第十章-植物種質(zhì)資源的離體保存課件

第十章植物種質(zhì)資源的離體保存陳觀水生命科學學院jimchen7909@163.com1390591445第十章植物種質(zhì)資源的離體保存陳觀水1第十章植物種質(zhì)資源的離體保存主要內(nèi)容：第一節(jié)植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存第二節(jié)植物種質(zhì)資源的低溫保存第三節(jié)植物種質(zhì)資源的超低溫保存學習的目標與要求：了解植物種質(zhì)離體保存的類型與特點，及其基本操作技術。了解植物人工種子的概念與發(fā)展概況、特點與制備方法。具備利用植物組織培養(yǎng)技術進行種質(zhì)資源保存的認知，具有人工種子制備基礎能力。第十章植物種質(zhì)資源的離體保存主要內(nèi)容：2植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)資源的重要作用種質(zhì)資源或稱基因庫是選育新品種的最基本的原始材料。有人說：“人類的命運將取決于人類理解和發(fā)覺植物種質(zhì)資源的能力?！边x育新品種時利用的材料單位是性狀，如顏色、高矮、早熟性和抗病性等。選育新品種需要原始材料——已有的栽培品種、半栽培類型和有關野生植物。只要其具有一些能結(jié)合到栽培品種上的有用性狀，就都可以作為原始材料。植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)資源的重要作用3植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)(germplasm)是親代通過生殖細胞或體細胞傳遞給子代的遺傳物質(zhì)。

植物種質(zhì)資源(plantgermplasmresources)即為攜帶各種不同遺傳物質(zhì)的植物總稱，又稱遺傳資源或品種資源，包括栽培，野生及人工創(chuàng)造的各種植物的品種或品系。

種質(zhì)資源保存(germplasmconservation)是指在天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境條件下，貯存植物種質(zhì)，使其保持生命力與遺傳性的技術。植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)(germplasm)是親代通4植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)資源的保存方式有兩種，即原生境保存和非原生境保存。原生境保存：將植物的遺傳材料保存在它們的自然環(huán)境中。原生境保存的地方多是植物保護區(qū)，另一種方法為農(nóng)田種植保存。非原生境保存：將植物的遺傳材料保存在不是它們的自然生境的地方。非原生境保存方式有植物園、種質(zhì)圃、種子(質(zhì))庫、試管苗庫、超低溫庫等。具體保存方法有四種：種植保存、貯藏保存、離體保存和基因文庫保存。植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)資源的保存方式5植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)資源的離體保存(germplasmconservationinvitro)：是指對離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細胞或原生質(zhì)體等材料，采用限制、延緩或停止其生長的處理措施使之保存，在需要時可重新恢復其生長，并再生植株的方法。離體保存的意義可使一些無性繁殖作物種質(zhì)資源低溫長期保存，避免資源的丟失。節(jié)省土地和勞力，方法簡單，花費少并能在保存中脫毒。一旦利用可快速繁殖；也利于種質(zhì)交換。植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)資源的離體保存(germ6植物種質(zhì)資源的離體保存離體保存的方法：常溫限制生長低溫保存超低溫保存植物種質(zhì)資源的離體保存離體保存的方法：7一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存1.常溫限制生長保存的概念正常條件下由于材料生長很快，需經(jīng)常繼代，增加了工作量及費用，不適合種質(zhì)資源保存。通過提高滲透壓、添加生長延緩劑或抑制劑、干燥、降低氣壓、改變光照條件等，限制培養(yǎng)物的生長，使轉(zhuǎn)移繼代的間隔時間延長達到保存種質(zhì)的方法。一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存1.常溫限制生長保8一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存2.常溫保存的方法和原理1)高滲保存法利用培養(yǎng)基的高滲透壓，減少離體培養(yǎng)物吸收養(yǎng)分和水分的量，減緩生理代謝過程，從而減緩生長速度，達到抑制離體培養(yǎng)材料生長的種質(zhì)保存方法。高滲物質(zhì)：甘露醇、蔗糖、PEG等

高滲保存配合低溫效果更明顯如：6~10℃低溫下，培養(yǎng)基中加4%甘露醇，可保存馬鈴薯1~2年，存活率最高可達90%以上。一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存2.常溫保存的方法和原理9一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存1.常溫保存的方法和原理2)生長抑制劑保存法在培養(yǎng)基中加入生長抑制劑以減緩培養(yǎng)材料的生長，達到長期保存種質(zhì)材料的保存方法。

生長延緩劑：ABA、青鮮素、CCC、多效唑、B9等使試管苗生長緩慢，生長健壯、葉色濃綠、移栽成活率高。一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存1.常溫保存的方法和原10一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存1.常溫保存的方法和原理3)抑制生長的其他保存法

低壓保存法：降低培養(yǎng)材料周圍氣壓，達到抑制生長的目的，分為低氣壓與低氧壓兩種，保存原理相似。

饑餓法：從培養(yǎng)基中減去1~2種營養(yǎng)元素，使植株缺乏相關營養(yǎng)而處于最小生長量

干燥保存法：減少培養(yǎng)材料的含水量

礦物油覆蓋法：使培養(yǎng)材料與空氣隔絕，延緩生長

低光照培養(yǎng)：適當減弱光照強度，縮短光照時間，進而減緩試管苗生長一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存1.常溫保存的方法和原理11二、植物種質(zhì)資源的低溫保存1.低溫保存的概念用離體培養(yǎng)的方式在非凍結(jié)程度的低溫下(一般為1-9℃)保存種質(zhì)的方法。方法簡單，存活率高2.低溫保存的方法和原理

低溫使植物生長速度就會受到抑制而減慢，老化程度延緩，因而延長了繼代的時間間隔而達到保存種質(zhì)的目的二、植物種質(zhì)資源的低溫保存1.低溫保存的概念12三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存1.種質(zhì)資源超低溫保存的發(fā)展概況20世紀70年，Nag和Street首先證明胡蘿卜懸浮培養(yǎng)細胞在液氮中保存后能恢復生長。

植物超低溫種質(zhì)保存(cryopreservation)是指將植物的離體材料包括莖尖（芽）、分生組織、胚胎、花粉、愈傷組織、懸浮細胞、原生質(zhì)體等，經(jīng)過一定的方法處理后在超低溫（-196℃液氮）條件下進行保存的方法。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存1.種質(zhì)資源超低溫保存的發(fā)展概況13三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存1.種質(zhì)資源超低溫保存的發(fā)展概況

極端低溫溫度下，活細胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長活動幾乎完全停止。因此，細胞、組織和器官在超低溫保存過程中不會引起遺傳性狀的改變，也不會丟失形態(tài)發(fā)生的潛能。同時，由于超低溫條件下，生物的代謝和衰老過程大大減慢，甚至完全停止，因此可以長期保存植物材料。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存1.種質(zhì)資源超低溫保存的發(fā)展概況14三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理離體種質(zhì)在液氮中幾乎所有的細胞代謝活動、生長都停止，因而排除了遺傳性狀的變異，同時保存了細胞的活力和形態(tài)發(fā)生潛能。低溫冰凍過程中，細胞內(nèi)水分結(jié)冰會直接破壞細胞結(jié)構(gòu)。因此在冰凍過程中，通過避免或盡量減少其細胞內(nèi)水分結(jié)冰而達到冰凍保存的目的。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理15三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理超低溫冷凍保存為什么沒有把細胞凍死？

細胞冰凍結(jié)冰保護性脫水理論溶液的玻璃化理論三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理16三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理細胞冰凍結(jié)冰保護性脫水理論常溫下，細胞及其溶液處于滲透平衡的狀態(tài)，當溫度降到冰點以下時，首先是細胞外溶液部分“凍結(jié)”出冰；胞外溶液的濃度升高，破壞了細胞內(nèi)外溶液的平衡，水分由胞內(nèi)通過細胞膜向外滲透，細胞收縮，細胞內(nèi)濃度提高；當溫度不斷降低時，凍結(jié)和滲透過程不斷進行，這種過程稱為保護性脫水。當復溫時，溫度升高，凍結(jié)的冰不斷融化，水分由胞外向胞內(nèi)滲透，使收縮的細胞膨脹，可能恢復原狀。精確控制上述過程，能使細胞在降溫、復溫、滲透過程中不被損傷而死亡。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理17三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理溶液的玻璃化理論溶液在降溫時，如果沒有均一晶核或晶核生長缺乏足夠的時間，就首先形成過冷溶液。繼續(xù)降溫，均一晶核形成。如果降溫速度不夠快，就形成尖銳的冰晶。降溫速度足夠快，均一晶核很少或幾乎沒有形成，或均一晶核生長缺乏足夠的時間，溶液就進入無定型的玻璃化狀態(tài)。它是一種透明的固態(tài)，與液態(tài)相比，分子沒有發(fā)生重排，因此與晶態(tài)不同。被稱為玻璃態(tài)，此時的溫度叫玻璃化形成溫度。在玻璃化形成過程中，既沒有溶液效應對細胞的損傷，也沒有冰晶的形成對細胞造成的機械傷害。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理18三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理提高超低溫冷凍保存的措施由于植物細胞含水量比動物細胞高，冰凍保存難度大，如果直接將保存材料放入液氮中，組織和細胞由于細胞內(nèi)水分結(jié)冰，引起組織和細胞死亡，因而，超低溫保存的植物材料必須借助于冷凍防護劑(cryoprotectant)。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理19三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理

冷凍防護劑防護機理：在水溶液中能強烈地結(jié)合水分子，水合作用的結(jié)果使溶液的黏稠度增加。當溫度下降時，溶液冰點下降，即冰的結(jié)晶中心增長速度下降，使水的固化程度減弱。因而對于降低培養(yǎng)基冰點和植物組織、細胞冰點起重要作用。冷凍防護劑的使用提高了培養(yǎng)基滲透壓，導致細胞的輕微質(zhì)壁分離，相對提高了組織和細胞的抗寒力。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理20三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理常用的冷凍防護劑

滲透型冷凍防護劑:

多為小分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子發(fā)生水合作用，使溶液粘性增加，弱化水的結(jié)晶過程，達到保護的目的。包括二甲亞砜（DMSO)、甘油、甘露醇、脯氨酸、乙二醇、丙二醇三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理21三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理常用的冷凍防護劑

非滲透型冰凍保護劑:是聚合分子物質(zhì)，能溶于水，但不能進入細胞，它使溶液呈過冷狀態(tài)，從而起到保護作用。此類冰凍保護劑對快速、慢速冷卻均有保護效果。常見的：聚乙烯吡咯烷酮(Polyvingylpyrollidone,PVP)葡聚糖(Dextrane)聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)羥乙基淀粉(Hydroxyethylstarch,HES)三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理22三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序植物材料（培養(yǎng)物）的選取材料的預處理降溫冷凍及超低溫保存解凍：分快速解凍、慢速解凍再培養(yǎng)超低溫保存后細胞或組織活力檢測三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序23三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序

植物材料（培養(yǎng)物）的選取物種、基因型、器官、抗寒性、年齡、生理狀態(tài)等。植物細胞培養(yǎng)物的生理狀態(tài)是決定凍后細胞成活率的重要因素。一般指數(shù)生長期和生長延滯后期的細胞抗凍力強，存活率高。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序24三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序

植物材料（培養(yǎng)物）的預處理預處理對于調(diào)整植物離體材料的生理狀態(tài)非常有效。通過預處理的植物材料，減少了細胞內(nèi)自由水的含量，使細胞能經(jīng)受低溫脅迫，減少或避免冷凍傷害，可大大提高材料的抗凍力。預處理包括：增加培養(yǎng)基糖濃度、提高滲透壓、減少細胞內(nèi)自由水的含量，添加誘導抗寒力的物質(zhì)或冰凍保護劑，如0.3M~1.0M蔗糖、甘露醇、山梨醇等滲透調(diào)節(jié)劑，5%~10%DMSO等冰凍保護劑。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序25三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序

降溫冷凍及超低溫保存?zhèn)鹘y(tǒng)的降溫冷凍方法(快速冷凍法、慢速冷凍法、兩步冷凍法、逐級冷凍法)玻璃化保存法包埋脫水法超低溫保存包埋玻璃化法超低溫保存三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序26三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序

解凍

超低溫保存效果與化凍速度有密切關系，不同的材料應采取不同的化凍方式。液泡小、含水量少的細胞（如莖尖分生組織），可采用快速化凍的方法。液泡大、含水量多的細胞采用慢速化凍法生長季節(jié)中的材料，一般在37℃～40℃水浴中慢速化凍法比室溫下慢速化凍要好，而木本植物的冬芽，在超低溫保存后，必須在0℃下進行慢速化凍玻璃化凍存的材料在保存終止后，要求快速化凍，以防止由于次生結(jié)冰對組織細胞造成的傷害。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序27三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序

再培養(yǎng)經(jīng)凍存的材料會不可避免地受到不同程度的傷害。凍存的材料一般在黑暗或弱光下培養(yǎng)1～2周，在轉(zhuǎn)入正常光下培養(yǎng)。再培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基一般是與保存前的相同，但有時需將大量元素或瓊脂含量減半，有時則在培養(yǎng)基中附加一定量的PVP、水解酪蛋白等以利于生長的恢復。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序28思考題1．植物離體超低溫保存的概念及常用的超低溫方法。2．植物材料超低溫保存的原理。3．超低溫保存的方法及其技術要點。4．影響超低溫保存效果的主要因素及調(diào)控措施。思考題1．植物離體超低溫保存的概念及常用的超低溫方法。29第十章植物種質(zhì)資源的離體保存陳觀水生命科學學院jimchen7909@163.com1390591445第十章植物種質(zhì)資源的離體保存陳觀水30第十章植物種質(zhì)資源的離體保存主要內(nèi)容：第一節(jié)植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存第二節(jié)植物種質(zhì)資源的低溫保存第三節(jié)植物種質(zhì)資源的超低溫保存學習的目標與要求：了解植物種質(zhì)離體保存的類型與特點，及其基本操作技術。了解植物人工種子的概念與發(fā)展概況、特點與制備方法。具備利用植物組織培養(yǎng)技術進行種質(zhì)資源保存的認知，具有人工種子制備基礎能力。第十章植物種質(zhì)資源的離體保存主要內(nèi)容：31植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)資源的重要作用種質(zhì)資源或稱基因庫是選育新品種的最基本的原始材料。有人說：“人類的命運將取決于人類理解和發(fā)覺植物種質(zhì)資源的能力。”選育新品種時利用的材料單位是性狀，如顏色、高矮、早熟性和抗病性等。選育新品種需要原始材料——已有的栽培品種、半栽培類型和有關野生植物。只要其具有一些能結(jié)合到栽培品種上的有用性狀，就都可以作為原始材料。植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)資源的重要作用32植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)(germplasm)是親代通過生殖細胞或體細胞傳遞給子代的遺傳物質(zhì)。

植物種質(zhì)資源(plantgermplasmresources)即為攜帶各種不同遺傳物質(zhì)的植物總稱，又稱遺傳資源或品種資源，包括栽培，野生及人工創(chuàng)造的各種植物的品種或品系。

種質(zhì)資源保存(germplasmconservation)是指在天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境條件下，貯存植物種質(zhì)，使其保持生命力與遺傳性的技術。植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)(germplasm)是親代通33植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)資源的保存方式有兩種，即原生境保存和非原生境保存。原生境保存：將植物的遺傳材料保存在它們的自然環(huán)境中。原生境保存的地方多是植物保護區(qū)，另一種方法為農(nóng)田種植保存。非原生境保存：將植物的遺傳材料保存在不是它們的自然生境的地方。非原生境保存方式有植物園、種質(zhì)圃、種子(質(zhì))庫、試管苗庫、超低溫庫等。具體保存方法有四種：種植保存、貯藏保存、離體保存和基因文庫保存。植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)資源的保存方式34植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)資源的離體保存(germplasmconservationinvitro)：是指對離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細胞或原生質(zhì)體等材料，采用限制、延緩或停止其生長的處理措施使之保存，在需要時可重新恢復其生長，并再生植株的方法。離體保存的意義可使一些無性繁殖作物種質(zhì)資源低溫長期保存，避免資源的丟失。節(jié)省土地和勞力，方法簡單，花費少并能在保存中脫毒。一旦利用可快速繁殖；也利于種質(zhì)交換。植物種質(zhì)資源的離體保存種質(zhì)資源的離體保存(germ35植物種質(zhì)資源的離體保存離體保存的方法：常溫限制生長低溫保存超低溫保存植物種質(zhì)資源的離體保存離體保存的方法：36一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存1.常溫限制生長保存的概念正常條件下由于材料生長很快，需經(jīng)常繼代，增加了工作量及費用，不適合種質(zhì)資源保存。通過提高滲透壓、添加生長延緩劑或抑制劑、干燥、降低氣壓、改變光照條件等，限制培養(yǎng)物的生長，使轉(zhuǎn)移繼代的間隔時間延長達到保存種質(zhì)的方法。一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存1.常溫限制生長保37一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存2.常溫保存的方法和原理1)高滲保存法利用培養(yǎng)基的高滲透壓，減少離體培養(yǎng)物吸收養(yǎng)分和水分的量，減緩生理代謝過程，從而減緩生長速度，達到抑制離體培養(yǎng)材料生長的種質(zhì)保存方法。高滲物質(zhì)：甘露醇、蔗糖、PEG等

高滲保存配合低溫效果更明顯如：6~10℃低溫下，培養(yǎng)基中加4%甘露醇，可保存馬鈴薯1~2年，存活率最高可達90%以上。一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存2.常溫保存的方法和原理38一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存1.常溫保存的方法和原理2)生長抑制劑保存法在培養(yǎng)基中加入生長抑制劑以減緩培養(yǎng)材料的生長，達到長期保存種質(zhì)材料的保存方法。

生長延緩劑：ABA、青鮮素、CCC、多效唑、B9等使試管苗生長緩慢，生長健壯、葉色濃綠、移栽成活率高。一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存1.常溫保存的方法和原39一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存1.常溫保存的方法和原理3)抑制生長的其他保存法

低壓保存法：降低培養(yǎng)材料周圍氣壓，達到抑制生長的目的，分為低氣壓與低氧壓兩種，保存原理相似。

饑餓法：從培養(yǎng)基中減去1~2種營養(yǎng)元素，使植株缺乏相關營養(yǎng)而處于最小生長量

干燥保存法：減少培養(yǎng)材料的含水量

礦物油覆蓋法：使培養(yǎng)材料與空氣隔絕，延緩生長

低光照培養(yǎng)：適當減弱光照強度，縮短光照時間，進而減緩試管苗生長一、植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存1.常溫保存的方法和原理40二、植物種質(zhì)資源的低溫保存1.低溫保存的概念用離體培養(yǎng)的方式在非凍結(jié)程度的低溫下(一般為1-9℃)保存種質(zhì)的方法。方法簡單，存活率高2.低溫保存的方法和原理

低溫使植物生長速度就會受到抑制而減慢，老化程度延緩，因而延長了繼代的時間間隔而達到保存種質(zhì)的目的二、植物種質(zhì)資源的低溫保存1.低溫保存的概念41三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存1.種質(zhì)資源超低溫保存的發(fā)展概況20世紀70年，Nag和Street首先證明胡蘿卜懸浮培養(yǎng)細胞在液氮中保存后能恢復生長。

植物超低溫種質(zhì)保存(cryopreservation)是指將植物的離體材料包括莖尖（芽）、分生組織、胚胎、花粉、愈傷組織、懸浮細胞、原生質(zhì)體等，經(jīng)過一定的方法處理后在超低溫（-196℃液氮）條件下進行保存的方法。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存1.種質(zhì)資源超低溫保存的發(fā)展概況42三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存1.種質(zhì)資源超低溫保存的發(fā)展概況

極端低溫溫度下，活細胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長活動幾乎完全停止。因此，細胞、組織和器官在超低溫保存過程中不會引起遺傳性狀的改變，也不會丟失形態(tài)發(fā)生的潛能。同時，由于超低溫條件下，生物的代謝和衰老過程大大減慢，甚至完全停止，因此可以長期保存植物材料。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存1.種質(zhì)資源超低溫保存的發(fā)展概況43三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理離體種質(zhì)在液氮中幾乎所有的細胞代謝活動、生長都停止，因而排除了遺傳性狀的變異，同時保存了細胞的活力和形態(tài)發(fā)生潛能。低溫冰凍過程中，細胞內(nèi)水分結(jié)冰會直接破壞細胞結(jié)構(gòu)。因此在冰凍過程中，通過避免或盡量減少其細胞內(nèi)水分結(jié)冰而達到冰凍保存的目的。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理44三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理超低溫冷凍保存為什么沒有把細胞凍死？

細胞冰凍結(jié)冰保護性脫水理論溶液的玻璃化理論三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理45三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理細胞冰凍結(jié)冰保護性脫水理論常溫下，細胞及其溶液處于滲透平衡的狀態(tài)，當溫度降到冰點以下時，首先是細胞外溶液部分“凍結(jié)”出冰；胞外溶液的濃度升高，破壞了細胞內(nèi)外溶液的平衡，水分由胞內(nèi)通過細胞膜向外滲透，細胞收縮，細胞內(nèi)濃度提高；當溫度不斷降低時，凍結(jié)和滲透過程不斷進行，這種過程稱為保護性脫水。當復溫時，溫度升高，凍結(jié)的冰不斷融化，水分由胞外向胞內(nèi)滲透，使收縮的細胞膨脹，可能恢復原狀。精確控制上述過程，能使細胞在降溫、復溫、滲透過程中不被損傷而死亡。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理46三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理溶液的玻璃化理論溶液在降溫時，如果沒有均一晶核或晶核生長缺乏足夠的時間，就首先形成過冷溶液。繼續(xù)降溫，均一晶核形成。如果降溫速度不夠快，就形成尖銳的冰晶。降溫速度足夠快，均一晶核很少或幾乎沒有形成，或均一晶核生長缺乏足夠的時間，溶液就進入無定型的玻璃化狀態(tài)。它是一種透明的固態(tài)，與液態(tài)相比，分子沒有發(fā)生重排，因此與晶態(tài)不同。被稱為玻璃態(tài)，此時的溫度叫玻璃化形成溫度。在玻璃化形成過程中，既沒有溶液效應對細胞的損傷，也沒有冰晶的形成對細胞造成的機械傷害。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理47三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理提高超低溫冷凍保存的措施由于植物細胞含水量比動物細胞高，冰凍保存難度大，如果直接將保存材料放入液氮中，組織和細胞由于細胞內(nèi)水分結(jié)冰，引起組織和細胞死亡，因而，超低溫保存的植物材料必須借助于冷凍防護劑(cryoprotectant)。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理48三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理

冷凍防護劑防護機理：在水溶液中能強烈地結(jié)合水分子，水合作用的結(jié)果使溶液的黏稠度增加。當溫度下降時，溶液冰點下降，即冰的結(jié)晶中心增長速度下降，使水的固化程度減弱。因而對于降低培養(yǎng)基冰點和植物組織、細胞冰點起重要作用。冷凍防護劑的使用提高了培養(yǎng)基滲透壓，導致細胞的輕微質(zhì)壁分離，相對提高了組織和細胞的抗寒力。三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理49三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理常用的冷凍防護劑

滲透型冷凍防護劑:

多為小分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子發(fā)生水合作用，使溶液粘性增加，弱化水的結(jié)晶過程，達到保護的目的。包括二甲亞砜（DMSO)、甘油、甘露醇、脯氨酸、乙二醇、丙二醇三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理50三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理常用的冷凍防護劑

非滲透型冰凍保護劑:是聚合分子物質(zhì)，能溶于水，但不能進入細胞，它使溶液呈過冷狀態(tài)，從而起到保護作用。此類冰凍保護劑對快速、慢速冷卻均有保護效果。常見的：聚乙烯吡咯烷酮(Polyvingylpyrollidone,PVP)葡聚糖(Dextrane)聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)羥乙基淀粉(Hydroxyethylstarch,HES)三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存2.種質(zhì)資源超低溫保存的原理51三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序植物材料（培養(yǎng)物）的選取材料的預處理降溫冷凍及超低溫保存解凍：分快速解凍、慢速解凍再培養(yǎng)超低溫保存后細胞或組織活力檢測三、植物種質(zhì)資源的超低溫保存3.超低溫保存的基本程序52三、植物種