疫苗生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)課件

疫苗生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)和殘留物

病毒毒種?細胞培養(yǎng)體系?添加劑及殘留物控制

病毒性滅活疫苗關(guān)鍵點1(病毒種子)Latent/occultvirusesofsafetyconcern

invaccinecellsubstrates逆轉(zhuǎn)錄病毒：逆轉(zhuǎn)錄病毒(內(nèi)源或外源引入)α逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(禽白血病病毒,ALV)β逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(猴逆轉(zhuǎn)錄病毒,MPMV/SRV)γ逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(小鼠白血病病毒,MLV)RNA病毒：沙粒病毒脈絡(luò)叢腦膜炎(LCMV)DNA病毒：腺病毒－相關(guān)病毒

Hepadenaviruses（肝DNA病毒屬，包括鴨肝炎病毒）皰疹病毒乳頭瘤病毒屬多瘤病毒屬

宿主細胞殘余DNA細胞基質(zhì)——原代細胞優(yōu)點：1、可以使用較簡單的培養(yǎng)基和牛血清制備獲得，2、對大多數(shù)病毒均敏感適應(yīng)，可產(chǎn)生細胞病變?nèi)菀子^察。缺點：1、最大的缺點是污染外源性感染因子，如病毒；2、從不同的動物所獲得的培養(yǎng)物對擴增病毒的敏感性和質(zhì)量可能不同；3、非人靈長類動物很難獲得；4、獲得的動物臟器所制備的細胞往往是多種類細胞，不同批次不能保證獲得的細胞的一致性。原代細胞制備用動物SPF(specific-pathogen-free)

“closed”“封閉群”animalhusbandrywithoutanyintroductionofnewanimalsfromoutsidethemaintainedgrouppreventsintroductionofgeneticallytransmittedviralelements(e.g.,retroviralproviruses).

Recommendationsfortheevaluationofanimalcellculturesassubstratesforthemanufactureofbiologicalmedicinalproductsandforthecharacterizationofcellbanks，ProposedreplacementofTRS878,Annex1，WHO2008動物種群在5年以上未從外部引進其他新血緣品系，是由同一血緣品系進行隨意交配，并在固定場所保存繁殖的動物群。（實驗動物質(zhì)量控制）方喜業(yè)等，中國標準出版社，2008年）以非近親交配方式進行繁殖生產(chǎn)的實驗動物種群,在不從外部引入新個體的條件下,至少連續(xù)繁殖4代以上,稱為一個封閉群,或叫遠交群（醫(yī)學試驗動物學）細胞基質(zhì)——二倍體細胞優(yōu)點1、具有非常好的特性而且已經(jīng)標準化，2、可以建立細胞庫系統(tǒng)，細胞群體的一致性和重現(xiàn)性好，3、細胞庫包括MCB和WCB，以群體倍增（populationdoubling）和傳代水平（passagelevels）控制細胞，4、沒有如CCLs和SCLs安全性和致腫瘤性。缺點1、很難用于大規(guī)模生產(chǎn)，如微載體和懸浮培養(yǎng),目前已有應(yīng)用的報道；2、比其他的細胞培養(yǎng)基條件更高；3、需要更多的牛血清；4、很難適應(yīng)到無血清培養(yǎng)基；5、很難進行基因工程改造。細胞基質(zhì)——二倍體細胞傳代（Passagenumber）次代培養(yǎng)或傳代的次數(shù)，該傳代過程應(yīng)定期按比率或稀釋度進行，可以確定相對的培養(yǎng)年齡（代次）

群體倍增（Populationdoubling）群體細胞數(shù)量增加至兩倍

群體倍增時間（Populationdoublingtime）計算對數(shù)生長期時如從1.0X106到2.0X106個細胞的時間間隔，它與細胞世代時間不同義（不是真正意義上的一個細胞擴增至兩個，其關(guān)鍵在“群體”）

細胞世代時間（Cellgenerationtime）一個細胞分裂至兩個的連續(xù)的時間段，該時間可以用顯微照相術(shù)確定，但與群體倍增時間不同義。群體倍增水平（Populationdoublinglevel

）一個細胞系（株）從其最初的體外培養(yǎng)開始的群體倍增的總次數(shù)成活力（Viability）＞80％（指凍存細胞的復蘇狀況）低存活率的細胞庫復蘇將使群體倍增時間延長，表面看傳代次數(shù)不增加，但實際上細胞的群體倍增水平增加，導致細胞潛在的突變風險。SchaefferWIetal;TerminologyAssociatedwithCell,TissueandOrganCulture,MolecularBiologyandMolecularGenetics,InvitroCell.Dev.Biol.26:97-101,January1990二倍體細胞生產(chǎn)疫苗美國FDA對Vero細胞用于疫苗研制的建議2002年5月20日發(fā)表對以Vero細胞為基質(zhì)的病毒性疫苗研制者的信。CBER的意見認為Vero細胞作為病毒性疫苗的培養(yǎng)用細胞基質(zhì)是可以行的美國FDA對Vero細胞用于疫苗研制的建議Vero細胞生產(chǎn)的產(chǎn)品須無完整的Vero細胞雖然WHO目前已接受注射用傳代細胞產(chǎn)品DNA殘余量不超過10ng/劑。CBER建議須繼續(xù)關(guān)注產(chǎn)品中Vero細胞殘余DNA的量。殘余Vero細胞DNA的風險水平應(yīng)按不同情況不同處理，要考慮疫苗的給藥方法，如注射、粘膜或其他途徑。因此CBER建議：要確定終產(chǎn)品中殘余細胞DNA的量和DNA的大小，應(yīng)該在疫苗終產(chǎn)品中描述每人用劑量中含殘余DNA的量。由于使用了各種不同的處理方法（如DNA酶處理）細胞殘余DNA的量和大小可進一步下降，要評價已加入的生產(chǎn)工藝或考慮要加入的生產(chǎn)工藝以其減少DNA，應(yīng)注意由于改變工藝而引起潛在的產(chǎn)品質(zhì)量的影響（如免疫原性）

殘余物與添加劑為何對DNA表示擔憂原因1、細胞可能含有1)致腫瘤基因2)整合在細胞基因中的病毒基因2、生產(chǎn)疫苗用的細胞基因會帶入疫苗終產(chǎn)品中3、產(chǎn)品中的DNA通過注射進入使用者體內(nèi)導致的腫瘤病原體感染結(jié)果1、感染2、誘發(fā)腫瘤1）腫瘤基因的表達2）原癌基因的激活3）腫瘤抑制基因的關(guān)閉（失去功能）3、突變基因的插入激活、抑制功能喪失、正負調(diào)節(jié)功能的破壞去除或/和滅活rcDNA1、在生產(chǎn)過程中任何減少rcDNA的量，2、在生產(chǎn)過程中任何減小rcDNA片斷的大小3、在生產(chǎn)過程中使用任何化學物質(zhì)對rcDNA生物活性的滅活beta-propiolactone的滅活作用，DNA酶的消化處理經(jīng)口或鼻途徑給藥的產(chǎn)品，其DNA應(yīng)與NRA/NCA磋商，但腸溶產(chǎn)品應(yīng)嚴格考慮.PierrePerrin*andSylvieMorgeaux，InactivationofDNAbyb-propiolactone

Biologicals(1995)23,207–211Β-丙內(nèi)酯滅活病毒（裂解DNA/RNA）的原理β-丙內(nèi)酯（BPL）是一種烷化劑，能與包括核酸在內(nèi)的許多親核物質(zhì)反應(yīng)，PL對核酸的反應(yīng)主要與嘌呤殘基結(jié)構(gòu)的修飾（特別是鳥嘌呤）。它誘導DNA鏈打開缺口，使DNA和蛋白質(zhì)之間，以及雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA鏈之間發(fā)生交聯(lián)。因此，BPL被廣泛用于滅活病毒（DNA和RNA病毒）。此外，改變各種聚合酶對殘留/污染細胞DNA作為模板的能力，?BPL用于降低殘留/污染的細胞DNA生物制劑的風險。疫苗的添加劑是細胞培養(yǎng)疫苗在細胞培養(yǎng)過程中必須的添加劑，純化過程中已基本去除，質(zhì)量標準50ng/劑.最擔心瘋牛?。▊魅拘院＞d狀腦病、TSE）WHO：人及動物傳染性海綿狀腦病相關(guān)的醫(yī)用或其他制品的研討會報告（1997.3）ReportofaWHOConsultationonMedicinalandOtherProductsinRelationtoHumanandAnimalTransmissibleSpongiformEncephalitis疫苗的添加劑1、1980年-1996年在英國居住滿3個月者2、1980年-1990年在北歐的軍事基地居住滿3個月或在南歐滿6個月以上。3、1980年-目前在法國居住滿5年以上4、自1980年以來接受過輸血的人員。5、自1980年-目前在歐洲居住滿5年以上者。以上人員不能獻全血，但可以獻血漿，因為白蛋白的制備過程能去掉海綿狀腦病的致病因子；而英國、法國人兩者均不能。RevisedpreventivemeasurestoreducethepossibleriskoftransmissionofCreutzfeldt-Jakob(CJD)DiseaseandVariantCreutzfeldt-JakobDiseasebybloodandbloodproduct,FinalFDAguidancedocument,疫苗的添加劑國際上趨勢：疫苗中盡可能不用明膠凍干疫苗中凍干保護劑使用明膠：–動物源性明膠–豬源性明膠–牛源性明膠

牛皮源性明膠

牛骨源性明膠

絕不能使用頭骨和脊髓骨indicateotherwise.Forexample,susceptiblelambsfed