轉(zhuǎn)錄組測序技術原理及應用

關于轉(zhuǎn)錄組測序技術原理及應用第1頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六遺傳的中心法則基因組—轉(zhuǎn)錄組—表觀遺傳組—蛋白組層次第2頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六什么是轉(zhuǎn)錄組？All

transcripts

All

mRNAs第3頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六RNA是解讀基因組的關鍵RNAProteinPhenotypeGenotype

DNA第4頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六測序技術RNA-SeqSmallRNA測序降解組測序Non-codingRNA測序研究對象mRNASmallRNAmRNANon-codingRNA鑒定新分子OOOO表達譜研究OOOO基因結構分析O/XXXOEST測序O/XXXX

篩選分子標記

OOOX轉(zhuǎn)錄融合基因表達O/XXXXRNA測序技術第5頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六WorkflowofRNA-Seq樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析第6頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六TotalRNA樣品檢測

Agilent2200檢測OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7

新型安捷倫2200TapeStation

系統(tǒng)是新一代測序（NGS）、生物微陣列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白質(zhì)純化和抗體生產(chǎn)過程中對生物樣品進行質(zhì)量控制（QC）的理想解決方案?！?/p>

可擴展的通量—16聯(lián)或96孔微量滴定板●

快速得到結果—平均每個樣品只需一分鐘便可獲得結果●

使用簡單—可直接使用的ScreenTape預制膠條簡化了工作流程●

樣品用量少—每次運行僅需要不到2ul樣品第7頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六檢測報告-合格樣品棉鈴蟲/果蠅第8頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六檢測報告-不合格樣品第9頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六WorkflowofRNA-Seq樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析第10頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過的磁珠與生物素吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3′的polyA與磁珠在bindingbuffer的作用下相結合。磁珠通過MPC（磁分離器）從溶液中分離出來。mRNA與磁珠結合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。鏈霉親合素包被磁珠+生物素標記Oligo（dT）25+poly（A）第11頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六原核mRNA的純化AmbionMICROExpressKitLNA扣鎖型探針第12頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六mRNA反轉(zhuǎn)錄---fragment+RT純化過的mRNA樣品加入1μl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1μl的stopbuffer終止反應。加入沉淀劑（NaAc糖原無水乙醇）沉淀產(chǎn)物。RTdscDNA第13頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六末端修復(防止自連）cDNA3′末端加AAdapter連接第14頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的打斷cDNA的合成↓↓第二天末端修復↓↓加接頭膠回收3’端加A第三天PCRPCR膠回收↓↓文庫制備↓↓文庫質(zhì)量檢測：Aligent2100：片段大小、純度、濃度qPCR：片段大小、濃度手工檢測：跑膠驗證。第15頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六WorkflowofRNA-Seq樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析第16頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六ApplicationRNA-Seq(單端測序---Quantification)RNA-Seq

(雙端測序---Transcriptome)Expression-profiling√√AlternativeSplicing－√FusionGene－√SNPdetection－√HiSeq2500ApplicationsofRNA-Seq17第17頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六RNA-Seq(Transcriptome)第18頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六WorkflowofRNA-Seq(Transcriptome)生物信息學分析第19頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六RNA-Seq(Transcriptome)CharacterizethetranscriptomeinunparalleleddetailTechnique220RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)第20頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)文庫構建測序組裝第21頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六Denovoassembleatranscriptome組裝流程第22頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計及測序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評估組裝結果分析（Contig長度分布、Scaffold長度分布、Unigene長度分布）Unigene（transcript）功能注釋Unigene的GO分類Unigene代謝通路分析預測編碼蛋白框（CDS）Unigene表達差異分析（兩個或兩個以上樣品）Unigene在樣品間的差異GO分類（需兩個或兩個以上樣品）和Pathway富集性分析Denovoassemblytranscriptome信息分析主要內(nèi)容：第23頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六Denovoassemblytranscriptome信息分析流程第24頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六Unigenes的GO注釋第25頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六Pathway分析第26頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)cDNA文庫構建測序比對到參考序列第27頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六Transcriptomeresequencing比對流程第28頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六比對統(tǒng)計基因表達注釋基因差異表達分析基因結構優(yōu)化可變剪接分析預測新轉(zhuǎn)錄本cSNP分析Transcriptomeresequencing信息分析主要內(nèi)容第29頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六Transcriptomeresequencing信息分析流程第30頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六應用---優(yōu)化轉(zhuǎn)錄組注釋信息基因結構優(yōu)化可變剪接鑒定基因融合鑒定RNA水平SNP分析第31頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistribution優(yōu)化基因結構

鑒定新的轉(zhuǎn)錄本Paired-End(PE)ReadsReads比對到參考序列基因間區(qū)域第32頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六鑒定可變剪接（AlternativeSplicing）exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3commonreadsjunctionreadsmRNA第33頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六鑒定基因融合PairedReadsSingleReadsGeneAGeneB第34頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六分析RNA水平SNP轉(zhuǎn)錄組重測序比對軟件：SOAPDenovo轉(zhuǎn)錄組測序:組裝軟件：SoapDenovo比對軟件：SoapSNP第35頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六36轉(zhuǎn)錄組研究技術橫向比較TechnologyTilingArraycDNAorESTsequesingTranscriptomeSequencingPrincipleHybridizationSangersequencingNext-GensequencingResolutionFromseveralto100SinglebaseSinglebaseThroughputHighLowHighRelianceongenomicsequenceYesNoInsomecasesBackgroundnoiseHighLowLowApplicationSimutaneouslymaptranscribedregionsandgeneexpressionYesLimitedforexpressionYesDynamicrangetoquantifygeneexpressionlevelUptoafew-hundredfoldNotpractical>8,000-foldAbilitytodistinguishdifferentisoformsandallelicexpressionLimitedYesYes第36頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六轉(zhuǎn)錄組測序的優(yōu)勢RNA測序與芯片檢測基因數(shù)比較RNA測序與芯片檢測基因的表達量分布Technique1第37頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六GenomeRes2010Case

實驗材料收集：

葉片，花序,果實,根時間點：0,4,8,12,16,20和24h將每個時間點采集的樣品均勻混合測序策略：

Illumina測序，1Gdata第38頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六1.Highlight2.Heat3.Cold4.Salt5.Drought抗逆相關可變剪接第39頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六外包膜蛋白16(AT2G28900)Intron-retentionControlLowTemperatureResistance低溫脅迫相關的AS低溫脅迫下這個內(nèi)含子和對照相比被保留了下來，揭示了可變剪接有重要功能。第40頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六AS調(diào)節(jié)機制CCA1生物鐘相關基因，例如調(diào)節(jié)氣孔的開關等第41頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六RNA-Seq單端測序（Quantification）等同于數(shù)字表達譜(DGE)第42頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六WorkflowofRNA-Seq單端測序（Quantification）生物信息學分析第43頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六RNA-Seq單端測序（Quantification）生物信息分析內(nèi)容測序數(shù)據(jù)評估篩選差異表達基因表達模式聚類分析GO功能富集分析Pathway富集分析蛋白互作網(wǎng)絡分析第44頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六RNA-Seq單端測序（Quantification）信息分析流程第45頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六RNA-Seq與基因芯片優(yōu)缺點比較技術優(yōu)點缺點RNA-seq1）檢測基因數(shù)比基因芯片多25%2）定量準，可重復性高（重復相關系數(shù)≥0.99）3）數(shù)字化信號，無背景噪音，無交叉雜交4）高、低豐度基因均可檢測5）不受研究物種限制，模式生物和非模式生物均可檢測6）數(shù)據(jù)可與時俱進，即隨數(shù)據(jù)庫更新而更新7）具有較好的分析兼容性，數(shù)據(jù)格式與芯片相同，可與芯片的分析軟件兼容1）樣本要求量比基因芯片多2）數(shù)據(jù)量大，需要具備一定的生物信息分析基礎，才能更好的挖掘數(shù)據(jù)蘊含的豐富信息基因芯片1）平臺應用較早2）信息分析軟件較多3）有些平臺要求樣品量少1）檢測靈敏度較低、重復性差、檢測閾值較狹窄2）有背景噪音，假陽性率＞1%3）受物種限制，只能檢測部分模式生物4）受基因拷貝數(shù)限制，無法檢測出低豐度基因5）只能檢測已知轉(zhuǎn)錄本，無法檢測出新轉(zhuǎn)錄本6）受數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)所限，因探針依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫或比較舊的版本的數(shù)據(jù)庫來設計的，可能出現(xiàn)注釋不準確的情況第46頁，共53頁，2022年，5月20日，13點55分，星期六casePlantPhysiology2010取樣：

選取在成熟季節(jié)開花后

5,10,和15個星