細胞的克隆培養(yǎng)及篩選課件

第10章克隆培養(yǎng)及篩選克隆培養(yǎng)利用克隆培養(yǎng)可以解決培養(yǎng)中的異質性問題，該技術對于連續(xù)細胞系相對容易，但對大多數原代培養(yǎng)的細胞來說，由于其成功率低而受到限制。成功的范例：Clark和Paterman（1978）通過原代的克隆培養(yǎng)從中國倉鼠肝內分離并建立了枯否氏細胞系；Zwain等克隆培養(yǎng)出睪丸支持細胞(1991)；1990年Muirhead等人，Troyer等人通過克隆培養(yǎng)從腎組織中分離出腎小球旁細胞和腎小球細胞;正常組織原代培養(yǎng)的另一個問題是只能傳有限的幾代，當克隆培養(yǎng)達到所需的數目時，細胞已經接近衰老：單個克隆細胞與群體之間的關系，20次倍增可形成106個細胞（見圖表）克隆培養(yǎng)克隆培養(yǎng)也可作為對細胞的存活能力的檢測，可用于選擇細胞的最適生長條件（培養(yǎng)基和血清的選擇）和測定細胞的化學及放射敏感性;單層貼壁細胞的克隆培養(yǎng)可用培養(yǎng)皿、多孔板或培養(yǎng)瓶進行。由于細胞持續(xù)貼壁，比較容易識別單個細胞所形成的集落，顯微操作是唯一公認的決定性方法;懸浮細胞也可以在凝膠中克隆培養(yǎng)，比如瓊脂或黏性溶劑如美希索(Methocel)。凝膠的穩(wěn)定性或美希索的粘滯性可確保子代細胞不脫落集落。造血細胞通常是在懸浮培養(yǎng)條件下進行克隆培養(yǎng)，根據其細胞種類和使用的生長因子，克隆培養(yǎng)形成的集落可以是由體內外群體重塑能力很強的未分化細胞構成，或是有群體重塑能力弱的已分化細胞構成，這樣克隆培養(yǎng)就成了一種檢測細胞增殖能力和鑒定干細胞性質的方法。方案：稀釋法克隆培養(yǎng)概要：低密度接種細胞，培養(yǎng)至集落形成，再進行細胞染色(用于存活檢測)或分離細胞，然后擴增為細胞株，用于篩選。無菌材料培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶，1ml、5ml、10ml、25ml吸管，6cm、9cm培養(yǎng)皿，試管。非滅菌材料血細胞計數器或電子細胞計數儀操作步驟1.細胞用胰蛋白酶消化以制備單細胞懸液，就克隆培養(yǎng)而言細胞呈單個懸浮狀態(tài)是基礎—消化不充分會形成細胞團，而過度則會降低細胞活性。2.在細胞消化期間，給培養(yǎng)皿編號，分出每步稀釋用培養(yǎng)基，可能需要四次稀釋才能將原來單層細胞稀釋至適于克隆培養(yǎng)的濃度。3.待細胞變圓并開始脫落時，加入含血清或胰酶抑制劑的培養(yǎng)基以終止消化，分散細胞。4.細胞計數，將細胞懸液稀釋至接種需要的濃度。如果是第一次克隆培養(yǎng)，選擇每毫升中10、50、100和200個細胞進行實驗。操作步驟5.將需要量的細胞種入培養(yǎng)皿中。6.在CO2培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)，靜置培養(yǎng)一周，如果有集落形成，則進行以下處理：(a).貼壁形成率分析：集落的染色和計數。(b).克隆篩選：單個集落的分離(見后面“克隆的分離”)。如果沒有可見集落，則更換培養(yǎng)基后再培養(yǎng)一個星期，如果有必要還可以更換培養(yǎng)基后培養(yǎng)三個星期，如果再沒集落出現，則不再有可能出現集落。單層貼壁細胞

的克隆培養(yǎng)克隆形成后，可以直接從多孔板分離培養(yǎng)可以用克隆培養(yǎng)環(huán)技術培養(yǎng)，或者遮蔽一個集落，再用射線照射培養(yǎng)瓶如果不需要分離培養(yǎng)，只用于定量分析，則可以將集落固定、染色、計數。微量滴定培養(yǎng)板如果克隆培養(yǎng)的主要目的是分離不同的集落，那么將細胞接種在微量滴定板上的效果會更好，克隆長起來后也容易分離，但在早期必須注意觀察，以保證標記好哪一孔真正有單個克隆提高單孔單克隆在統(tǒng)計學上的可能性，可以通過將接種細胞的密度降低至每5或10個孔中可能有一個單克隆集落的水平

例如：如果每毫升含100個細胞，貼瓶率為10%，則每毫升會有10個集落形成，即每0.1ml有一個集落。在微量滴定板中每孔種0.1ml，形成一個集落。如果將細胞稀釋至每毫升10個細胞，理論上10個孔中只會有1個孔能形成1個集落，而每孔中多于一個集落的可能性很小。毛細管技術在一定密度的群體里，釋放的胞內代謝物很快會和周圍培養(yǎng)基達到平衡，而孤立的一個細胞就不能做到這一點。據此原理，Sanford等人發(fā)明了毛細管技術：毛細管本身能為細胞營造出類似細胞較高密度狀態(tài)下的局部環(huán)境應用毛細管計數，集落可以處于獨立的狀態(tài)，能夠依次被分離培養(yǎng)促進克隆生長的方法④中間代謝產物：可作為輔助介質添加到培養(yǎng)基中酮酸，如丙酮酸或α-酮戊二酸核苷⑤二氧化碳：二氧化碳對獲得最大的克隆率是必需的，通常為5%；對人神經膠質細胞和成纖維細胞，2%更好，且在此條件下，可用20mmol/L的HEPES保護細胞，以避免在換液和CO2供應出現問題時的pH波動；DMEM配合使用10%CO2，常用于培養(yǎng)骨髓雜交瘤克隆制備單克隆抗體。促進克隆生長的方法⑥基質的處理：在血清濃度低時，多聚賴氨酸可以提高人成纖維細細胞的貼瓶率(a)在培養(yǎng)瓶中加入用超純水溶解的1mg/ml的多聚右旋賴氨酸(約0.2ml/cm2)(b)棄去多聚賴氨酸，用PBSA(0.2ml/cm2)清洗培養(yǎng)瓶，瓶一瓶可立即使用或存放幾周纖黏連蛋白也可提高很多細胞的貼瓶率，培養(yǎng)瓶可用含有5μl/ml纖黏連蛋白的培養(yǎng)基預處理。⑦胰酶：純化的胰酶(經兩次結晶)可能優(yōu)于粗提的胰酶(用量0.05μg/ml)，但觀點不一。Mckeekan(1977)發(fā)現用純化的胰酶4℃消化細胞后，貼瓶率顯著提高。飼養(yǎng)層細胞有些細胞克隆培養(yǎng)不好的原因與它們在低密度下沒有生存能力有關，要讓細胞在克隆生長的密度下生存，一種方法就是讓細胞在生長受阻的飼養(yǎng)層細胞中克隆培養(yǎng)。飼養(yǎng)層細胞可以提供營養(yǎng)物質、生長因子和基質成分，它們能使克隆培養(yǎng)的細胞更容易生存。細胞經射線照射后用胰酶消化(或者先用胰酶消化后再經輻射)將這種細胞低密度種在培養(yǎng)皿中，可以提高細胞的克隆培養(yǎng)率；若高密度接種，可以為細胞選擇性生長提供匯合的貼壁細胞層。方案：飼養(yǎng)層的準備概要：接種同源或異源細胞——比如來自小鼠胚胎的細胞在受測細胞克隆培養(yǎng)之前用射線照射或藥物處理中等密度的飼養(yǎng)層細胞，使其失去增殖能力。無菌材料第二代13天胎齡小鼠胚胎成纖維細胞；克隆培養(yǎng)用培養(yǎng)基；絲裂霉素C,5uglml，溶于BSS或無血清培養(yǎng)基中非滅菌材料X射線或60Co源，能在30min或更短時間內釋放30Gy(可以取代絲裂霉素C)操作步驟用胰酶消化原代培養(yǎng)的胚胎成纖維細胞，以每毫升105個細胞再種入培養(yǎng)瓶中；50%匯合時加入絲裂霉素C，其含量為2ug/106個細胞或0.25ug/ml過夜，或用30Gy射線照射細胞；處理完畢，更換培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24小時，胰酶消化后，在新的培養(yǎng)基中以每毫升5X104個細胞接種(每平方厘米104個細胞)；繼續(xù)培養(yǎng)24~48小時，種入克隆培養(yǎng)的細胞?？寺〉姆蛛x當克隆培養(yǎng)用于篩選特定的細胞株時，形成的集落就需要分離，以進一步增殖。如果單層貼壁細胞直接在多孔板上克隆培養(yǎng)，那么集落可以用胰酶在各自的孔中消化分離。如果是在培養(yǎng)皿中克隆培養(yǎng)，集落之間就沒有了物理分隔，這時必須創(chuàng)造一個分隔條件。在撤掉培養(yǎng)基之后，在集落周圍放一個不銹鋼或陶環(huán)，以達到分隔的目的。方案：用克隆環(huán)分離細胞克隆概要：將集落套在瓷質克隆環(huán)、玻璃環(huán)、PTFE環(huán)或者不銹鋼環(huán)中，用胰酶消化后移至24孔板或12孔板種或直接種于培養(yǎng)瓶中。無菌材料克隆培養(yǎng)環(huán)(高溫高壓滅菌)；硅油(160℃干熱滅菌1h)；加樣器槍頭；0.25%胰蛋白酶；生長培養(yǎng)基；24孔板或培養(yǎng)瓶；無菌鑷。非滅菌材料加樣器；標記筆，裝在顯微鏡轉換盤上，可對所篩選的克隆集落劃上標記選擇性抑制劑利用選擇性培養(yǎng)基控制培養(yǎng)條件是一種篩選微生物的標準方法，但這種方法應用于培養(yǎng)動物細胞卻有局限性；大多數已證明通常會成功的選擇性培養(yǎng)基均是無血清的配方；很多代謝抑制劑目前應用都很成功：用右旋纈氨酸代替培養(yǎng)基中的左旋纈氨酸，并證實只有含右旋纈氨酸氧化酶的細胞才能在這種培養(yǎng)基中很好地生長(Gilbert&Migeon1975)；用這種方法已經篩選出腎小管上皮細胞、牛乳腺上皮細胞、大鼠腦內皮細胞等；但不能有效地針對人成纖維細胞。選擇性抑制劑轉染的細胞可以通過對一些藥物的抗性來進行篩選如新霉素Neo及其類似物G418、潮霉素和氨甲喋呤；只要在細胞轉染的DNA序列中加入可以賦予細胞耐藥的基因：如neo(氨基糖苷磷酸轉移酶)、hph(潮霉素B磷酸轉移酶)、dhfr(二氫葉酸還原酶)，再向培養(yǎng)物中加入適當濃度的選擇性藥物就可以篩選出穩(wěn)定轉染的細胞。單純皰疹病毒(HSV)的TK基因也可用于陰性篩選：這種基因能使丙氧鳥苷活化為一種細