最新43飼料中粗蛋白的測定課件

43飼料中粗蛋白的測定43飼料中粗蛋白的測定

一、蛋白質(zhì)的測定方法2．間接法

通過測定樣品中總含氮量推算蛋白質(zhì)含量（根據(jù)：每種蛋白質(zhì)的含氮量是恒定的，N×6.25）。凱氏定氮法（Kjeldahl）8~9小時杜馬斯燃燒定氮法（DumasCombustionMethod）—900℃~1200℃高溫燃燒，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體，其中的干擾成分被一系列適當?shù)奈談┧?，混合氣體中的氮氧化物被全部還原成分子氮，隨后氮的含量被熱導(dǎo)檢測器檢測。3～5分鐘強堿直接蒸餾法

—樣品在強堿溶液中消煮，使蛋白質(zhì)中的不穩(wěn)定氮素以氨的形式釋放出來，在一定條件下，所釋放的氨和樣品中的含氮量成正比且有很好的相關(guān)性，建立不穩(wěn)定氮量與全氮量之間的回歸方程?！?0分鐘

納氏試劑比色法一、蛋白質(zhì)的測定方法2．間接法

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量19世紀（1883）建立的經(jīng)典方法，結(jié)果可靠（最常用的標準方法），凱氏定氮法由于具有測定總有機氮量準確度高，可測定各種不同形態(tài)樣品等兩大優(yōu)點，因而被公認為是測定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質(zhì)含量的標準分析方法。但操作費時（8～9h）——改良方法：加催化劑加快分析速度、儀器改進（自動、半自動凱氏定氮儀）。

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量19世紀（1883）建立的經(jīng)

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理

各種飼料的有機物質(zhì)在還原性催化劑（如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉）的幫助下，用濃硫酸進行消化作用，使蛋白質(zhì)和其它有機態(tài)氮（如氨基酸、酰胺、核酸，在一定處理下也包括硝酸態(tài)氨）都轉(zhuǎn)變成NH4+并與H2SO4化合成（NH4）2SO4，而非含氮物質(zhì)，則以CO2↑，H2O↑，SO2↑狀態(tài)逸出。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標準鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標準酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理

：使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮；

：將有機物炭化后的碳化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫；

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。

H2SO4＋2NH3

＝(NH4)2SO42NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4

＋6CO2＋12SO2

＋16H2O①樣品消化濃硫酸具有脫水性濃硫酸具有氧化性二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理2NH2(CH)2最新43飼料中粗蛋白的測定課件最新43飼料中粗蛋白的測定課件

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理

消化液在濃堿的作用下進行蒸餾，釋放出的氨態(tài)氮，用硼酸溶液吸收之并與之結(jié)合成為四硼酸銨。

②蒸餾2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3↓＋Na2SO4＋2H2O2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理②蒸餾2NaOH

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理

以甲基紅－溴甲酚綠作指示劑，用HCl標準溶液（0.1mol/L）滴定，根據(jù)標準酸的消耗量，即可計算有機氮的含量。而后，根據(jù)不同的飼料再乘以一定的系數(shù)（通常用6.25系數(shù)計算），即為粗蛋白質(zhì)的含量。③滴定

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理③滴定(NH4

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量凱氏定氮瓶（或消化管）及蒸餾裝置硫酸銅硫酸鉀硫酸2%硼酸溶液

40%氫氧化鈉溶液0.2%甲基紅0.2%溴甲酚綠0.2%甲基紅及0.2%溴甲酚綠的1+5混合指示劑0.1mol/L的標準鹽酸溶液(或1/2硫酸溶液)2.主要儀器及試劑二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量凱氏定氮瓶（或消化管）及蒸餾

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第一步樣品消化

稱取適量樣品0.5~1g（含氮量5～80mg），無損失（用濾紙包好）地放入干燥凱氏燒瓶或消化管中，加入0.2g硫酸銅（CuSO4·5H2O），3g無水硫酸鉀（或無水硫酸鈉）及10mL硫酸，輕輕搖勻后進行消化。（樣品＋CuSO4·5H2O＋K2SO4＋濃硫酸）透明藍綠色空白試驗：取與處理樣品相同量的硫酸銅，硫酸鉀，硫酸按同一方法作試劑空白試驗。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟空白試驗：取與

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第一步樣品消化

硫酸銅/無水硫酸鉀（或無水硫酸鈉）的作用？（大家想想?。?/p>

（1）K2SO4或Na2SO4的作用：提高溶液的沸點而加快有機物的分解；K2SO4+H2SO4=2KHSO4

2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第一步樣品消化

硫酸銅/無水硫酸鉀（或無水硫酸鈉）的作用？（大家想想?。?/p>

（2）CuSO4的作用

①催化劑，加速氧化分解；

2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

此反應(yīng)不斷進行，待有機物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍綠色。

②可以指示消化終點的到達；

③下一步蒸餾時作為堿性反應(yīng)（加入堿量）的指示劑。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第一步樣品消化注意事項：總氮測定時，消化至關(guān)重要。①消化在通風(fēng)櫥中進行（若無通風(fēng)櫥......）。②在消化開始時，應(yīng)控制火力（應(yīng)從低溫開始分階段升溫至360～410℃

），保持緩慢沸騰，避免試樣濺于瓶壁，難于消化使氨損失。③實驗中要保證硫酸足量，否則過多的硫酸鉀形成硫酸氫鉀，而削弱了硫酸的消化作用。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第二步氨的蒸餾

樣品分解液定容

試樣消煮液令卻，小心加20ml水，移人100ml容量瓶中，冷卻后，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容置瓶中，再加水至刻度，作為試樣分解液備用。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第二步氨的蒸餾

蒸餾

①蒸汽發(fā)生器的準備：裝好定氮裝量，于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝蒸餾水至約2／3處，加甲基紅指示液數(shù)滴及硫酸數(shù)滴，以保持水呈酸性（水為橙紅色，否則補加硫酸，大家想想為什么？）。加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸，用調(diào)壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。防止水中氨態(tài)氮的逸失而影響測定值。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟防止水中氨態(tài)氮

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第二步氨的蒸餾

蒸餾②硼酸溶液的準備：向接收瓶內(nèi)加入20mL2%硼酸及2滴混合指示劑并使冷凝管下端插入液面下。

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第二步氨的蒸餾

蒸餾③開始蒸餾：吸取10.0mL樣品消化稀釋液注入凱氏定氮儀的反應(yīng)室中，用10mL蒸餾水沖洗進樣入口，再加10mL40%氫氧化鈉溶液入反應(yīng)室（動作要快，以防氨逸出），塞好入口玻璃塞，在入口處加水密封，防止漏氣。打開水蒸汽發(fā)生器與反應(yīng)室之間的夾子，蒸汽通入反應(yīng)室使氨氣被蒸發(fā)出來，并通過冷凝管而進入接收瓶內(nèi)，以第一滴餾液滴下開始計時，蒸餾5min，使冷凝管離開吸收液面，在蒸餾1min，用水沖洗冷凝管末端，洗液流入接收瓶中，取下接收瓶。最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸！二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第二步氨的蒸餾注意事項：凱氏定氮蒸餾過程中，要求整套裝置呈密閉狀態(tài)，蒸餾前應(yīng)檢查定氮儀各導(dǎo)管間的連接處是否密閉，以免產(chǎn)生泄露；測定樣品前應(yīng)清洗蒸餾裝置，即用蒸餾水空蒸一次或數(shù)次；蒸餾后立即清洗蒸餾器。蒸餾完畢后，移取熱源，夾緊蒸汽發(fā)生器和收集器間的橡皮管，此時由于收集器溫度突然下降，即可將反應(yīng)室殘液吸至收集器。蒸餾時，火力穩(wěn)定，蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾中途不得?；饠嗥?，否則發(fā)生倒吸。加堿要足量（反應(yīng)室液體呈深藍色或褐色）并且堿液不能污染冷凝管及接收瓶。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第三步滴定用微量酸式滴定管，以0.1或0.02mol/L鹽酸標準溶液進行滴定，溶液由藍綠色變?yōu)榛壹t色為終點?？瞻自囼灒和瑫r取10.0mL空白消化稀釋液同上操作，以校正藥品不純所發(fā)生的誤差。

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量4．結(jié)果計算CP——樣品中蛋白質(zhì)的含量（%）；V1——樣品消耗鹽酸標準液的體積（mL）；V2——空白實驗消耗鹽酸標準液的體積（mL）；C——鹽酸標準溶液通過標定后的摩爾濃度（mol/L）；0.014——每毫升鹽酸標準液（1mol/L）相當于氮的克數(shù)；m——樣品質(zhì)量（g）；6.25——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)（換算系數(shù)）。（大家想想6.25是如何計算出來的？）二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量4．結(jié)果計算

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量5.方法的評價凱氏法的優(yōu)點是適用范圍廣，可用于動植物的各種組織，器官、各種飼料等成組復(fù)雜樣品的測定，只要細心操作都能得到較準確的結(jié)果，至今仍被作為標準檢驗方法。但此法靈敏度低，適用于0.2-1.0mg氮，操作比較復(fù)雜，所需時間長。

用凱氏定氮法通過測總氮量來確定蛋白質(zhì)含量，包含了核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉、以及含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物，所以這樣的測定結(jié)果稱為粗蛋白。

事件二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量5.方法的評價事件

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量5.方法的評價不同的蛋白質(zhì)其氨基酸組成及比例方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同（約在14.7～19.5％，平均為16％），因而不同蛋白質(zhì)系數(shù)也不一樣。

Tyr（酪氨酸）：分子量181.9，含氮量7.69；Ala（丙氨酸）：分子量89.1，含氮量15.7；Lys（賴氨酸）：分子量146.9，含氮量9.06。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量5.方法的評價Tyr（酪氨

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（一）雙縮脲法（Biuret法）1．原理

雙縮脲是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。NH2-CO-NH2+NH2-CO-NH2

NH2-CO-NH-CO-NH2

+NH3

在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)及多肽含有兩個以上的肽鍵（—CO—NH—），與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似，也能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其最大光吸收在540nm處。其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸的組成無關(guān)。故可用來測定蛋白質(zhì)含量。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（一）雙縮脲法

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（一）雙縮脲法（Biuret法）1．原理

在一定條件下，未知樣品的溶液與標準蛋白質(zhì)溶液同時反應(yīng)，并于540—560nm下比色，可以通過標準蛋白質(zhì)的標準曲線求出未知的蛋白質(zhì)濃度，標準蛋白溶液可以用結(jié)晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（一）雙縮脲法（B

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（一）雙縮脲法（Biuret法）2．方法評價該法的優(yōu)點是樣品不需消化處理，結(jié)果為飼料中蛋白質(zhì)的真實含量，操作簡單，具有快速、準確等優(yōu)點。但二肽含量不能測定（想想為什么？）。該法靈敏度低，測定蛋白質(zhì)的濃度范圍適于1~10mg/mL。雙縮脲法常用于蛋白質(zhì)的快速測定，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。除-CO-NH-有此反應(yīng)外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等基團亦有此反應(yīng)。

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（一）雙縮脲法（B

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（二）Folin-酚試劑法(Lowry法)1．原理

此法的顯色原理與雙縮脲方法相同，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。

這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色，原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸或色氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（二）Folin-

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（二）Folin-酚試劑法(Lowry法)2．方法評價本法的優(yōu)點是操作簡便、靈敏度高,定量范圍為5～100μg蛋白質(zhì)，較雙縮脲法靈敏100倍。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。Folin試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度（相對于標準蛋白質(zhì)）。Folin—酚試劑的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購）。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（二）Folin-

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法1．原理

蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。

此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法2．方法評價紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的(NH4)2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標準曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法2．方法評價若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當?shù)男Ｕ５且驗椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時的ph要與測定標準曲線的pH相一致。因Lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（四）考馬斯亮藍染色法1．原理

考馬斯亮藍G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（四）考馬斯亮藍染

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。該法是1976年Bradford建立，因而又叫Bradford法。PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+（四）考馬斯亮藍染色法1．原理三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）經(jīng)研究認為，染料主

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）試劑配制簡單，干擾物質(zhì)少，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定濃度范圍為0～1000μg/mL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。操作簡便快捷，完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。（四）考馬斯亮藍染色法2．方法評價三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）試劑配制簡單，干擾

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（四）考馬斯亮藍染色法2．方法評價有些陽離子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物質(zhì)不干擾測定，但大量的去污劑如TritonX-100、SDS等嚴重干擾測定。由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用γ—球蛋白為標準蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（四）考馬斯亮藍染相關(guān)事件三鹿毒奶粉事件（2008）美國寵物飼料事件：“寵物毒糧”

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一、蛋白質(zhì)的測定方法2．間接法

通過測定樣品中總含氮量推算蛋白質(zhì)含量（根據(jù)：每種蛋白質(zhì)的含氮量是恒定的，N×6.25）。凱氏定氮法（Kjeldahl）8~9小時杜馬斯燃燒定氮法（DumasCombustionMethod）—900℃~1200℃高溫燃燒，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體，其中的干擾成分被一系列適當?shù)奈談┧?，混合氣體中的氮氧化物被全部還原成分子氮，隨后氮的含量被熱導(dǎo)檢測器檢測。3～5分鐘強堿直接蒸餾法

—樣品在強堿溶液中消煮，使蛋白質(zhì)中的不穩(wěn)定氮素以氨的形式釋放出來，在一定條件下，所釋放的氨和樣品中的含氮量成正比且有很好的相關(guān)性，建立不穩(wěn)定氮量與全氮量之間的回歸方程。～20分鐘

納氏試劑比色法一、蛋白質(zhì)的測定方法2．間接法

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量19世紀（1883）建立的經(jīng)典方法，結(jié)果可靠（最常用的標準方法），凱氏定氮法由于具有測定總有機氮量準確度高，可測定各種不同形態(tài)樣品等兩大優(yōu)點，因而被公認為是測定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質(zhì)含量的標準分析方法。但操作費時（8～9h）——改良方法：加催化劑加快分析速度、儀器改進（自動、半自動凱氏定氮儀）。

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量19世紀（1883）建立的經(jīng)

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理

各種飼料的有機物質(zhì)在還原性催化劑（如CuSO4，K2SO4或Na2SO4或Se粉）的幫助下，用濃硫酸進行消化作用，使蛋白質(zhì)和其它有機態(tài)氮（如氨基酸、酰胺、核酸，在一定處理下也包括硝酸態(tài)氨）都轉(zhuǎn)變成NH4+并與H2SO4化合成（NH4）2SO4，而非含氮物質(zhì)，則以CO2↑，H2O↑，SO2↑狀態(tài)逸出。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標準鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標準酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理

：使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮；

：將有機物炭化后的碳化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫；

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。

H2SO4＋2NH3

＝(NH4)2SO42NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4

＋6CO2＋12SO2

＋16H2O①樣品消化濃硫酸具有脫水性濃硫酸具有氧化性二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理2NH2(CH)2最新43飼料中粗蛋白的測定課件最新43飼料中粗蛋白的測定課件

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理

消化液在濃堿的作用下進行蒸餾，釋放出的氨態(tài)氮，用硼酸溶液吸收之并與之結(jié)合成為四硼酸銨。

②蒸餾2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3↓＋Na2SO4＋2H2O2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理②蒸餾2NaOH

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理

以甲基紅－溴甲酚綠作指示劑，用HCl標準溶液（0.1mol/L）滴定，根據(jù)標準酸的消耗量，即可計算有機氮的含量。而后，根據(jù)不同的飼料再乘以一定的系數(shù)（通常用6.25系數(shù)計算），即為粗蛋白質(zhì)的含量。③滴定

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量1.原理③滴定(NH4

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量凱氏定氮瓶（或消化管）及蒸餾裝置硫酸銅硫酸鉀硫酸2%硼酸溶液

40%氫氧化鈉溶液0.2%甲基紅0.2%溴甲酚綠0.2%甲基紅及0.2%溴甲酚綠的1+5混合指示劑0.1mol/L的標準鹽酸溶液(或1/2硫酸溶液)2.主要儀器及試劑二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量凱氏定氮瓶（或消化管）及蒸餾

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第一步樣品消化

稱取適量樣品0.5~1g（含氮量5～80mg），無損失（用濾紙包好）地放入干燥凱氏燒瓶或消化管中，加入0.2g硫酸銅（CuSO4·5H2O），3g無水硫酸鉀（或無水硫酸鈉）及10mL硫酸，輕輕搖勻后進行消化。（樣品＋CuSO4·5H2O＋K2SO4＋濃硫酸）透明藍綠色空白試驗：取與處理樣品相同量的硫酸銅，硫酸鉀，硫酸按同一方法作試劑空白試驗。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟空白試驗：取與

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第一步樣品消化

硫酸銅/無水硫酸鉀（或無水硫酸鈉）的作用？（大家想想?。?/p>

（1）K2SO4或Na2SO4的作用：提高溶液的沸點而加快有機物的分解；K2SO4+H2SO4=2KHSO4

2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第一步樣品消化

硫酸銅/無水硫酸鉀（或無水硫酸鈉）的作用？（大家想想！）

（2）CuSO4的作用

①催化劑，加速氧化分解；

2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

此反應(yīng)不斷進行，待有機物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍綠色。

②可以指示消化終點的到達；

③下一步蒸餾時作為堿性反應(yīng)（加入堿量）的指示劑。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第一步樣品消化注意事項：總氮測定時，消化至關(guān)重要。①消化在通風(fēng)櫥中進行（若無通風(fēng)櫥......）。②在消化開始時，應(yīng)控制火力（應(yīng)從低溫開始分階段升溫至360～410℃

），保持緩慢沸騰，避免試樣濺于瓶壁，難于消化使氨損失。③實驗中要保證硫酸足量，否則過多的硫酸鉀形成硫酸氫鉀，而削弱了硫酸的消化作用。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第二步氨的蒸餾

樣品分解液定容

試樣消煮液令卻，小心加20ml水，移人100ml容量瓶中，冷卻后，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容置瓶中，再加水至刻度，作為試樣分解液備用。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第二步氨的蒸餾

蒸餾

①蒸汽發(fā)生器的準備：裝好定氮裝量，于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝蒸餾水至約2／3處，加甲基紅指示液數(shù)滴及硫酸數(shù)滴，以保持水呈酸性（水為橙紅色，否則補加硫酸，大家想想為什么？）。加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸，用調(diào)壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。防止水中氨態(tài)氮的逸失而影響測定值。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟防止水中氨態(tài)氮

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第二步氨的蒸餾

蒸餾②硼酸溶液的準備：向接收瓶內(nèi)加入20mL2%硼酸及2滴混合指示劑并使冷凝管下端插入液面下。

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第二步氨的蒸餾

蒸餾③開始蒸餾：吸取10.0mL樣品消化稀釋液注入凱氏定氮儀的反應(yīng)室中，用10mL蒸餾水沖洗進樣入口，再加10mL40%氫氧化鈉溶液入反應(yīng)室（動作要快，以防氨逸出），塞好入口玻璃塞，在入口處加水密封，防止漏氣。打開水蒸汽發(fā)生器與反應(yīng)室之間的夾子，蒸汽通入反應(yīng)室使氨氣被蒸發(fā)出來，并通過冷凝管而進入接收瓶內(nèi)，以第一滴餾液滴下開始計時，蒸餾5min，使冷凝管離開吸收液面，在蒸餾1min，用水沖洗冷凝管末端，洗液流入接收瓶中，取下接收瓶。最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸！二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第二步氨的蒸餾注意事項：凱氏定氮蒸餾過程中，要求整套裝置呈密閉狀態(tài)，蒸餾前應(yīng)檢查定氮儀各導(dǎo)管間的連接處是否密閉，以免產(chǎn)生泄露；測定樣品前應(yīng)清洗蒸餾裝置，即用蒸餾水空蒸一次或數(shù)次；蒸餾后立即清洗蒸餾器。蒸餾完畢后，移取熱源，夾緊蒸汽發(fā)生器和收集器間的橡皮管，此時由于收集器溫度突然下降，即可將反應(yīng)室殘液吸至收集器。蒸餾時，火力穩(wěn)定，蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾中途不得停火斷汽，否則發(fā)生倒吸。加堿要足量（反應(yīng)室液體呈深藍色或褐色）并且堿液不能污染冷凝管及接收瓶。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

第三步滴定用微量酸式滴定管，以0.1或0.02mol/L鹽酸標準溶液進行滴定，溶液由藍綠色變?yōu)榛壹t色為終點?？瞻自囼灒和瑫r取10.0mL空白消化稀釋液同上操作，以校正藥品不純所發(fā)生的誤差。

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量3.測定步驟

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量4．結(jié)果計算CP——樣品中蛋白質(zhì)的含量（%）；V1——樣品消耗鹽酸標準液的體積（mL）；V2——空白實驗消耗鹽酸標準液的體積（mL）；C——鹽酸標準溶液通過標定后的摩爾濃度（mol/L）；0.014——每毫升鹽酸標準液（1mol/L）相當于氮的克數(shù)；m——樣品質(zhì)量（g）；6.25——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)（換算系數(shù)）。（大家想想6.25是如何計算出來的？）二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量4．結(jié)果計算

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量5.方法的評價凱氏法的優(yōu)點是適用范圍廣，可用于動植物的各種組織，器官、各種飼料等成組復(fù)雜樣品的測定，只要細心操作都能得到較準確的結(jié)果，至今仍被作為標準檢驗方法。但此法靈敏度低，適用于0.2-1.0mg氮，操作比較復(fù)雜，所需時間長。

用凱氏定氮法通過測總氮量來確定蛋白質(zhì)含量，包含了核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉、以及含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物，所以這樣的測定結(jié)果稱為粗蛋白。

事件二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量5.方法的評價事件

二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量5.方法的評價不同的蛋白質(zhì)其氨基酸組成及比例方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同（約在14.7～19.5％，平均為16％），因而不同蛋白質(zhì)系數(shù)也不一樣。

Tyr（酪氨酸）：分子量181.9，含氮量7.69；Ala（丙氨酸）：分子量89.1，含氮量15.7；Lys（賴氨酸）：分子量146.9，含氮量9.06。二、凱氏定氮法測定粗蛋白含量5.方法的評價Tyr（酪氨

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（一）雙縮脲法（Biuret法）1．原理

雙縮脲是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。NH2-CO-NH2+NH2-CO-NH2

NH2-CO-NH-CO-NH2

+NH3

在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)及多肽含有兩個以上的肽鍵（—CO—NH—），與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似，也能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其最大光吸收在540nm處。其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸的組成無關(guān)。故可用來測定蛋白質(zhì)含量。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（一）雙縮脲法

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（一）雙縮脲法（Biuret法）1．原理

在一定條件下，未知樣品的溶液與標準蛋白質(zhì)溶液同時反應(yīng)，并于540—560nm下比色，可以通過標準蛋白質(zhì)的標準曲線求出未知的蛋白質(zhì)濃度，標準蛋白溶液可以用結(jié)晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（一）雙縮脲法（B

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（一）雙縮脲法（Biuret法）2．方法評價該法的優(yōu)點是樣品不需消化處理，結(jié)果為飼料中蛋白質(zhì)的真實含量，操作簡單，具有快速、準確等優(yōu)點。但二肽含量不能測定（想想為什么？）。該法靈敏度低，測定蛋白質(zhì)的濃度范圍適于1~10mg/mL。雙縮脲法常用于蛋白質(zhì)的快速測定，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。除-CO-NH-有此反應(yīng)外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等基團亦有此反應(yīng)。

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（一）雙縮脲法（B

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（二）Folin-酚試劑法(Lowry法)1．原理

此法的顯色原理與雙縮脲方法相同，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。

這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色，原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸或色氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（二）Folin-

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（二）Folin-酚試劑法(Lowry法)2．方法評價本法的優(yōu)點是操作簡便、靈敏度高,定量范圍為5～100μg蛋白質(zhì)，較雙縮脲法靈敏100倍。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。Folin試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度（相對于標準蛋白質(zhì)）。Folin—酚試劑的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購）。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（二）Folin-

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法1．原理

蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。

此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法

三、蛋白質(zhì)含量測定的其它方法（直接法）（三）紫外吸收法2．方法評價紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的(NH4)2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不