核-殼型白藜蘆醇分子印跡微球研制及應(yīng)用

核-殼型白藜蘆醇分子印跡微球研制及應(yīng)用【內(nèi)容摘要】以外表修飾乙烯基團(tuán)的sio2微球?yàn)榛w，白藜蘆醇為模板分子，丙烯酰胺〔aa〕為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯〔egdma〕為交聯(lián)劑，采取外表印跡技術(shù)制備核-殼型白藜蘆醇印跡微球。采取紅外光譜〔ir〕、掃描電子顯微鏡〔sem〕對(duì)該分子印跡微球進(jìn)行表征，結(jié)果表示清楚，sio2外表成功接枝一層厚度為200nm的印跡聚合物，該印跡微球顆粒分散均勻。采取高效液相色譜技術(shù)對(duì)印跡微球的吸附性進(jìn)行研究表示清楚，此印跡微球具有良好的辨別性能，利用scatchard模型分析得出印跡微球的最大吸附量分別為qmax1=9.087mg/g和qmax2=13.80mg/g。此印跡微球成功用于分離虎杖提取液中白藜蘆醇?！颈疚年P(guān)鍵詞語(yǔ)】分子印跡微球；白藜蘆醇；吸附性能；核-殼型preparationandevaluationofcore-shellresveratrolmolecularlyimprintedmicrosphereszhangming-lei，zhangzhao-hui，liuli，zhangli-ji，nieli-hua(collegeofchemistryandchemicalengineering，jishouuniversity，jishou416000)(statekeylaboratoryofchemo/biosensingandchemometrics，hunanuniversity，changsha410082)abstractemployingresveratrolastemplatemolecule，acrylamideasfunctionalmonomerandethyleneglycoldimethacrylateascross-linkers，acore-shellresveratrolimprintedmicrosphereswaspreparedbasedonthesurfaceofsio2withasurfaceimprintingmolecularlyimprintedmicrospherewascharacterizedbyinfraredspectroscopyandscanningelectronmicroscopy，andtheresultsshowedthatthesurfacegraftingofmolecularlyimprintedpolymer-shellparticleonsio2wassuccessfulandtheparticleswereevenlyperformanceliquidchromatographywasalsousedtoinvestigatetheimprintedmicrosphereadsorptionperformance，andtheresultsshowedthattheimprintedmicrosphereexhibitedgoodrecognitionmaximumadsorptioncapacitieswereqmax1=9.087mg/gandqmax2=13.80mg/gbythemodelofscatchardimprintedmicosphereswasappliedtoseparateresveratrolfromtheextractionofrhizomapolygonicuspidatesuccessfully.keywordsmolecularlyimprintedmicrosphere；resveratrol；adsorptionproperty；core-shell1引言近年來(lái)，新型印跡技術(shù)不斷涌現(xiàn)，包含采取溶膠-凝膠技術(shù)進(jìn)行本體聚合[1，2]，在硅膠外表進(jìn)行外表聚合[3~5]。前者聚合物存在模板分子包埋過(guò)深、難以洗脫、形狀不規(guī)則、機(jī)械性能低等缺點(diǎn);后者的外表印跡材料的大小可控，顆粒均勻，容易洗脫，尤其通過(guò)控制外表聚合殼層的厚度，可有效減少包埋現(xiàn)象?；⒄认缔た茖俣嗄晟荼局参?，具有祛風(fēng)利濕、散瘀定痛、止咳化痰的作用，重要含有蒽醌類和芪類化合物，其中芪類成分白藜蘆醇〔resveratrol〕具有抗癌、抗氧化、抗自在基、抗細(xì)菌和真菌等作用[6]。當(dāng)前，提取分離白藜蘆醇的方法重要有溶劑提取和酶法提取[7]及印跡技術(shù)[８~1０]。向海燕等[８]以溶膠-凝膠法合成白藜蘆醇印跡聚合物，但是其印跡聚合物模板分子包埋過(guò)深，難以洗脫，粒徑不規(guī)則、不均勻。為了克制這些缺陷，本研究以sio2微球?yàn)檩d體，通過(guò)接枝乙烯基三甲氧基硅烷〔vtmos〕，在sio2微球外表引入雙鍵，合成核-殼型的白藜蘆醇分子印跡微球，并用于分離虎杖提取液中的白藜蘆醇。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑lc-2010aht型高效液相色譜儀〔日本島津公司〕；wgh-30a型雙光束紅外分光光度計(jì)〔天津港東科技發(fā)展〕；kq-250e型超聲波清洗器〔昆山市超聲儀器〕；lg10-2.4a臺(tái)式高速離心機(jī)〔北京醫(yī)用離心機(jī)廠〕。正硅酸乙酯〔teos，sigma公司〕；丙烯酰胺〔aa，分析純〕；白藜蘆醇〔標(biāo)樣，中國(guó)藥檢所〕；乙二醇二甲基丙烯酸酯〔egdma，sigma公司〕；偶氮二異丁腈〔aibn，分析純〕；乙烯基三甲基硅烷〔vtmos，sigma公司〕；乙腈〔色譜純〕；乙酸、無(wú)水乙醇、氨水、hcl〔分析純〕；虎杖〔采自湖南張家界〕粉末。2.2印跡微球的制備2.2.1sio2微球的制備[11]向裝有49.5ml乙醇的燒瓶中參加2.0ml氨水、6.3ml蒸餾水和2.23mlteos，室溫下以700r/min的速度攪拌，反應(yīng)12h。采集產(chǎn)品，用乙醇沖刷，放入真空枯燥箱中枯燥，備用。2.2.2sio2微球的外表修飾稱取sio2微球2.0g，參加8.0mol/lhcl60.0ml，60℃回流12h，過(guò)濾，濾餅用蒸餾水洗滌至中性后，140℃下枯燥8h，即可得外表活化的sio2微球。取0.5g外表活化的sio2微球，分散于10.0ml50%乙醇的水溶液中，參加0.75mlvtmos，50℃下反應(yīng)24h。硅烷化后，用乙醇在超聲下洗去未反應(yīng)的vtmos，然后于100℃下枯燥3h，使vtmos與sio2外表的羥基充足交聯(lián)鍵合，得到乙烯基修飾的sio2微球〔vtm-sio2〕。2.2.3白藜蘆醇分子印跡微球〔mips〕的制備[3]取200mgvtm-sio2顆粒分散于100ml乙腈溶液中，參加170mg〔2.40mmol〕aa，1.83ml〔9.2mmol〕egdma，300mg〔1.3mmol〕白藜蘆醇，和100mg〔0.6mmol〕aibn，在冰水浴下通入氮?dú)?0min。在50℃下聚合6h，然后升溫至60℃下再聚合24h，控制攪拌速度為300r/min。產(chǎn)品在85℃下再反應(yīng)6h，沉淀，最后用乙腈和乙醇洗滌，120℃下枯燥，將采集的白藜蘆醇印跡微球〔mips〕用v(甲醇)∶v(乙酸)=9∶1混合溶液在索式提取器中反復(fù)洗滌24h除去模板分子，120℃下枯燥。非印跡微球〔nonimprintedpolymers，nips〕的合成方法與分子印跡微球合成方法完全一致，只是在合成時(shí)不參加模板分子。2.3印跡微球的吸附性能研究及其表征2.3.1靜態(tài)吸附取印跡微球20.0mg，8份，分別置于吸附管中，各自參加10.0ml濃度為0.1～0.4mol/l的白藜蘆醇的乙醇溶液，置于25℃恒溫水浴超聲波振蕩器中，振蕩12h后，以9000r/min速度離心分離，取上層清液用高效液相色譜測(cè)定平衡時(shí)白藜蘆醇的濃度。檢測(cè)波長(zhǎng)303nm，流動(dòng)相為v(甲醇)∶v(水)=41∶59，流速為1.0ml/min。根據(jù)吸附前后濃度變化，計(jì)算對(duì)白藜蘆醇的吸附量q。2.3.2紅外分析采取wgh-30a型雙光束紅外分光光度計(jì)，對(duì)sio2微球、vtm-sio2微球、洗脫脫模板分子〔白藜蘆醇〕前、后的mips進(jìn)行紅外表征。2.4實(shí)際樣品檢測(cè)取1.0g洗脫后的分子印跡微球，裝入直徑為1.0cm、容量為10.0ml的聚丙烯柱中，柱子的下端口用棉花塞住，從上口裝入印跡微球，再塞上棉花，參加乙醇抽濾，使印跡微球在柱內(nèi)排布嚴(yán)密。取3.0g虎杖原料粉末投入100ml圓底燒瓶中，參加30.0mlv(甲醇)∶v(乙酸)=8∶2混合溶液，超聲30min，80℃下回流3h，然后進(jìn)行過(guò)濾，蒸出溶劑，用甲醇從新溶解，得虎杖提取液。取5.0ml虎杖提取液，注入提取柱，抽濾，采集過(guò)柱液，先用5.0ml甲醇沖刷提取柱，然后用5.0mlv(甲醇)∶v(乙酸)=9∶1混合溶液冼脫，采集洗脫液，用hplc檢測(cè)白藜蘆醇的含量。圖1sio2微球外表印跡制備路線圖〔略〕fig.1synthesisroutineofsio2molecularyimprinedpolymers3結(jié)果與討論3.1印跡微球的制備及形貌表征以vtmos為連接sio2和aa的媒介，采取熱聚合技術(shù)，以白藜蘆醇為模板分子，aa為功能單體，egdma為交聯(lián)劑，經(jīng)過(guò)abin引發(fā)，在溫和的條件下制備出包覆了白藜蘆醇的印跡聚合薄層。經(jīng)過(guò)甲醇-乙酸溶液洗脫后，白藜蘆醇從印跡微球聚合薄層中洗脫出來(lái)，在印跡微球的薄層中留下對(duì)白藜蘆醇具有特異吸收的空隙。sio2微球外表印跡微球制備路線如此圖1所示。制備的分子印跡聚合物微球有下面特點(diǎn)：在sio2微球外表引入了雙鍵，加強(qiáng)了分子印跡聚合物薄層與載體之間的共價(jià)鍵作用力，使聚合物薄層結(jié)實(shí)地聚合在微球外表；通過(guò)改變vtm-sio2，aa和egdma的比例，控制殼層厚度，有效減少了包埋，利于洗脫。研究表示清楚，當(dāng)vtm-sio2，aa和egdma的質(zhì)量比為1∶1∶9，其殼層厚度可控制在200nm下面；可加強(qiáng)分子印跡聚合物微粒外表的記憶效應(yīng)和機(jī)械性能。圖2sio2和印跡微球的掃描電鏡圖〔略〕fig.2scanningelectronmicroscopic(sem)imagesofsio2andmolecularlyimprintedpolymers(mips)掃描電鏡對(duì)sio2微球和mips進(jìn)行形貌分析的結(jié)果見圖2。sio2微球粒徑均勻〔約為200nm〕、規(guī)則。mips外表光滑，粒徑均勻，粒徑約為600nm。由此可估算外表印跡聚合物殼層厚度約為200nm。3.2吸附實(shí)驗(yàn)采取靜態(tài)吸附法，通過(guò)hplc檢測(cè)，分別得出mips和nips對(duì)白藜蘆醇的吸附等溫線，如此圖3a所示。結(jié)果表示清楚，mips對(duì)白藜蘆醇具有較強(qiáng)的吸附能力，而nips對(duì)白藜蘆醇的吸附能力小，這表示清楚mips對(duì)白藜蘆醇具有較強(qiáng)的印跡效應(yīng)。進(jìn)一步利用scatchard模型[7]分析，scatchard方程為：q/c=〔qmax－q〕/kd。式中，kd是接合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)；qmax是結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀結(jié)合量〔mg/g〕；c表示吸附平衡液的平衡濃度〔g/l〕。以q/c對(duì)q作圖可得兩條不同斜率的直線〔圖3b〕，mips在研究濃度范圍內(nèi)對(duì)模板分子存在兩種吸附的結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)斜率和截距能夠得出親和位點(diǎn)解離常數(shù)和最大表觀結(jié)合量分別為kd1=0.1724g/l，qmax1=9.087mg/g；kd2=0.6018g/l，qmax2=13.80mg/g。圖3印跡微球和非印跡微球的吸附等溫線(a)及scathchard曲線(b)〔略〕fig.3adsorptionisotherms(a)andscatchardplots(b)ofadsorptionisothermsofmipsandnonimprintedpolymers(nips)3.3紅外光譜分析將sio2，vtm-sio2，mips〔模版洗脫后〕、mips〔未洗脫模版〕分別進(jìn)行紅外光譜分析(圖4)。比較圖4a和4b可見，在1413和1637cm－1有吸收峰，其中1413cm－1處是甲基的彎曲振動(dòng)，1637cm－1是cc的伸縮振動(dòng)，這表示清楚乙烯基硅烷成功的修飾到sio2微球外表。在圖4c和4d中，3500cm－1是oh的吸收峰，3150~3400cm－1是nh鍵的伸縮振動(dòng)區(qū)域，1725cm－1屬于cｏ的伸縮振動(dòng)。圖4d中，1450~1660cm－1屬于苯環(huán)的伸縮振動(dòng)，3100cm－1是苯環(huán)ch和乙烯基ch的伸縮振動(dòng)，而圖4c卻沒(méi)有這些峰，這表示清楚白藜蘆醇分子能夠從印跡微球外表洗脫干凈。圖4sio2(a)、乙烯基修飾的sio2(b)、mips(模板洗脫后)(c)、mips(未洗脫模板)(d)的紅外圖譜〔略〕fig.4irspectraofsio2(a)，sio2modifiedwithvinyl(b)，mips(afterelutingthetemplate)(c)，mips(beforeelutingtemplate)(d)3.４印跡微球?qū)⒄忍崛∫褐邪邹继J醇的分離采取hplc檢測(cè)白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，確定白藜蘆醇的出峰時(shí)間，分別檢測(cè)虎杖提取液、過(guò)柱液、洗脫液中白藜蘆醇的含量，如此圖５所示。比照虎杖提取液〔圖５b〕和過(guò)柱液〔圖５c〕的色譜圖，計(jì)算提取液中白藜蘆醇的含量為45.7%，過(guò)柱后溶液中白藜蘆醇含量為5.4%，這表示清楚虎杖提取液通過(guò)印跡分離柱，白藜蘆醇容易被印跡填充物吸附。用甲醇沖刷印跡柱后，再用v(甲醇)∶v(乙酸)=9∶1混合溶液洗脫，采集洗脫液、檢測(cè)，得色譜圖５d，柱洗脫液中白藜蘆醇含量為89.3%。結(jié)果表示清楚，本印跡填充材料具有較強(qiáng)的吸附性能，白藜蘆醇與印跡微球的結(jié)合鍵比較結(jié)實(shí)，能夠?qū)⒒⒄热芤褐械陌邹继J醇得到較好的分離。圖５白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)液(a)、虎杖提取液(b)、過(guò)柱后溶液(c)和柱洗脫液(d)的液相色譜圖〔略〕fig.５liquidchromatogramsofresveratrolstandardsolution(a)，extractingsolutionofrhizomapolygonicuspidati(b)，afterpassi