重組質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)化篩選和鑒定

(圓滿word版)重組質(zhì)粒建立、轉(zhuǎn)變、精選和判斷(圓滿word版)重組質(zhì)粒建立、轉(zhuǎn)變、精選和判斷(圓滿word版)重組質(zhì)粒建立、轉(zhuǎn)變、精選和判斷重組質(zhì)粒的建立、轉(zhuǎn)變、精選和判斷實驗目的：學習在實現(xiàn)DNA體外重組過程中，正確選擇適合的載體和限制性內(nèi)切酶并能對限制性核酸內(nèi)切酶對載體和目的DNA進行切割，產(chǎn)生利于連結(jié)的適合尾端。2.學習設計建立重組DNA分子的根本方法，掌握載體和外源目的DNA酶切的操作。3.學習利用T4DNA連結(jié)酶把酶切后的載體片段和外源目的DNA片段連結(jié)起來，建立體外DNA分子的技術(shù)，認識并掌握幾種常用的連結(jié)方式。掌握利用Cacl2感覺態(tài)細胞的方法。學習掌握熱擊法轉(zhuǎn)變E.coli的原理和方法。6.

掌握α互補精選法和PCR檢測法精選重組子的方法。并判斷體外導入目的DNA片段的大小。學習和掌握PCR反應的根本源理和操作技術(shù)，認識引物設計的根本要求。實驗原理：外源DNA與載體分子的連結(jié)即為DNA重組技術(shù)，這樣從頭組合的DNA分子叫做重組子。重組的DNA分子式在DNA連結(jié)酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連結(jié)緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的載體分子和外源DNA分子連結(jié)起來。將重組質(zhì)粒導入感覺態(tài)細胞中，將轉(zhuǎn)變后的細胞在選擇性培育基中培育，可以經(jīng)過α互補精選法精選出重組子，并可經(jīng)過酶切電泳及PCR查驗的方法進行重組子的判斷。重組子的建立酶切時第一要認識目的基因的酶切圖譜，采納的限制性內(nèi)切酶不可以目的基因內(nèi)部有專一的鑒識位點，否那么當用一種或兩種限制性內(nèi)切酶切割外源工體DNA時不可以獲得圓滿的目的基因。其次要選擇擁有相應的單調(diào)酶切位點質(zhì)?；蛟S噬菌體載體分子。常用的酶切方法有雙酶切法和單酶切法兩種。本實驗采納單酶切法，即只用一種限制性內(nèi)切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段兩頭將產(chǎn)生相同的黏性尾端或平尾端，再采納相同的限制性內(nèi)切酶辦理載體。在建立重組子時，除了形成正常的重組子外，還可能出現(xiàn)目的DNA片段以相反方向插入載體分子中，或目的DNA串聯(lián)后再插入載體分子中，甚至出現(xiàn)載體分子自連，從頭環(huán)化的現(xiàn)象。單酶切法簡單易行單是后期精選工作比較復雜。各樣限制性內(nèi)切酶都有去最正確反應條件，最主要的要素是反應溫度緩和沖液的構(gòu)成，在雙酶切系統(tǒng)中，限制性內(nèi)切酶在使用時應依據(jù)“先低鹽后高鹽，先低溫后高溫〞的原那么進行反應?！惨诌_高效率的連結(jié)，必然酶切圓滿，酶切的DNA數(shù)目要適合。其余，酶切反應的規(guī)模也取決于需要酶切的DNA的量，以及相應的所需酶的量?？梢赃m合增添酶的用量，可是最高不可以超出反應整體積的10%，因為限制性核酸內(nèi)切酶一般是保留在50%甘油的緩沖液中，如果酶切反應系統(tǒng)中甘油的含量超出5%，就會控制酶的活性?！尺B結(jié)反應老是緊跟酶切反應，外源DNA片段與載體分子連結(jié)的方法即DNA分子體外重組技術(shù)主要依靠限制性核算內(nèi)切酶和DNA連結(jié)酶催化達成的。DNA連結(jié)酶催化兩雙鏈DNA片段相鄰的5’-磷酸和3’-OH間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最合用的DNA連結(jié)酶是來自T4噬菌體的T4DNA連結(jié)酶，它可以連結(jié)黏性尾端和平尾端。連結(jié)反應時，載體DNA和外源DNA的摩爾數(shù)之比控制在1:〔1~3〕之間，可以有效地解決DNA多拷貝插入的現(xiàn)象。反應溫度介于酶作用速率和尾端聯(lián)合速率之間，一般是16℃，用常用的連結(jié)時間為12-16h。感覺態(tài)細胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)變建立好的重組DNA轉(zhuǎn)入感覺態(tài)細胞中進行表達的現(xiàn)象就是轉(zhuǎn)變。能進行轉(zhuǎn)變的受體細胞必然是感覺態(tài)細胞，即受體細胞最簡單接受外源DNA片段實現(xiàn)轉(zhuǎn)變的生理狀態(tài)，它決定于受體菌的遺傳特色，同時與菌齡、外界環(huán)境等要素相關(guān)。人工轉(zhuǎn)變是經(jīng)過人為引誘的方法使細胞擁有攝入DNA的能力，或人為地將DNA導入細胞內(nèi)，該過程與細菌自己的遺傳控制沒關(guān)，常用熱擊法，電穿孔法等。可否實現(xiàn)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)變還與受體細胞的遺傳特色相關(guān)，所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)的缺點變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。當前常用的感覺態(tài)細胞制備方法有CaCl2法，制備好的感覺態(tài)細胞可以參加終濃度為15%的無菌甘油，-70℃可保留半年至一年。經(jīng)過CaCl2辦理的細胞細胞膜通透性增添，贊成外源DNA分子進入。在低溫下，將攜帶有外源DNA片段的載體與感覺態(tài)細胞混淆，經(jīng)過熱擊或電穿孔技術(shù)，使載體分子進入細胞。進入受體細胞的外源

DNA分子經(jīng)過復制、表達，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將這些轉(zhuǎn)變后的細胞在選擇性培育基上培育，即可精選出重組子。本實驗以

E.coliDH5

α菌株為受體細胞，用

CaCl2辦理，使其處于感覺態(tài)，此后將重組后的PUC19質(zhì)粒在

42℃下熱擊

90s，實現(xiàn)轉(zhuǎn)變。3.重組子的精選判斷重組

DNA轉(zhuǎn)變宿主細胞后，其實不是所有的受體細胞都能被導入重組

DNA分子，一般僅有少數(shù)重組

DNA分子能進入受體細胞，同時也只有很少量的受體細胞在吸納重組

DNA分子今后能優(yōu)秀增殖。并且它們是與其余大批未被轉(zhuǎn)變的受體菌細胞混淆在一同。再者，在這些被轉(zhuǎn)變的受體細胞中，除局部含有我們所希望的重組DNA分子外，其余一些還可能是因為載體自己或一個載體與多個外源DNA片段形成非希望重組DNA分子導入所致。所以必然使用各樣精選及判斷手段劃分轉(zhuǎn)變子與非轉(zhuǎn)變子，并從轉(zhuǎn)變的細胞集體中分理出帶有目的基因的重組子。本實驗中采納的方法是平板精選法電泳精選法及PCR檢測方法。抗藥性精選主要用于重組質(zhì)粒DNA分子的轉(zhuǎn)變子的精選，而不含重組質(zhì)粒DNA分子的受體菌那么不可以存活，α互補精選法是依據(jù)菌落顏色精選含有充分質(zhì)粒的轉(zhuǎn)變子。質(zhì)粒PUC19攜r沒有導入質(zhì)粒PUC19帶有氨芐青霉素抗性基因〔Amp〕,在含有氨芐青霉素平板上精選轉(zhuǎn)變子。的受體細胞，在含有氨芐青霉素的平板上不生長。質(zhì)粒PUC19進入E.coliDH5α后，經(jīng)過-互補作用，形成圓滿的β-半乳糖苷酶。在麥康凱培育基平板上，轉(zhuǎn)變子利用β-半乳糖苷酶分解培育基中的乳糖產(chǎn)生有機酸，pH降低，培育集中的指示劑變紅，轉(zhuǎn)變子的菌落變紅。不含質(zhì)粒的E.coliDH5α，沒有β-半乳糖苷酶活性，不可以利用培育集中的乳糖產(chǎn)生有機酸，而是利用培育集中的有機碳源，不使培育基pH降低，在不含有氨芐青霉素的麥康凱培育基上形成白色菌落。重組后的載體DNA因為目的基因的插入位點在PUC19乳糖利用基因內(nèi)部，不能形成α-互補作用，所以也不可以利用培育集中的乳糖產(chǎn)生有機酸，在含有氨芐青霉素的麥康凱培育基上形成白色菌落。精選在氨芐青霉素培育基上生長的白色菌落，經(jīng)過擴增培育。因為好多菌落存在假陽性狀況，在氨芐青霉素培育基上的白色菌落可能是導入的重組載體DNA菌落，也可能是載體自連后發(fā)生突變的菌落，所以還要判斷轉(zhuǎn)變子中重組質(zhì)粒DNA分子的大小，可將重組的載體DNA提拿出來，進行后續(xù)的酶切、電泳查驗。也以提取的重組質(zhì)粒為模板，利用現(xiàn)有的引物，進行那個PCR擴增，檢測個噢偶見的質(zhì)粒是不是所希望的重組質(zhì)粒。4.PCR技術(shù)PCR〔Polymerasechainreaction

〕即聚合酶鏈式反應，其原理近似于

DNA的體內(nèi)復制，又叫做“體外基因擴增〞。反應系統(tǒng)包含：模板

DNA、寡核苷酸引物、

Mg2+，4

種脫氧核糖核酸〔dNTP〕、DNA聚合酶和適合的緩沖系統(tǒng)。反應根本程序包含DNA變性、引物復性及引物延伸三個根本過程。這三個反應構(gòu)成一個循環(huán)，頻頻進行。每一輪循環(huán)擴增的產(chǎn)物可作為下一輪擴增反應的模板。理論上每一輪循環(huán)可使DNA數(shù)目增添一倍，頻頻30次，特異DNA序列片段以指數(shù)方式可擴增105~106。經(jīng)過此技術(shù)可以使特別微量的DNA產(chǎn)生大批的PCR產(chǎn)物，所以這個技術(shù)是一項在體外大批生產(chǎn)目的基因的技術(shù)。此刻廣泛通用的是一種從水生嗜熱桿菌中提取的TaqDNA聚合酶，并且大大提升了擴增片段的特異性、敏捷性和擴增效率。反應頂用的引物有兩段，一條稱為上游引物或許正向引物，一條稱為下游引物或許反向引物。引物的設計十分重要，在設計時應依據(jù)以下原那么：長度一般為18到24個堿基；G+C的百分含量在40%~60%；單條引物內(nèi)部防備含有二級構(gòu)造，避免形成引物二聚體；最好以1到2個G或C堿基開始或結(jié)束；引物的5’端可以被修飾，但是3’端絕對不可以進行任何修飾，并且引物的3’端要避開密碼子的第三位。模板的濃度不可以太大，dNTP的濃度為，金屬離子的濃度為，緩沖液為pH為的Tris—HCl溶液。實驗資料：1.菌株：E.coliDH5α培育基：LB培育基、麥康凱培育基〔參加氨芐青霉素〕試劑資料：酶切反應：〔DNAPUC19質(zhì)粒，酶切10×buffer，HindⅢ,重蒸水，λDNA。〕連結(jié)反應：〔酶切后的DNAPUC19質(zhì)粒和λDNA，連結(jié)10×buffer，T4連結(jié)酶，重蒸水。〕感覺態(tài)細胞的制備：〔0.1MCaCl2〕轉(zhuǎn)變：〔連結(jié)液和感覺態(tài)細胞，0.1MCaCl2，冰塊。〕重組菌的精選、查驗：試劑盒〔含有RnaseA的溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，HBbuffer,DNAwashingbuffer，elutionbuffer〕,酶切后的DNAPUC19質(zhì)粒，試劑盒抽提的DNA，酶切10×buffer，HindⅢ,重蒸水，瓊脂糖，TAE緩沖液。上樣緩沖液，EB染液。PCR檢測：10×PCRbuffer,dNTP,模板，引物1，引物2，水，TaqDNA聚合酶，瓊脂糖，TAE、溴化乙錠〔EB〕儀器器械：20、200、1000ul的槍和槍尖，1.5ml的Ep管，恒溫培育箱，水浴鍋，平板，三角瓶，試管，接種環(huán)，牙簽，酒精燈，火柴，冰箱，離心計，電泳槽，紫外儀，PCR擴增儀試驗流程載體與外源片段的酶切→連結(jié)→感覺態(tài)細胞的制備→質(zhì)粒轉(zhuǎn)變與重組子的精選→重組子的挑取與復證→重組質(zhì)粒的提取與電泳檢測→PCR檢測本卷須知：本實驗屬于微量操作，用量很少的步驟必然嚴格注意汲取量的正確性并保證樣品所有參加反應系統(tǒng)中。實驗中所用塑料器械都必然是新的，并且經(jīng)過高溫滅菌，操作時打開使用，操作過程中要注意環(huán)境潔凈，戴手套操作，盡量減少走動，縮短

Ep

管開蓋的時間。3.不論是酶切仍是連結(jié)反應，加樣的次序應當是，先加重蒸水，其次是緩沖液和

DNA，最后加酶。且前幾步要把樣品加到管底的側(cè)壁上，加完后使勁將其甩到管底，而酶液要在參加前從-20℃的冰箱拿出，酶管擱置冰上，取酶液時吸頭應從表面汲取，防備因為插入過深而使吸頭外壁沾染過多的酶液。拿出的酶液應立刻參加反應混淆液的液面以下，并充分混勻。Ep管的蓋子應蓋緊，防備水浴過程中水汽進入管內(nèi)，并做好標志以防樣品混淆。轉(zhuǎn)變過程要防備雜菌和其余DNA的污染，整個操作過程應在無菌條件下進行。電泳時使用的緩沖液最好是現(xiàn)配現(xiàn)用，免得影響電泳見效。制備凝膠時，應防備瓊脂糖溶液在微波爐里加熱時間過長，否那么溶液將會暴沸蒸發(fā)，影響瓊脂糖濃度。制膠時要除掉氣泡。拔梳子時要特別當心，以防凝膠與支持物走開。上樣時要當心操作，防備破壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿。也不要迅速擠出吸頭內(nèi)的樣品，防備擠出的空氣將樣品沖出樣品孔。溴化乙錠是一種激烈的誘變劑，有毒性，使用含有這類染料的溶液時，應帶上乳膠手套進行操作。勿將溶液滴灑在臺面上，實驗結(jié)束后用水完好沖刷潔凈。紫外線對眼睛和皮膚均有損害，對眼睛尤甚。察看電泳條帶時要保證紫外光源獲得適合掩飾，并應戴好目鏡或眼罩，防備皮膚直接裸露在紫外線下。實驗中加樣后應實時改換吸頭，以防備試劑的污染。PCR反應高度敏捷，應想法防備污染，如戴一次性手套操作，使用一次性PCR管和吸頭，反應加樣區(qū)應與DNA模板制備區(qū)及PCR產(chǎn)物電泳檢測劃分開。PCR管單加樣時，關(guān)于特別微量的樣品必然將樣品加在管壁上或許液體中，防備漏樣。實質(zhì)操作時，為了防備少加樣，可以保留每次用過的槍尖，經(jīng)過數(shù)槍尖知道自己加到哪一步了。實驗結(jié)果與分析1、酶切電泳圖的結(jié)果及分析↓17,18泳道分別是標準λDNA酶切和自己的λDNA酶切后的產(chǎn)物的條帶。15泳道為marker，16泳道是未酶切的λDNA的條帶。12，13,14泳道分別是pUC19和商品pUC19酶切。1泳道為我們的樣品，是經(jīng)酶切過的DNAPUC19質(zhì)粒，從圖中可以看出只有有一條主帶，這條是被HindIII切開的線性DNAPUC19質(zhì)粒，與DNAmarker比較查資料可知分子量為2322，且可依據(jù)亮度看出含量不是很高?？墒强梢耘袛喑鑫覀兘M的載體質(zhì)粒PUC19酶切很完好。其他組的條帶有些下邊還有一條很淺的帶是超螺旋DNAPUC19質(zhì)粒，即沒有被切開的質(zhì)粒，分子量為2027。2重組子精選結(jié)果轉(zhuǎn)變后，10個平板的菌落狀況：次序平板現(xiàn)象解說Ⅲ〔感覺態(tài)細胞〕麥氏Ap-培育基呈橙紅色，菌落DN5α是氨芐敏感型，不可以在AP+50ul充滿平板呈白色，無單的平板上生長菌落Ⅲ〔感覺態(tài)細胞〕麥氏AP+培育基呈紅色，無菌落50ul生長Ⅱ〔感覺態(tài)細胞麥氏AP+生長了好多的單菌落，Puc19是氨芐抗性，導入受體細+puc19〕菌落表現(xiàn)紫紅色胞，與受體DH5α發(fā)生α互補作用50ul分解乳酸，培育基PH降落，指示劑變紅，轉(zhuǎn)變子菌落變紅Ⅰ〔感覺態(tài)細胞+連麥氏AP+既有白色單菌落又有紅局部轉(zhuǎn)變子導入的是發(fā)生自連的接DNA〕50ul色單菌落。接種的體積圓滿的puc19質(zhì)?？砂l(fā)生α互補Ⅰ100ul麥氏AP+越多，但菌落數(shù)目越多。作用使菌落變紅，局部轉(zhuǎn)變子導Ⅰ150ul麥氏AP+入了重組質(zhì)粒〔即重組子〕，載體Ⅰ200ul麥氏AP+多克隆位點插入外源片段后不可以利用乳糖而是利用其余營養(yǎng)物質(zhì)使菌落表現(xiàn)白色。3重組質(zhì)粒電泳結(jié)果↓↓123456789101112131415Re-pUC19

電泳檢測：〔L1-2：lamda/HIII

，L3-14:1-6

組樣品各

2個；L15：空載體〕13,14

泳道為本組重組質(zhì)粒電泳結(jié)果。依據(jù)每條帶的亮度可以看出

DNA片段的含量。與DNAmarker

比較帶的地點可以比較

DNA片段的大小。與

15泳道的空載體比較可以看出，

我們精選到的重組質(zhì)粒中插入了外源

DNA片段。重組質(zhì)粒中分別插入了較小的基因片段〔14〕和較大的基因片段〔13〕，比較DNAmarkerlamda/HIII，我們推斷載體pUC19中插入的片段可能分別是125bp和6557bp大小的片段。結(jié)果還有待于進一步酶切考證和PCR檢測。酶切考證電泳結(jié)果以以下圖分別是經(jīng)過試劑盒提取的插入大片段和小片段的重組質(zhì)粒的酶切考證電泳圖。↓Re-pUC19的酶切判定大片段1-11:各組樣品；L12：lamda/HIII；L13：pUC19/III〕↓1234567891011121314Re-pUC19的酶切判斷小片段〔1-12：各組樣品；13：pUC19；14：DL2000plus；15-25：各組樣品〕〔DL2000plus的大小分別為：5000,3000,2000,1000,750,500,250,100

〕第一張圖中4泳道是我們組插入大片段的重組質(zhì)粒酶切電泳條帶，第二張圖中的

7,8

泳道分別是我們的插入小片段的重組質(zhì)粒的酶切前后的電泳條帶，此中酶切前的電泳結(jié)果作為比較。從圖中可以看出插入大片段的重組質(zhì)粒酶切后〔

4號泳道〕，上邊有緊鄰的兩條帶，與DNAmarkerlamda/HIII

比較可知其分子量大小在

6557bp左右，與上一步實驗中的推斷吻合合。所以可以判斷此重組質(zhì)粒中插入了6557bp大小的DNA片段。理論上上方應當只出現(xiàn)一條帶，而