微生物與免疫學(xué)04 實(shí)驗(yàn)四 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) ELISA課件

實(shí)驗(yàn)五酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合的一種方法。它以酶作為標(biāo)記物，與抗體（或抗原）聯(lián)結(jié)，與相應(yīng)的抗原（或抗體）作用后，通過(guò)底物的顏色反應(yīng)作抗原抗體的定性和定量，亦可用于組織中抗原或抗體的定位研究，即酶免疫組織化學(xué)技術(shù)。目前應(yīng)用最多的免疫酶技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。ELISA簡(jiǎn)介1971年瑞典學(xué)者Engvall和Perlmann，荷蘭學(xué)者VanWeeman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）ELISA檢測(cè)抗原

Ag+ Ab*Ag-Ab*ELISA檢測(cè)抗體

Ab+ Ag*Ab-Ag*ELISA檢測(cè)抗體(間接法)Ag+Ab1Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*Ag-Ab1-Ab2*由于結(jié)合在抗原—抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細(xì)胞抗原上每個(gè)分子結(jié)合3～5個(gè)分子抗體，當(dāng)此抗體作為抗原時(shí)又可結(jié)合3—5分子的熒光抗體，所以和直接法相比熒光亮度可增強(qiáng)3或4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標(biāo)記顯示，這是現(xiàn)在最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。間接法比直接法靈敏酶標(biāo)儀將抗原HBsAg吸附于載體表面（廠家已經(jīng)完成）加入酶復(fù)合物，(HBsAg-HRP),酶復(fù)合物與表面抗體結(jié)合加入酶的底物，酶與底物反應(yīng)，顯色二、ELISA間接法檢測(cè)血清中HBsAg原理同檢測(cè)抗體,但小孔底部包被的為HBsAb酶復(fù)合物為:HBsAb-HRP當(dāng)標(biāo)本中存在HBsAg時(shí)，就會(huì)形成HBsAb-HBsAg-HBsAb-HRP復(fù)合物，加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之就無(wú)顯色反應(yīng)?！緦?shí)驗(yàn)材料】1．乙肝病毒HBsAg（或HBsAb）酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。

預(yù)包被微孔條（用純化的單抗-HBs或純化HBsAg包被）酶結(jié)合物（多克隆抗-HBs-HRP或HBsAg-HRP）陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照洗滌液(濃縮液，用前以蒸餾水稀釋25倍)顯色劑A、B（一般為四甲基聯(lián)苯胺和H2O2）終止液（2mol/LH2SO4）。2．微量加樣器，吸水紙等。①檢測(cè)HBsAg或HBsAb的反應(yīng)條②酶標(biāo)抗體③陰性對(duì)照血清④陽(yáng)性對(duì)照血清⑤洗滌液⑥顯色液(A,B)ELISA試劑盒包含以下各組分：實(shí)驗(yàn)步驟每4人一組，每組有檢測(cè)HBsAg和檢測(cè)HBsAb的反應(yīng)條各一條,每條含6個(gè)反應(yīng)孔。每組有2種試劑盒(黃色測(cè)HBsAg,粉紅色測(cè)HBsAb),黃色試劑盒用黃色反應(yīng)條,粉紅色試劑盒用紅色反應(yīng)條。3、檢測(cè)方法每孔加待檢血清50ul,每次實(shí)驗(yàn)各做1個(gè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照;本實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照孔不設(shè)，前面講臺(tái)上有空白的反應(yīng)條，可以作為空白對(duì)照。注意：每位同學(xué)選擇一種待測(cè)血清進(jìn)行檢測(cè)（見(jiàn)下圖）。(2)每孔加1滴酶結(jié)合物,充分混勻，37℃孵育30min(3)甩棄孔內(nèi)液體（在水池中甩棄，不要在實(shí)驗(yàn)室中隨地甩棄）；(4)每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩干。同上洗滌重復(fù)5次，拍干。(6)每孔加顯色液A,B各1滴,充分混勻，置37℃15min.按以下方法,進(jìn)行肉眼觀察結(jié)果:

陰性對(duì)照孔無(wú)色,陽(yáng)性對(duì)照孔藍(lán)色;

待測(cè)孔顯藍(lán)色,為陽(yáng)性,否則為陰性。(7)加終止液（本實(shí)驗(yàn)不加終止液）HBV屬于嗜肝DNA病毒科，是乙型肝炎的病原體。在中國(guó)，HBV感染或攜帶者已超過(guò)1.3億，發(fā)病人數(shù)超過(guò)3000萬(wàn)人。HBV基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，其中有一個(gè)單鏈區(qū)。HBV的抗原組成由表面抗原（HBsAg）、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)組成。三種抗原具有其相應(yīng)抗體：HBsAb（抗表面抗原抗體）、HBeAb（抗e抗原抗體）、HBcAb（抗核心抗原抗體）。HBsAg為二聚體糖蛋白，大量存在于感染者血液中，為HBV感染的主要標(biāo)志；HBcAg存在于Dane顆粒核心結(jié)構(gòu)表面，為內(nèi)殼成分，其外被HBsAg覆蓋，不易在血循環(huán)中檢出，但能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗-HBc，抗-HBcIgM的存在提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)；HBeAg游離于血中，其消長(zhǎng)與病毒體消長(zhǎng)及DNA多聚酶消長(zhǎng)基本一致，故HBeAg為HBV復(fù)制及具有強(qiáng)感染性的一個(gè)指標(biāo)；HBeAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗-HBe能與受染肝細(xì)胞表面的HBeAg結(jié)合，通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)破壞受染肝細(xì)胞，抗-HBe的出現(xiàn)是預(yù)防后良好的象征。HBV的主要感染源是患者或無(wú)癥狀的HBsAg攜帶者，通過(guò)血液、體液、母嬰傳播。本實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)HBsAg及其抗體HBsAb【注意事項(xiàng)】1．試劑盒應(yīng)于4℃存放，在有效期內(nèi)使用。2．微孔條須密封防潮，從冷藏環(huán)境中取出時(shí),應(yīng)在室溫中平衡至潮氣盡干后方可開(kāi)封啟用，余者及時(shí)封存。3．滴加試劑前應(yīng)將瓶搖勻，使液體混勻。滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準(zhǔn)確，注意勿將試劑滴在孔壁上。4．洗滌時(shí)各孔均須加滿，防止孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈。5．待測(cè)標(biāo)本不可用NaN3防腐。所有樣品都應(yīng)按傳染源處理。觀看實(shí)驗(yàn)錄像臨床ELISA測(cè)定中可能會(huì)出現(xiàn)的問(wèn)題及可能的原因

（非試劑盒本身的原因）

1．弱陽(yáng)性樣本檢測(cè)不出

溫育的時(shí)間或溫度不夠；顯色反應(yīng)時(shí)間太短；所用配制緩沖液的蒸餾水有問(wèn)題

2．測(cè)定的重復(fù)性差

（相同樣本兩次測(cè)定結(jié)果不一致）

這是典型的由測(cè)定操作引起的問(wèn)題，包括

（1）加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致；

（2）加樣過(guò)快，孔間發(fā)生污染；

（3）加錯(cuò)樣本；

（4）加樣本及試劑時(shí)，加在孔壁上部非包被區(qū)；

（5）不同批號(hào)試劑盒中組分混用；

（6）溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致；

（7）孔內(nèi)污染雜物；

（8）酶標(biāo)儀濾光片不正確；

（9）血清標(biāo)本未完全凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)等。

3．白板

（陽(yáng)性對(duì)照不顯色）

（1）漏加酶結(jié)合物；