酶聯(lián)免疫(ELISA)使用試劑盒檢測過程中值得關(guān)注的問題

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1、儀器質(zhì)控

為使儀器保持最佳工作狀態(tài)，應(yīng)建立維護和校正儀器的標準操作程序（SOP），所要控制的儀器包括移液器（加樣槍）、溫箱、洗板機和酶標儀。

◎移液器：ELISA加樣量小（20-200μl），其準確性直接影響實驗結(jié)果，利用稱重法檢查：低、中、高三個刻度分別吸取指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應(yīng)在±5%以內(nèi)；

◎恒溫箱：經(jīng)常檢查恒溫箱溫度計所示的溫度和水中（或溫箱內(nèi)）實測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差；

◎洗板機：每個廠家設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定，一般不超過2μl；人工扣板時，墊紙不濕；定期檢查管孔是否堵塞；

◎2、試劑盒選擇

◎應(yīng)盡量選擇正規(guī)廠家，產(chǎn)品經(jīng)相應(yīng)政府部門審核認可，試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、安全性及經(jīng)濟性全面評價。

◎靈敏度：有二層含義，1）為試劑檢出被檢物質(zhì)的最低量的能力；2）為試劑對大量樣品中陽性檢出的能力。

◎特異性：常用交叉反應(yīng)率表示。含有與待測物相近結(jié)構(gòu)部份的物質(zhì)可能存在交叉反應(yīng)，使測定結(jié)果升高，可能導(dǎo)致假陽性，所以交叉反應(yīng)是評價其質(zhì)量的關(guān)鍵指標。

◎精密度：ELISA試劑一般指其批內(nèi)CV%，其值應(yīng)小于15%；定量試劑應(yīng)同時考察線性范圍。

◎準確度：通過添加回收實驗進行評價。

◎簡便性：指在不影響試劑的前三項指標的前題下，實驗和測定步驟越少越好，在定性實驗中結(jié)果判斷簡單明了，定量試驗結(jié)果計算也應(yīng)簡單。

◎安全性：指試劑對操作者和環(huán)境安全無害無傳染性。

◎經(jīng)濟性：試劑在同等質(zhì)量條件下通過大規(guī)模生產(chǎn)或技術(shù)進步降低成本，而市場價格比較合理。

◎試劑評價：需要有權(quán)威的確證方法和確證的樣品進行檢測。3、樣本前處理注意事項

3.1均質(zhì)

組織樣本:肉、肝食品類切細，用絞肉機反復(fù)絞碎，混合均勻。

水產(chǎn)樣本：去除樣品的非食用部分，食用部分切細，用均質(zhì)器均漿；原料表面較臟時,需適當(dāng)用蒸餾水清洗。

蛋類：鮮蛋去殼，蛋黃和蛋白充分混勻。

水果、蔬菜類：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。

3.2振蕩提取

將提取溶劑加入到裝有樣品的具塞容器中，振蕩，使提取溶劑與容器內(nèi)的樣品充分接觸以深入到樣本組織內(nèi)部，提取待測組分。

3.2.1振蕩方式：振蕩器上進行上下、往返式振蕩、手搖式上下振蕩。

3.2.2在組織樣本中加入有機溶劑之間提取時，應(yīng)邊加邊振蕩，防止組織凝結(jié)成團，不利于提取。

3.3.在用有機溶劑提取過程中，如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，解決的方法有：①用細頭輕輕的攪拌，破壞乳化后，再重復(fù)離心。②再加入適量的提取劑，重新振蕩。注意離心后要保證樣本的稀釋倍數(shù)不變。

3.4濃縮

由于凈化過程中引入的溶劑，可能會降低待測組分的濃度或者不適宜直接分析，需要去除全部有機溶劑。即試劑盒前處理步驟中把樣本在60℃氮氣下吹干，再用復(fù)溶液溶解干燥殘留物。

濃縮方式：

氮氣吹干除雜、壓縮空氣吹干除雜。

注意：

3.4.1在吹干樣本之前，用甲醇清洗針頭，防止雜質(zhì)干擾。

3.4.2在吹樣本時，針頭應(yīng)在液面上空，避免與樣本接觸，防止產(chǎn)生交叉污染。

3.4.3樣本吹干后應(yīng)立即取下，避免吹的時間過長，影響最終檢測結(jié)果。

3.4.4不同的藥物，吹干后樣本的保質(zhì)期不同，提倡待樣本回到室溫后立即復(fù)溶。

3.5凈化

經(jīng)過提取的待測組分中通常含有一些會干擾試劑盒中抗原抗體反應(yīng)的雜質(zhì)或者是含有與待測物結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)。將待測組分與雜質(zhì)分離的過程，我們稱為試劑盒中樣本的凈化。在我們現(xiàn)有的試劑盒前處理方法中涉及到的最常見的凈化是：液液分配法。

比如：用復(fù)溶液溶解干燥殘留物之前先加入適量的正己烷，在加入正己烷和復(fù)溶液渦動后如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，可以604、酶標分析過程中的注意事項

樣本的檢測是基于抗原抗體的反應(yīng)，根據(jù)標準曲線，判定樣本最終的藥物含量。它要求加樣的準確性和洗板的一致性。在整個加樣的過程中注意實驗室溫度的恒定，保證反應(yīng)在試劑盒所示的溫度下進行。

4.1常見加樣方式

A、吸一打二

B、吸二打一

在實際操作過程中，提倡用“吸二打一”用這種方式，有如下幾個好處：

a、加樣過程中在板孔內(nèi)不出現(xiàn)或者很少出現(xiàn)氣泡

b、提高加樣速度，縮短前后樣本反應(yīng)的時間差。

在加樣的過程中還應(yīng)細心注意避免出現(xiàn)下列現(xiàn)象：

A、加樣的過程中漏加或者重加；

B、加樣的過程中忘記更換吸頭；

C、樣本的重加或者漏加；

D、忘記記錄樣本的加樣順序。

4.2常見的洗板方式

A、洗板機洗板；

B、多道孔加樣器洗板；

C、多孔吸頭洗板；

在洗板的過程中，確保每孔所加洗滌液量的均一，按說明書操作，不可過多，避免溢出板孔，污染其它樣本；過少，則達不到洗滌的效果，容易出現(xiàn)曲線不成線性，花板等情況。

4.3甩板

快速甩盡板孔內(nèi)的液體，防止板孔里的液體對流或反濺回板孔中產(chǎn)生交叉污染。

4.4拍板

輕輕的在吸水紙上扣干板孔內(nèi)的液體，而且吸水紙只能使用一次。

4.5顯色

值得注意的是，并非試劑盒中所規(guī)定的顯色時間是絕對的，因為試劑盒的吸光度值會受環(huán)境中的溫度、濕度、酶標板反應(yīng)時所接觸到的物品的導(dǎo)熱度等有關(guān)，實驗操作人員在加完顯色液后，可根據(jù)