DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)dNTP49ppt課件1.什么是耐熱DNA聚合酶早期PCR曾使用DNA聚合酶I在高溫時發(fā)生變性，每一循環(huán)都需要重新添加酶延伸反應(yīng)溫度為37℃，非特異性太多目前常用

TaqDNA

聚合酶純化自嗜熱水生菌

(Thermusaquaticus)可耐受95℃高溫，最適反應(yīng)溫度為72℃左右50ppt課件1.什么是耐熱DNA聚合酶早期PCR曾使用DNATaqDNApolymerase在70~75℃范圍活性最佳，每秒可延伸150nt95℃時的半衰期為40min按變性時間1min計，能滿足30循環(huán)的反應(yīng)Taq酶具有5’→3’聚合活性和5’→3’外切活性不具備校讀活性，錯誤率為2×10－4左右錯誤合成的DNA片段可以作為模板，循環(huán)數(shù)越多，最終擴(kuò)增產(chǎn)物錯誤率越高只能用于檢測，不適合基因克隆51ppt課件TaqDNApolymerase在70~75℃范圍活有保真性的耐熱DNA聚合酶嗎？PfuDNApolymerase：常用的高保真耐熱DNA聚合酶有5’→3’

外切活性錯誤率約1×10－6適應(yīng)于基因克隆52ppt課件有保真性的耐熱DNA聚合酶嗎？PfuDNApolym2.如何設(shè)計寡聚核苷酸引物？引物(primer)是PCR反應(yīng)必備的前提，對PCR產(chǎn)物類型、長度和反應(yīng)的特異性具有決定作用PCR需要兩條引物，引物決定擴(kuò)增范圍和擴(kuò)增片段長度53ppt課件2.如何設(shè)計寡聚核苷酸引物？引物(primer)是PCR引物設(shè)計原則引物長度一般為15~30核苷酸引物太短影響雜交體的穩(wěn)定和特異性引物太長隨機(jī)匹配序列增多，特異性反而下降GC含量一般為40％~60％應(yīng)充分考慮退火溫度(annealingtemperature)GC含量低，退火溫度低，易出現(xiàn)非特異GC含量高，非特異性結(jié)合也會增加引物解鏈溫度粗略計算公式：

引物的解鏈溫度Tm＝4(G＋C)＋2(A＋T)54ppt課件引物設(shè)計原則引物長度一般為15~30核苷酸54ppt課件引物設(shè)計原則引物自身不應(yīng)該存在鏈內(nèi)互補(bǔ)序列，以防止出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)

兩條引物間、同一引物的分子間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列出現(xiàn)互補(bǔ)易導(dǎo)致引物二聚體的出現(xiàn)，影響擴(kuò)增效率55ppt課件引物設(shè)計原則引物自身不應(yīng)該存在鏈內(nèi)互補(bǔ)序列，以防止出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)引物設(shè)計原則避免引物與非特異序列間的同源性引物的3，末端必須與模板完全互補(bǔ)，5，末端允許添加非配對序列5，末端允許添加非匹配序列，如：酶切位點(diǎn)5’3’56ppt課件引物設(shè)計原則避免引物與非特異序列間的同源性5’3’56ppt3.如何選擇dNTP和緩沖液?dNTP是聚合反應(yīng)的底物常規(guī)使用濃度：0.2mMeach探針標(biāo)記時，可使用同位素或非放標(biāo)記的dNTP緩沖液：特定的pH和離子強(qiáng)度Mg2＋濃度一般為1.5mMPCRmix：預(yù)制的便捷反應(yīng)體系57ppt課件3.如何選擇dNTP和緩沖液?dNTP是聚合反應(yīng)的底4.用什么做模板DNA？PCR的模板(template)可以是基因組DNA

或cDNA逆轉(zhuǎn)錄-PCR(reversetranscriptionPCR)：RT-PCR在利用DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增時純化比較簡單血液、病原體、體外培養(yǎng)細(xì)胞、甚至病理標(biāo)本經(jīng)簡單處理后均可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增RNA樣品一般要經(jīng)過嚴(yán)格純化，并逆轉(zhuǎn)錄未經(jīng)純化的RNA不穩(wěn)定，無法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中如存在DNA，將對RNA擴(kuò)增產(chǎn)生干擾58ppt課件4.用什么做模板DNA？PCR的模板(template6.如何設(shè)計反應(yīng)程序？PCR的循環(huán)數(shù)：理論上20~25即可滿足擴(kuò)增需要，但實(shí)際循環(huán)數(shù)一般為25~35過多循環(huán)后到達(dá)平臺期，繼續(xù)延長循環(huán)數(shù)無效模板濃度高時平臺期出現(xiàn)早，模板濃度低時平臺期出現(xiàn)晚，應(yīng)根據(jù)模板濃度調(diào)節(jié)循環(huán)數(shù)59ppt課件6.如何設(shè)計反應(yīng)程序？PCR的循環(huán)數(shù)：模板濃度高時平臺期反應(yīng)程序的關(guān)鍵是退火溫度退火溫度：提高退火溫度有助于提高反應(yīng)的特異性退火溫度過高將導(dǎo)致引物與模板無法配對，影響擴(kuò)增效率反應(yīng)的退火溫度主要取決于引物序列60ppt課件反應(yīng)程序的關(guān)鍵是退火溫度退火溫度：60ppt課件三、我們能用PCR做什么？自PCR技術(shù)創(chuàng)立以來，經(jīng)近20年的發(fā)展，在基本PCR技術(shù)基礎(chǔ)上產(chǎn)生了多種PCR的衍生技術(shù)，應(yīng)用于各種不同的目的基因克隆或亞克?。蚬こ烫囟ɑ虮磉_(dá)量的分析基因突變的檢測－－基因診斷病原體特征性序列的鑒定－－基因診斷定點(diǎn)誘變－－第4節(jié)DNA序列測定－－第3節(jié)61ppt課件三、我們能用PCR做什么？自PCR技術(shù)創(chuàng)立以來，經(jīng)近最常用的

PCR是RT-PCRRT-PCR：reversetranscriptionPCR以mRNA為模板先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行PCR為什么要以mRNA為模板？mRNA無內(nèi)含子，克隆的基因可在原核表達(dá)mRNA的量代表了基因的表達(dá)水平62ppt課件最常用的PCR是RT-PCRRT-PCR：revers如何利用

RT-PCR檢測基因表達(dá)水平?定量PCR(quantitative

PCR)PCR產(chǎn)物的量與起始的模板量有關(guān)利用PCR對模板DNA或cDNA進(jìn)行定量測定定量PCR一般用于特定基因mRNA水平的檢測RT-PCR可用于基因表達(dá)水平檢測需設(shè)定內(nèi)部參照物(referencegene)，如：GAPDH、actin、18srRNA等穩(wěn)定表達(dá)基因定量是相對的，一般是不準(zhǔn)確的63ppt課件如何利用RT-PCR檢測基因表達(dá)水平?定量PCR(q為什么說RT-PCR定量是不準(zhǔn)確的？

指數(shù)擴(kuò)增期，產(chǎn)物量與模板量成正比進(jìn)入平臺期，產(chǎn)物量不能再反應(yīng)模板量不同樣品進(jìn)入平臺期的循環(huán)數(shù)不同，難以選擇測定的時間節(jié)點(diǎn)64ppt課件為什么說RT-PCR定量是不準(zhǔn)確的？指數(shù)擴(kuò)增期，產(chǎn)物量有精確定量方法嗎？實(shí)時熒光定量PCR(real-timePCR)：以產(chǎn)物量到達(dá)一定閾值所需要的循環(huán)數(shù)為定量標(biāo)準(zhǔn)需要對PCR產(chǎn)物的生成量進(jìn)行動態(tài)監(jiān)控65ppt課件有精確定量方法嗎？實(shí)時熒光定量PCR(real-time如何進(jìn)行產(chǎn)物量的實(shí)時檢測？需要熒光標(biāo)記探針與兩側(cè)PCR引物探針標(biāo)記有報告熒光與粹滅熒光反應(yīng)過程中探針被降解，報告熒光顯色可通過熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控66ppt課件如何進(jìn)行產(chǎn)物量的實(shí)時檢測？需要熒光標(biāo)記探針與兩側(cè)PCR引巢式PCR可以提高擴(kuò)增效率和特異性

Nested-primerPCR內(nèi)外兩套引物分兩輪進(jìn)行擴(kuò)增在克隆一些低豐度基因時可以采用經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增，具有更高的靈敏度四條引物均與模板匹配，因此增加了特異性67ppt課件巢式PCR可以提高擴(kuò)增效率和特異性Nested-pri可以利用多對引物進(jìn)行多重PCR多重PCR(multi-primerPCR)多組引物同時進(jìn)行的PCR，可大幅度降低PCR反應(yīng)的工作量68ppt課件可以利用多對引物進(jìn)行多重PCR多重PCR(multi-p可以在組織切片上進(jìn)行原位PCR原位PCR(insituPCR)在組織切片或細(xì)胞涂片上進(jìn)行的PCR方法主要用于特定基因表達(dá)水平的原位分析組織切片經(jīng)過固定、蛋白酶和DNase消化后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增69ppt課件可以在組織切片上進(jìn)行原位PCR原位PCR(insituSequencing：基因結(jié)構(gòu)分析的最基本方法主要方式：化學(xué)降解法酶法：Sanger法/雙脫氧鏈末端終止法二代/三代測序技術(shù)第三節(jié)：基因測序70ppt課件Sequencing：基因結(jié)構(gòu)分析的最基本方法第三節(jié)：基因測適用于寡核苷酸片段測序的方法基本反應(yīng)：G：DMSG/A：哌啶T/C：肼(低鹽)C：肼(高鹽)一、化學(xué)降解法71ppt課件適用于寡核苷酸片段測序的方法一、化學(xué)降解法71ppt課件Sanger在1977年建立的方法，也稱酶法測序DNA序列測定的最常用方法二、雙脫氧末端終止法在反應(yīng)體系中加入2’,3’-ddNTP，由于其沒有3’-OH而不能與下一個核苷酸相連，于是DNA鏈的合成便終止。72ppt課件Sanger在1977年建立的方法，也稱酶法測序二、雙Sanger法測序73ppt課件Sanger法測序73ppt課件模板：單鏈→單雙鏈均可酶：Klenow→耐熱DNA聚合酶標(biāo)記：同位素標(biāo)記→熒光標(biāo)記電泳：平板電泳→毛細(xì)管電泳

4泳道→單一泳道酶法測序的自動化程度越來越高74ppt課件模板：單鏈→單雙鏈均可酶法測序的自動化程度越來越高74ppt二代測序技術(shù)(next-generationsequencing)1天完成全基因組測序羅氏、Solexa、ABI等公司各有不同技術(shù)利用微珠或芯片實(shí)現(xiàn)大通量，邊合成邊測序三代測序技術(shù)(next-next-generationsequencing)：3分鐘完成全基因組測序基于納米微孔的單分子測序技術(shù)二代測序與三代測序技術(shù)75ppt課件二代測序技術(shù)(next-generationsequenc第四節(jié)：DNA定點(diǎn)誘變技術(shù)(自學(xué)）目前主要用PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變也可進(jìn)行突變基于的全合成76ppt課件第四節(jié)：DNA定點(diǎn)誘變技術(shù)(自學(xué)）目前主要用PCR方法第五節(jié)：RNA干擾技術(shù)學(xué)習(xí)基因工程之后，在基因剔除技術(shù)部分介紹77ppt課件第五節(jié)：RNA干擾技術(shù)學(xué)習(xí)基因工程之后，在基因剔除技術(shù)部分第六節(jié)：生物芯片生物芯片(biochip)：基于微電子技術(shù)和生物信息技術(shù)建立的高度集成化的生物樣本分析方法生物芯片是后基因組時代的利器生物芯片有哪些種類？DNAmicroarrayProteinmicroarrayAntibodymicroarrayChemicalcompoundmicroarrayTissuemicroarray78ppt課件第六節(jié)：生物芯片生物芯片(biochip)：基于微電子技術(shù)和什么是基因芯片技術(shù)？基因芯片(genechip)，一種高通量的核酸雜交方法，又稱DNA微陣列(DNAmicroarray)將大量探針固定與固相支持物，與標(biāo)記的待測樣品進(jìn)行雜交的方法Affymetrix公司已經(jīng)將GeneChip注冊79ppt課件什么是基因芯片技術(shù)？基因芯片(genechip)，一種高通如何制作基因芯片？cDNA芯片：cDNA片段以顯微打印的方式固定于固相支持物表面，集成度較低原位合成芯片：以激光蝕刻技術(shù)直接合成寡核苷酸探針，集成度可達(dá)105點(diǎn)陣/cm2以上80ppt課件如何制作基因芯片？cDNA芯片：cDNA片段以顯微打印的基因芯片能幫助我們干什么？基因表達(dá)譜芯片(geneexpressionprofile)：基因表達(dá)的大通量分析SNP芯片(singlenucleotidepolymorphism)：單核苷酸多態(tài)性的大通量檢測微小RNA芯片(miRNA)：分析microRNA甲基化芯片：分析基因組甲基化狀態(tài)ChIP-chip(chromatinimmunoprecipitation)：分析DNA與蛋白質(zhì)的相互作用81ppt課件基因芯片能幫助我們干什么？基因表達(dá)譜芯片(geneexpr芯片的主要工作流程選擇與購買芯片準(zhǔn)備樣品標(biāo)記樣品雜交檢測雜交信號分析處理結(jié)果82ppt課件芯片的主要工作流程選擇與購買芯片82ppt課件第七/八節(jié)：蛋白質(zhì)分析方法蛋白質(zhì)的定量分析：ELISA(Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay)Westernblot蛋白質(zhì)的定位：免疫組織化學(xué)熒光蛋白的活細(xì)胞定位蛋白質(zhì)相互作用的研究蛋白質(zhì)功能的研究蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)83ppt課件第七/八節(jié)：蛋白質(zhì)分析方法蛋白質(zhì)的定量分析：83ppt課件Proteomics蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)：對特定組織細(xì)胞總蛋白的整體性研究84ppt課件Proteomics蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)：84ppt課件蛋白質(zhì)組學(xué)研究的目的什么？解讀基因組：基因組編碼了多少基因？蛋白表達(dá)：比研究RNA表達(dá)深入了一步蛋白功能：超過1/3的蛋白質(zhì)功能不明確蛋白質(zhì)修飾：糖基化、磷酸化、酶解等蛋白質(zhì)定位：subproteome蛋白-蛋白相互作用：互作是功能的基礎(chǔ)85ppt課件蛋白質(zhì)組學(xué)研究的目的什么？解讀基因組：基因組編碼了多少基因？蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)是什么？1975年，雙向電泳技術(shù)建立1990年，更新的Edman降解法用于微量蛋白質(zhì)測序，靈敏度達(dá)到pmol級質(zhì)譜技術(shù)使蛋白測序靈敏度達(dá)到fmol級基因組計劃提供了大量的生物信息雙向電泳＋質(zhì)譜＋生物信息分析86ppt課件蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)是什么？1975年，雙向電泳技術(shù)建立8等電聚焦＋

SDS雙向電泳技術(shù)87ppt課件等電聚焦＋雙向電泳等電聚焦＋SDS88ppt課件雙向電泳等電聚焦＋SDSppt課件雙向電泳的優(yōu)點(diǎn)與缺陷優(yōu)點(diǎn)：比單向電泳有更高的分辨率缺點(diǎn)與解決辦法：無法檢測低豐度蛋白：分組檢測無法檢測大分子量或脂溶性蛋白：酶解電泳圖譜解讀困難：自動化分析、DIGE89ppt課件雙向電泳的優(yōu)點(diǎn)與缺陷優(yōu)點(diǎn)：89ppt課件Differencegelelectrophoresis(DIGE)90ppt課件DifferencegelelectrophoresisMassspectrometry肽質(zhì)譜(MS)：分析混合多肽只能確定氨基酸組成，不能分析序列氨基酸質(zhì)譜：分析單一肽的氨基酸序列串聯(lián)質(zhì)譜(Tandemmassspectrometry，MS/MS)可以分析氨基酸序列通過與數(shù)據(jù)庫比較確認(rèn)肽的來源91ppt課件Massspectrometry肽質(zhì)譜(MS)：分析混合多MS與MS/MS92ppt課件MS與MS/MS92ppt課件如何進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用的分析？酵母雙雜交(yeasttwo-hybridization)噬菌體展示文庫(phagedisplaylibrary)免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)93ppt課件如何進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用的分析？酵母雙雜交(yeasttYeasttwo-hybridization蛋白質(zhì)相互作用的篩查方法以特定蛋白為釣餌，篩選其相互作用蛋白94ppt課件Yeasttwo-hybridization蛋白質(zhì)相互作用如何利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行功能分析？蛋白質(zhì)芯片抗原－抗體鑒定蛋白質(zhì)相互作用鑒定蛋白質(zhì)與小分子相互作用：代謝組學(xué)檢測酶活性：蛋白質(zhì)功能的高通量分析95ppt課件如何利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行功能分析？蛋白質(zhì)芯片95ppt課件本章的主要內(nèi)容是什么？通過本章學(xué)習(xí)了解了哪些核酸和蛋白質(zhì)研究方法？什么是分子雜交？分子雜交的探針是什么？怎樣進(jìn)行標(biāo)記？分子雜交有哪些基本方式？什么是PCR？基本原理是什么？PCR反應(yīng)體系是由什么組成的？96ppt課件本章的主要內(nèi)容是什么？通過本章學(xué)習(xí)了解了哪些核酸和蛋白質(zhì)研究本章的主要內(nèi)容是什么？什么是RT-PCR？能用來干什么？如何利用PCR進(jìn)行核酸的定量分析？什么是基因芯片？什么是蛋白質(zhì)組學(xué)？核心方法是什么？如何進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的研究？97ppt課件本章的主要內(nèi)容是什么？什么是RT-PCR？能用來干什么？9第19章：分子生物學(xué)常用技術(shù)－－4學(xué)時分子雜交、PCR、基因測序蛋白質(zhì)研究技術(shù)(雙向電泳，酵母雙雜交)基因轉(zhuǎn)移與基因剔除(含RNA干擾)第20章：基因工程－－4學(xué)時第21章：基因診斷與基因治療－－4學(xué)時第四篇：分子生物學(xué)技術(shù)與應(yīng)用98ppt課件第19章：分子生物學(xué)常用技術(shù)－－4學(xué)時第四篇：分子生物學(xué)技術(shù)第十九章分子生物學(xué)常用技術(shù)99ppt課件第十九章分子生物學(xué)常用技術(shù)2ppt課件分子生物學(xué)技術(shù)能幫助我們干什么？揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)與功能DNA

水平：基因序列分析、拷貝數(shù)和染色體定位RNA

水平：定量分析、基因表達(dá)產(chǎn)物的可變剪接分析蛋白質(zhì)水平：蛋白質(zhì)定量、定位、功能細(xì)胞與整體水平：基因在活體中的功能目的：了解疾病發(fā)生的規(guī)律，提供治療與預(yù)防手段100ppt課件分子生物學(xué)技術(shù)能幫助我們干什么？揭示生物大分子(DNA、RN我們需要了解和掌握哪些基本技術(shù)？基本技術(shù)：核酸：測序、印跡、雜交、體外擴(kuò)增技術(shù)蛋白質(zhì)：電泳與印跡、組學(xué)技術(shù)、相互作用綜合技術(shù)：基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)基因生物與基因敲除技術(shù)應(yīng)用技術(shù)：基因診斷基因治療101ppt課件我們需要了解和掌握哪些基本技術(shù)？基本技術(shù)：4ppt課件Molecularhybridization:利用已知核酸序列(探針/probe)檢測與其互補(bǔ)的未知核酸序列用途：確認(rèn)核酸序列間同源性對特定核酸序列進(jìn)行定量自核酸混合體中辨認(rèn)特定核酸序列第一節(jié)：核酸分子雜交102ppt課件Molecularhybridization:第一節(jié)：核酸一、基本原理變性(denature)復(fù)性(renature)雜交(hybiridization)103ppt課件一、基本原理變性(denature)6ppt課件核酸變性在特定變性因素作用下，DNA雙螺旋解離的過程破壞氫鍵與疏水作用可導(dǎo)致變性熱變性：高溫可使核酸變性，溫度高于90℃時任何核酸雙鏈都將變性酸堿變性：pH<3或pH>11時核酸將變性，DNA使用堿變性，RNA則不可化學(xué)試劑變性：能夠破壞氫鍵的化學(xué)試劑如尿素或甲酰胺可使核酸變性104ppt課件核酸變性在特定變性因素作用下，DNA雙螺旋解離的過程7ppt變性溫度Tm：meltingtemperature，解鏈溫度或變性溫度影響變性溫度的因素：溶液的離子強(qiáng)度變性溫度與離子強(qiáng)度正相關(guān)，低鹽利于變性DNA分子的GC含量GC％＝(Tm－69.3)×2.24105ppt課件變性溫度Tm：meltingtemperature，解鏈溫核酸復(fù)性變性的DNA單鏈相互識別并結(jié)合，恢復(fù)其天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程復(fù)性類似與化學(xué)反應(yīng)，需要一定反應(yīng)時間106ppt課件核酸復(fù)性變性的DNA單鏈相互識別并結(jié)合，恢復(fù)其天然雙螺旋影響DNA復(fù)性速度的因素DNA分子的濃度：濃度高，復(fù)性快DNA分子的長度：長片段復(fù)性速度慢DNA分子的復(fù)雜性：重復(fù)序列復(fù)性速度快不同物種C0t曲線比較

人類基因組C0t曲線107ppt課件影響DNA復(fù)性速度的因素DNA分子的濃度：濃度高，復(fù)性二、核酸探針Probe：用于測定未知核酸片段的已知序列探針為DNA

或RNA，可以為單鏈或雙鏈探針必需經(jīng)過標(biāo)記：放射性標(biāo)記或非放射性標(biāo)記108ppt課件二、核酸探針Probe：用于測定未知核酸片段的已知序列11p1.探針有哪些種類？DNA探針：常規(guī)探針利用基因組DNA序列或cDNA序列合成的探針，一般為雙鏈，也可制備成單鏈RNA探針：高靈敏度探針

一般是通過體外轉(zhuǎn)錄而來，均為單鏈寡核苷酸探針(oligo-nucleotide)：用于點(diǎn)突變檢測人工合成的短序列(~20nt)，可自由選擇序列109ppt課件1.探針有哪些種類？DNA探針：常規(guī)探針12ppt課件2.標(biāo)記物有哪些？標(biāo)記物的要求：高度的靈敏性：足以檢測到極微量的核酸序列高度的特異性：足以在大量非特異性序列中檢測到特異的靶序列標(biāo)記物的種類：放射性同位素(radioisotope)非放射性標(biāo)記物(non-radioactivelabel)110ppt課件2.標(biāo)記物有哪些？標(biāo)記物的要求：13ppt課件放射性同位素特點(diǎn)：靈敏度最高的標(biāo)記物，足以檢測到飛克級微量的核酸序列

g→mg→μg→ng→pg→fg常用的放射性同位素111ppt課件放射性同位素特點(diǎn)：靈敏度最高的標(biāo)記物，足以檢測到飛克級微量的放射性標(biāo)記的核苷酸單體dNTPorNTP5’or3’P32labelling112ppt課件放射性標(biāo)記的核苷酸單體dNTPorNTP15ppt課件非放射性標(biāo)記物特點(diǎn)：安全且易于存放，但靈敏度與特異性均不及放射性同位素地高辛：通過地高辛抗體結(jié)合并檢測生物素：結(jié)合親和素/鏈親和素(avidin/streptavidin)化學(xué)發(fā)光物質(zhì)：通過紫外激發(fā)或化學(xué)反應(yīng)而發(fā)光電子密度標(biāo)記物：金等重金屬113ppt課件非放射性標(biāo)記物特點(diǎn)：安全且易于存放，但靈敏度與特異性均不及放3.如何檢測雜交信號？同位素標(biāo)記物：蓋革計數(shù)器、液體閃爍計數(shù)器放射自顯影(autoradiography)114ppt課件3.如何檢測雜交信號？同位素標(biāo)記物：17ppt課件如何檢測雜交信號？非放射性標(biāo)記物：酶聯(lián)免疫技術(shù)(enzymelinkedimmuno-assay)化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence)115ppt課件如何檢測雜交信號？非放射性標(biāo)記物：18ppt課件三、如何對核酸探針進(jìn)行標(biāo)記？116ppt課件三、如何對核酸探針進(jìn)行標(biāo)記？19ppt課件1.缺口平移nicktranslation:適用于標(biāo)記雙鏈DNA控制DNaseI的用量，可以控制探針的長度117ppt課件1.缺口平移nicktranslation:20ppt課2.非放探針的酶促標(biāo)記生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸單體通過酶促反應(yīng)可以參入探針118ppt課件2.非放探針的酶促標(biāo)記生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸單體通過3.非放探針的化學(xué)標(biāo)記利用光敏基因經(jīng)可見光照射直接與核酸結(jié)合119ppt課件3.非放探針的化學(xué)標(biāo)記利用光敏基因經(jīng)可見光照射直接與核酸結(jié)四、如何進(jìn)行雜交？樣品(DNAorRNA)吸附于支持物尼龍膜、硝酸纖維膜、載玻片等與標(biāo)記的探針雜交封閉液封閉后雜交，雜交爐中進(jìn)行緩沖液清洗控制溫度與變性劑濃度顯色放射自顯影/酶聯(lián)顯色120ppt課件四、如何進(jìn)行雜交？樣品(DNAorRNA)吸附于支持物2五、雜交有哪些不同的方式？斑點(diǎn)雜交：dothybridizationSouthern印跡雜交：SouthernblotNorthern印跡雜交：NorthernblotWesternblotting：不是雜交原位雜交：insituhybridization反Northern印跡雜交：reverseNorthernblot基因芯片/DNA微陣列：Genechip/DNAmicroarray121ppt課件五、雜交有哪些不同的方式？斑點(diǎn)雜交：dothybridizdothybridization將核酸樣品直接點(diǎn)在雜交膜上與探針進(jìn)行雜交特點(diǎn)：簡便但特異性不高可探測核酸含量，但無法得知分子大小122ppt課件dothybridization將核酸樣品直接點(diǎn)在雜交膜上SouthernblotEdwinSouthern創(chuàng)立的方法電泳技術(shù)與雜交結(jié)合，可顯示靶DNA序列的長度可進(jìn)行毛吸管轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移與電轉(zhuǎn)移123ppt課件SouthernblotEdwinSouthern創(chuàng)立電泳轉(zhuǎn)膜雜交124ppt課件電泳轉(zhuǎn)膜雜交27ppt課件Northernblot類似于Southern印跡雜交的方法，用于RNA檢測125ppt課件Northernblot類似于Southern印跡雜交insituhybridization原位雜交：特定mRNA的組織細(xì)胞分布126ppt課件insituhybridization原位雜交：特定mFISHFluorescenceinsituhybridization

(FISH)：特定基因的染色體定位127ppt課件FISHFluorescenceinsituhybri反Northern雜交與DNA芯片反Northern雜交：將探針DNA片段固定在雜交膜上，利用標(biāo)記物標(biāo)記的RNA進(jìn)行雜交128ppt課件反Northern雜交與DNA芯片反Norther第二節(jié)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR，polymerasechainreaction在體外選擇性擴(kuò)增特定DNA片段的高效手段70年代有人提出PCR的設(shè)想，因缺乏寡核苷酸的合成手段和適合的酶而無法進(jìn)行1984年KaryMullis發(fā)明PCR，并因此獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎全自動的熱循環(huán)儀和多種PCR衍生技術(shù)使其成為重要的科學(xué)研究手段129ppt課件第二節(jié)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR，polymerasechai一、PCR的基本原理在體外，以特定引物引導(dǎo)，通過DNA

聚合酶選擇性擴(kuò)增特定區(qū)域變性(denature)退火(anneal)延伸(extension)130ppt課件一、PCR的基本原理在體外，以特定引物引導(dǎo)，通過DNADNA的體內(nèi)復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈131ppt課件DNA的體內(nèi)復(fù)制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’AUCGCG5’引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNA解旋解鏈引物合成DNA的體內(nèi)復(fù)制132ppt課件ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’AUCGCG5’TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶DNA解旋解鏈引物合成新鏈延伸DNA的體內(nèi)復(fù)制133ppt課件ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’變性復(fù)性加熱退火DNA加熱解鏈134ppt課件ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3模板DNA94℃135ppt課件模板DNA94℃38ppt課件55℃引物1引物2DNA引物136ppt課件55℃引物1引物2DNA引物39ppt課件引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶137ppt課件引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶40ppt課件第1輪結(jié)束94℃第2輪開始138ppt課件第1輪結(jié)束94℃第2輪開始41ppt課件72℃TaqTaqTaqTaq55℃139ppt課件72℃TaqTaqTaqTaq55℃42ppt課件第2輪結(jié)束140ppt課件第2輪結(jié)束43ppt課件重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

141ppt課件重復(fù)30輪后模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1-3步25-30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性新鏈延伸DNA的體外擴(kuò)增熱循環(huán)DNA解鏈142ppt課件1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200μmol/L引物各0.1-0.5μmol/L模板DNA

0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+

1.5mmol/LDNA的體外擴(kuò)增143ppt課件PCR反應(yīng)體系DNA的體外擴(kuò)增46ppt課件PCR技術(shù)的特點(diǎn)高度的靈敏性：理論上經(jīng)20循環(huán)可將目的基因片段擴(kuò)增220＝1000000倍高度的特異性：利用引物與模板的特異性配對，可保證擴(kuò)增的特異性一對20堿基長引物的多樣性為440＝1024應(yīng)用的廣泛性：目前已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究必不可少的手段操作的簡便性：不需要復(fù)雜的設(shè)備和繁瑣的流程144ppt課件PCR技術(shù)的特點(diǎn)高度的靈敏性：理論上經(jīng)20循環(huán)可將目的二、做PCR要有什么條件？酶：TaqDNA聚合酶模板DNA：可以為基因組DNA或cDNA引物：人工合成的寡核苷酸片段dNTP：聚合反應(yīng)的核苷酸單體緩沖液：包含特定的pH、離子強(qiáng)度和Mg2+反應(yīng)程序：變性、退火、延伸組成的循環(huán)儀器：DNA熱循環(huán)儀，或稱PCR儀145ppt課件二、做PCR要有什么條件？酶：TaqDNA聚合酶48DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)dNTP146ppt課件DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)dNTP49ppt課件1.什么是耐熱DNA聚合酶早期PCR曾使用DNA聚合酶I在高溫時發(fā)生變性，每一循環(huán)都需要重新添加酶延伸反應(yīng)溫度為37℃，非特異性太多目前常用

TaqDNA

聚合酶純化自嗜熱水生菌

(Thermusaquaticus)可耐受95℃高溫，最適反應(yīng)溫度為72℃左右147ppt課件1.什么是耐熱DNA聚合酶早期PCR曾使用DNATaqDNApolymerase在70~75℃范圍活性最佳，每秒可延伸150nt95℃時的半衰期為40min按變性時間1min計，能滿足30循環(huán)的反應(yīng)Taq酶具有5’→3’聚合活性和5’→3’外切活性不具備校讀活性，錯誤率為2×10－4左右錯誤合成的DNA片段可以作為模板，循環(huán)數(shù)越多，最終擴(kuò)增產(chǎn)物錯誤率越高只能用于檢測，不適合基因克隆148ppt課件TaqDNApolymerase在70~75℃范圍活有保真性的耐熱DNA聚合酶嗎？PfuDNApolymerase：常用的高保真耐熱DNA聚合酶有5’→3’

外切活性錯誤率約1×10－6適應(yīng)于基因克隆149ppt課件有保真性的耐熱DNA聚合酶嗎？PfuDNApolym2.如何設(shè)計寡聚核苷酸引物？引物(primer)是PCR反應(yīng)必備的前提，對PCR產(chǎn)物類型、長度和反應(yīng)的特異性具有決定作用PCR需要兩條引物，引物決定擴(kuò)增范圍和擴(kuò)增片段長度150ppt課件2.如何設(shè)計寡聚核苷酸引物？引物(primer)是PCR引物設(shè)計原則引物長度一般為15~30核苷酸引物太短影響雜交體的穩(wěn)定和特異性引物太長隨機(jī)匹配序列增多，特異性反而下降GC含量一般為40％~60％應(yīng)充分考慮退火溫度(annealingtemperature)GC含量低，退火溫度低，易出現(xiàn)非特異GC含量高，非特異性結(jié)合也會增加引物解鏈溫度粗略計算公式：

引物的解鏈溫度Tm＝4(G＋C)＋2(A＋T)151ppt課件引物設(shè)計原則引物長度一般為15~30核苷酸54ppt課件引物設(shè)計原則引物自身不應(yīng)該存在鏈內(nèi)互補(bǔ)序列，以防止出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)

兩條引物間、同一引物的分子間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列出現(xiàn)互補(bǔ)易導(dǎo)致引物二聚體的出現(xiàn)，影響擴(kuò)增效率152ppt課件引物設(shè)計原則引物自身不應(yīng)該存在鏈內(nèi)互補(bǔ)序列，以防止出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)引物設(shè)計原則避免引物與非特異序列間的同源性引物的3，末端必須與模板完全互補(bǔ)，5，末端允許添加非配對序列5，末端允許添加非匹配序列，如：酶切位點(diǎn)5’3’153ppt課件引物設(shè)計原則避免引物與非特異序列間的同源性5’3’56ppt3.如何選擇dNTP和緩沖液?dNTP是聚合反應(yīng)的底物常規(guī)使用濃度：0.2mMeach探針標(biāo)記時，可使用同位素或非放標(biāo)記的dNTP緩沖液：特定的pH和離子強(qiáng)度Mg2＋濃度一般為1.5mMPCRmix：預(yù)制的便捷反應(yīng)體系154ppt課件3.如何選擇dNTP和緩沖液?dNTP是聚合反應(yīng)的底4.用什么做模板DNA？PCR的模板(template)可以是基因組DNA

或cDNA逆轉(zhuǎn)錄-PCR(reversetranscriptionPCR)：RT-PCR在利用DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增時純化比較簡單血液、病原體、體外培養(yǎng)細(xì)胞、甚至病理標(biāo)本經(jīng)簡單處理后均可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增RNA樣品一般要經(jīng)過嚴(yán)格純化，并逆轉(zhuǎn)錄未經(jīng)純化的RNA不穩(wěn)定，無法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中如存在DNA，將對RNA擴(kuò)增產(chǎn)生干擾155ppt課件4.用什么做模板DNA？PCR的模板(template6.如何設(shè)計反應(yīng)程序？PCR的循環(huán)數(shù)：理論上20~25即可滿足擴(kuò)增需要，但實(shí)際循環(huán)數(shù)一般為25~35過多循環(huán)后到達(dá)平臺期，繼續(xù)延長循環(huán)數(shù)無效模板濃度高時平臺期出現(xiàn)早，模板濃度低時平臺期出現(xiàn)晚，應(yīng)根據(jù)模板濃度調(diào)節(jié)循環(huán)數(shù)156ppt課件6.如何設(shè)計反應(yīng)程序？PCR的循環(huán)數(shù)：模板濃度高時平臺期反應(yīng)程序的關(guān)鍵是退火溫度退火溫度：提高退火溫度有助于提高反應(yīng)的特異性退火溫度過高將導(dǎo)致引物與模板無法配對，影響擴(kuò)增效率反應(yīng)的退火溫度主要取決于引物序列157ppt課件反應(yīng)程序的關(guān)鍵是退火溫度退火溫度：60ppt課件三、我們能用PCR做什么？自PCR技術(shù)創(chuàng)立以來，經(jīng)近20年的發(fā)展，在基本PCR技術(shù)基礎(chǔ)上產(chǎn)生了多種PCR的衍生技術(shù)，應(yīng)用于各種不同的目的基因克隆或亞克?。蚬こ烫囟ɑ虮磉_(dá)量的分析基因突變的檢測－－基因診斷病原體特征性序列的鑒定－－基因診斷定點(diǎn)誘變－－第4節(jié)DNA序列測定－－第3節(jié)158ppt課件三、我們能用PCR做什么？自PCR技術(shù)創(chuàng)立以來，經(jīng)近最常用的

PCR是RT-PCRRT-PCR：reversetranscriptionPCR以mRNA為模板先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行PCR為什么要以mRNA為模板？mRNA無內(nèi)含子，克隆的基因可在原核表達(dá)mRNA的量代表了基因的表達(dá)水平159ppt課件最常用的PCR是RT-PCRRT-PCR：revers如何利用

RT-PCR檢測基因表達(dá)水平?定量PCR(quantitative

PCR)PCR產(chǎn)物的量與起始的模板量有關(guān)利用PCR對模板DNA或cDNA進(jìn)行定量測定定量PCR一般用于特定基因mRNA水平的檢測RT-PCR可用于基因表達(dá)水平檢測需設(shè)定內(nèi)部參照物(referencegene)，如：GAPDH、actin、18srRNA等穩(wěn)定表達(dá)基因定量是相對的，一般是不準(zhǔn)確的160ppt課件如何利用RT-PCR檢測基因表達(dá)水平?定量PCR(q為什么說RT-PCR定量是不準(zhǔn)確的？

指數(shù)擴(kuò)增期，產(chǎn)物量與模板量成正比進(jìn)入平臺期，產(chǎn)物量不能再反應(yīng)模板量不同樣品進(jìn)入平臺期的循環(huán)數(shù)不同，難以選擇測定的時間節(jié)點(diǎn)161ppt課件為什么說RT-PCR定量是不準(zhǔn)確的？指數(shù)擴(kuò)增期，產(chǎn)物量有精確定量方法嗎？實(shí)時熒光定量PCR(real-timePCR)：以產(chǎn)物量到達(dá)一定閾值所需要的循環(huán)數(shù)為定量標(biāo)準(zhǔn)需要對PCR產(chǎn)物的生成量進(jìn)行動態(tài)監(jiān)控162ppt課件有精確定量方法嗎？實(shí)時熒光定量PCR(real-time如何進(jìn)行產(chǎn)物量的實(shí)時檢測？需要熒光標(biāo)記探針與兩側(cè)PCR引物探針標(biāo)記有報告熒光與粹滅熒光反應(yīng)過程中探針被降解，報告熒光顯色可通過熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控163ppt課件如何進(jìn)行產(chǎn)物量的實(shí)時檢測？需要熒光標(biāo)記探針與兩側(cè)PCR引巢式PCR可以提高擴(kuò)增效率和特異性

Nested-primerPCR內(nèi)外兩套引物分兩輪進(jìn)行擴(kuò)增在克隆一些低豐度基因時可以采用經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增，具有更高的靈敏度四條引物均與模板匹配，因此增加了特異性164ppt課件巢式PCR可以提高擴(kuò)增效率和特異性Nested-pri可以利用多對引物進(jìn)行多重PCR多重PCR(multi-primerPCR)多組引物同時進(jìn)行的PCR，可大幅度降低PCR反應(yīng)的工作量165ppt課件可以利用多對引物進(jìn)行多重PCR多重PCR(multi-p可以在組織切片上進(jìn)行原位PCR原位PCR(insituPCR)在組織切片或細(xì)胞涂片上進(jìn)行的PCR方法主要用于特定基因表達(dá)水平的原位分析組織切片經(jīng)過固定、蛋白酶和DNase消化后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增166ppt課件可以在組織切片上進(jìn)行原位PCR原位PCR(insituSequencing：基因結(jié)構(gòu)分析的最基本方法主要方式：化學(xué)降解法酶法：Sanger法/雙脫氧鏈末端終止法二代/三代測序技術(shù)第三節(jié)：基因測序167ppt課件Sequencing：基因結(jié)構(gòu)分析的最基本方法第三節(jié)：基因測適用于寡核苷酸片段測序的方法基本反應(yīng)：G：DMSG/A：哌啶T/C：肼(低鹽)C：肼(高鹽)一、化學(xué)降解法168ppt課件適用于寡核苷酸片段測序的方法一、化學(xué)降解法71ppt課件Sanger在1977年建立的方法，也稱酶法測序DNA序列測定的最常用方法二、雙脫氧末端終止法在反應(yīng)體系中加入2’,3’-ddNTP，由于其沒有3’-OH而不能與下一個核苷酸相連，于是DNA鏈的合成便終止。169ppt課件Sanger在1977年建立的方法，也稱酶法測序二、雙Sanger法測序170ppt課件Sanger法測序73ppt課件模板：單鏈→單雙鏈均可酶：Klenow→耐熱DNA聚合酶標(biāo)記：同位素標(biāo)記→熒光標(biāo)記電泳：平板電泳→毛細(xì)管電泳

4泳道→單一泳道酶法測序的自動化程度越來越高171ppt課件模板：單鏈→單雙鏈均可酶法測序的自動化程度越來越高74ppt二代測序技術(shù)(next-generationsequencing)1天完成全基因組測序羅氏、Solexa、ABI等公司各有不同技術(shù)利用微珠或芯片實(shí)現(xiàn)大通量，邊合成邊測序三代測序技術(shù)(next-next-generationsequencing)：3分鐘完成全基因組測序基于納米微孔的單分子測序技術(shù)二代測序與三代測序技術(shù)172ppt課件二代測序技術(shù)(next-generationsequenc第四節(jié)：DNA定點(diǎn)誘變技術(shù)(自學(xué)）目前主要用PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)誘變也可進(jìn)行突變基于的全合成173ppt課件第四節(jié)：DNA定點(diǎn)誘變技術(shù)(自學(xué)）目前主要用PCR方法第五節(jié)：RNA干擾技術(shù)學(xué)習(xí)基因工程之后，在基因剔除技術(shù)部分介紹174ppt課件第五節(jié)：RNA干擾技術(shù)學(xué)習(xí)基因工程之后，在基因剔除技術(shù)部分第六節(jié)：生物芯片生物芯片(biochip)：基于微電子技術(shù)和生物信息技術(shù)建立的高度集成化