DNA的重組與轉(zhuǎn)座課件

第六章

DNA重組1第六章

DNA重組1基因組的可變性和穩(wěn)定性之間必須維持一個恰到好處的平衡，這樣才能使生物體得以生存并能世代相傳，繁衍不息。染色體的遺傳差異主要由兩種機(jī)制產(chǎn)生，一種是突變，一種是遺傳重組。2基因組的可變性和穩(wěn)定性之間必須維持一個恰到好處的平衡，這樣才突變和重組是提供進(jìn)化起始物質(zhì)的兩個過程。突變引起的遺傳改變能引起蛋白質(zhì)中氨基酸序列的變化，該變化引起表型的改變，通過自然選擇發(fā)生作用。重組提供一個基因組結(jié)構(gòu)的變化，也會引起表型的變化，也通過自然選擇發(fā)揮作用。3突變和重組是提供進(jìn)化起始物質(zhì)的兩個過程。3

DNA重組（recombination）是指發(fā)生在DNA分子內(nèi)或DNA分子之間核苷酸序列的交換、重排和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，是已有遺傳物質(zhì)的重新組合過程。4DNA重組（recombinatio遺傳重組的存在確保了遺傳物質(zhì)代與代之間基因組的重排，從而形成一個物種內(nèi)部個體之間的遺傳差異。遺傳重組不僅僅發(fā)生于代與代之間，一個個體的基因組也可以發(fā)生重排。重組不只是在減數(shù)分裂和體細(xì)胞核基因中發(fā)生，也在線粒體基因間和葉綠體基因間發(fā)生。5遺傳重組的存在確保了遺傳物質(zhì)代與代之間基因組的重排，從而形DNA重組的意義是能迅速增加群體的遺傳多樣性，通過優(yōu)化組合積累有利突變，推動生物進(jìn)化。此外，DNA重組還參與DNA損傷修復(fù)，某些基因表達(dá)的調(diào)控等重要的生物學(xué)過程。6DNA重組的意義是能迅速增加群體的遺傳多樣性，通過優(yōu)化組合積根據(jù)不同的機(jī)制，可將重組分成4類：同源性重組（homologousrecombination）位點特異性重組（site-specificrecombination）異常重組（illegitimaterecombination)轉(zhuǎn)座重組（transpositionrecombination）7根據(jù)不同的機(jī)制，可將重組分成4類：7許多重組反應(yīng)利用不止一種機(jī)制進(jìn)行，例如免疫球蛋白VDJ連接涉及到位點特異性識別和類似異常重組的過程；酵母接合型的轉(zhuǎn)換既有同源性重組和位點特異性重組的特征，也具有復(fù)制轉(zhuǎn)座過程的特征。通過同源性重組將DNA序列引入真核基因組已經(jīng)為研究高等生物開辟了一條新途徑。8許多重組反應(yīng)利用不止一種機(jī)制進(jìn)行，例如免疫球蛋白VDJ連接涉用人工操作構(gòu)建DNA重組體，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)，稱為DNA克隆或分子克?。╩olecularcloning）。9用人工操作構(gòu)建DNA重組體，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)，稱為第一節(jié)同源重組同源重組（homologousrecombination）發(fā)生在兩個同源DNA片段之間，是在兩個DNA分子的同源序列之間直接進(jìn)行交換的一種重組形式。同源重組主要是利用DNA序列的同源性識別重組對象，由堿基序列提供識別的特異性。同源性重組最主要特征是相關(guān)的酶可以利用任何一對同源序列為底物。10第一節(jié)同源重組同源重組（homologousrecomb真核生物減數(shù)分裂時的染色體之間的交換，某些低等真核生物及細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合，噬菌體的整合等都屬于同源性重組這一類型。在整個基因組中，同源重組的頻率并不恒定，并且跟染色體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。例如在異染色體附近遺傳物質(zhì)的交換要受到抑制。11真核生物減數(shù)分裂時的染色體之間的交換，某些低等真核生物及細(xì)菌1.進(jìn)行同源重組的基本條件（1）在交換區(qū)具有相同或相似的序列發(fā)生同源性重組的兩個區(qū)域的核苷酸序列必須是相同或非常相似的。同源性重組常常只發(fā)生在兩個DNA分子中的相同部位。121.進(jìn)行同源重組的基本條件（1）在交換區(qū)具有相同或相似的序（2）雙鏈DNA分子之間互補(bǔ)堿基進(jìn)行配對兩個DNA分子的鏈之間互補(bǔ)的堿基配對確保重組只發(fā)生在同樣的基因座之間。在該部位兩個雙鏈DNA分子通過鏈之間互補(bǔ)的堿基配對被維系在一起稱為聯(lián)會。13（2）雙鏈DNA分子之間互補(bǔ)堿基進(jìn)行配對13（3）重組酶參與重組反應(yīng)的酶，保證重組的順利進(jìn)行。重組過程中，每個分子的鏈?zhǔn)紫葦嗔?，然后進(jìn)行修復(fù)和連接，兩個DNA分子之間發(fā)生交換。重組完成后，重組分子的解離和釋放等過程均是在酶催化下進(jìn)行的。14（3）重組酶14（4）異源雙鏈區(qū)的形成同源性重組時，在兩個DNA分子之間互補(bǔ)堿基配對的區(qū)域稱為異源雙鏈區(qū)（heteroduplexregion）。兩個DNA分子通過一段異源DNA雙螺旋共價相互連接。15（4）異源雙鏈區(qū)的形成1516162.同源性重組的分子模型第一個被廣泛接受的重組模型是1964年由RobinHolliday提出的Holliday模型。即將發(fā)生重組的兩個DNA分子同一個部位的兩個單鏈的斷裂，從而引發(fā)重組。兩個斷裂單鏈的游離端彼此交換，形成兩個異源雙鏈，然后末端連接形成Holliday連接體（HollidayJunction）。（1）Holliday模型172.同源性重組的分子模型第一個被廣泛接受的重組模型是19620182018一旦Holliday連接體形成后，它能進(jìn)行重排從而改變鏈的彼此關(guān)系。這種重排稱為異構(gòu)化，因為在此過程中沒有鍵的割裂。一旦形成Holliday連接體后，就能被拆分。是否發(fā)生重組依賴于拆分時Holliday連接體的構(gòu)象。19一旦Holliday連接體形成后，它能進(jìn)行重排從而改變鏈的彼22202220232123212422242225232523Holliday模型被稱為雙鏈侵入模型，因為由于每一個DNA分子的一條鏈侵入到另一個DNA分子，它解釋了在重組時兩個DNA分子的異源雙鏈?zhǔn)侨绾涡纬傻?。Holliday連接體也能通過堿基之間氫鍵的斷裂和再連接而發(fā)生左右移動。這個過程稱為支鏈遷移（branchmigration)。24Holliday模型被稱為雙鏈侵入模型，因為由于每一個DNA27252725Holliday認(rèn)為在DNA分子上存在某些位點，特殊的引發(fā)重組的酶能夠識別這些位點，確保兩條鏈在相同的部位被切斷。目前還沒有足夠的證據(jù)證明這些位點的存在。26Holliday認(rèn)為在DNA分子上存在某些位點，特殊的引發(fā)重（2）單鏈侵入模型單鏈侵入模型是對Holliday模型的修改。在該模型中，兩個DNA分子中的一個單鏈在隨機(jī)部位被切斷，然后暴露的末端侵入到另一個雙鏈DNA分子，發(fā)現(xiàn)它的互補(bǔ)序列以后將替代與它相同的鏈。然后DNA聚合酶將用留下的那條鏈作為模板，填充上侵入鏈所留下的缺口。被替代的鏈被降解，它的殘留末端與另一分子中新合成的DNA鏈相連接形成Holliday連接體。27（2）單鏈侵入模型2730283028Holliday連接體形成以后，就會產(chǎn)生異構(gòu)化然后拆分。單鏈侵入模型中，異源雙鏈?zhǔn)紫戎辉趦蓚€DNA分子中的一個形成。Holliday中間體形成以后通過支鏈遷移能夠在另一個DNA分子上產(chǎn)生異源雙鏈，這樣就解釋了異源雙鏈?zhǔn)侨绾涡纬傻摹?9Holliday連接體形成以后，就會產(chǎn)生異構(gòu)化然后拆分。29⑦⑤30⑦⑤30（3）雙鏈斷裂修復(fù)模型目前證明通過兩個DNA分子之中的一個雙鏈斷裂引發(fā)重組是個常見的機(jī)制。該模型認(rèn)為參與重組的兩個DNA分子之一的兩條鏈被核酸內(nèi)切酶切斷，然后在核酸外切酶作用下產(chǎn)生3’單鏈黏性末端。兩個3’游離末端之一侵入到另一個雙螺旋的同源區(qū)，置換“供體”雙螺旋的一個單鏈而形成一段異源雙鏈DNA，并同時產(chǎn)生一個D環(huán)（D-loop）。31（3）雙鏈斷裂修復(fù)模型313432343235333533D環(huán)在DNA聚合酶的作用下修補(bǔ)而擴(kuò)展，直至D環(huán)的長度與“受體”DNA雙螺旋缺口長度相當(dāng)，互補(bǔ)的兩條單鏈退火。此時在缺口的兩側(cè)各有一段異源雙鏈DNA，兩個雜合雙螺旋之間為斷裂的缺口，并且此缺口為供體DNA序列所填充。缺口處雙鏈的完整性可以被以缺口3’端為起始的修補(bǔ)合成來修復(fù)。缺口是被兩次單鏈DNA的合成而修復(fù)的。34D環(huán)在DNA聚合酶的作用下修補(bǔ)而擴(kuò)展，直至D環(huán)的長度與“受體3735373538363836

大腸桿菌重組的分子基礎(chǔ)在分子水平上，重組事件發(fā)生的先后順序是相似的：從一個已斷裂的分子中產(chǎn)生的單鏈與其對應(yīng)的雙螺旋發(fā)生作用，配對區(qū)間擴(kuò)展，重組中間體形成直到核酸內(nèi)切酶解離此兩個雙螺旋分子。識別反應(yīng)是重組機(jī)制的不可分割的重要部分，并且只涉及到DNA分子的特定區(qū)域而不是整個完整的染色體。37大腸桿菌重組的分子基礎(chǔ)在分子水平上，重組事件發(fā)生的先后順序1.

chi位點和RecBCD核酸酶在λ噬菌體的一些突變種內(nèi)，存在一些稱為chi的位點。chi位點單一的堿基對的改變即可激發(fā)重組的發(fā)生。這些位點皆含有一個恒定的非對稱的8bp序列：

5’GCTGGTGC3’3’CGACCACC5’381.chi位點和RecBCD核酸酶在λ噬菌體的一些突變種內(nèi)Chi位點是一個由基因recBCD編碼的RecBCD酶作用的靶部位。RecBCD酶是一種多功能酶，具有幾種不同的活性。它是一個強(qiáng)有力的降解DNA的核酸酶，早期被檢定為活性核酸外切酶V，具有解旋酶的活性。RecBCD所介導(dǎo)的解旋和切割可以被用來產(chǎn)生末端，并引發(fā)異源雙鏈的形成。39Chi位點是一個由基因recBCD編碼的RecBCD酶作用4240424043414341444244422.RecA和Holliday連接體的形成RecA具有兩種相當(dāng)不同的活性:RecA可以促進(jìn)單鏈DNA與其在雙鏈DNA分子中互補(bǔ)的DNA鏈的堿基相配對。RecA還可以在SOS反應(yīng)中激活蛋白酶。RecA需要單鏈DNA和ATP才能激活蛋白酶。432.RecA和Holliday連接體的形成RecA具有兩種RecA能夠利用由RecBCD在Chi位點附近切割所釋放的單鏈3’末端。RecA的DNA操作酶活性可以使一個單鏈DNA與雙螺.旋中的同源序列發(fā)生置換，這一反應(yīng)被稱為單鏈攝取(single-stranduptake)或單鏈同化(single-strandassimilation)。44RecA能夠利用由RecBCD在Chi位點附近切割所釋放的單4545464647473.Ruv蛋白和Holliday連接體的拆分大腸桿菌有一組由三個基因編碼與隨后的重組相關(guān)聯(lián)的蛋白。ruvA和ruvB

基因的產(chǎn)物促進(jìn)異源雙鏈的形成。RuvA蛋白可以識別Holliday連接體的結(jié)構(gòu)，RuvB是一個腺苷三磷酸酶并可能提供支鏈遷移的動力。483.Ruv蛋白和Holliday連接體的拆分大腸桿菌有一RuvA在交叉點處與DNA所有的4條鏈相結(jié)合，在交叉點的上游，兩個RuvB六聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)分別與每個雙螺旋相結(jié)合。RuvAB蛋白復(fù)合體可以使支鏈以10～20bp的速度遷移。49RuvA在交叉點處與DNA所有的4條鏈相結(jié)合，在交叉點的上第三個基因ruvC編碼一種能夠特異性地識別Holliday連接體的核酸內(nèi)切酶，此酶可以在體外切斷此種交叉而拆分重組中間體。一個含4個堿基的序列提供了RuvC拆分Holliday連接體的熱點。這一序列決定了拆分過程中哪一對DNA鏈被切斷，從而決定發(fā)生的是補(bǔ)丁型重組（patchrecombination）還是剪接型重組（splicerecombination）。50第三個基因ruvC編碼一種能夠特異性地識別Holliday535153515452545255535553第二節(jié)位點特異性重組位點特異性重組是指發(fā)生在DNA特異性位點上的重組。與同源重組不同，位點專一性重組不是由DNA序列的同源性所引導(dǎo)，而是在結(jié)合序列部位由專一的酶來催化斷裂重接。位點專一性重組是由使相應(yīng)酶出現(xiàn)的調(diào)節(jié)過程所引發(fā)，而同源重組則是由能與RecA蛋白結(jié)合的DNA序列隨機(jī)斷裂引發(fā)的。

54第二節(jié)位點特異性重組位點特異性重組是指發(fā)生在DNA特異性位位點特異性重組最早是在λ噬菌體的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的。λ噬菌體DNA通過重組整合到大腸桿菌染色體的專一性位點上，轉(zhuǎn)變成為原噬菌體DNA的非活性狀態(tài)。λ噬菌體有兩種存在型式：裂解狀態(tài)和溶源狀態(tài)。兩種類型間的轉(zhuǎn)換是通過位點特異性重組實現(xiàn)的。55位點特異性重組最早是在λ噬菌體的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的。55根據(jù)重組所涉及的體系和重組位點的方向，位點專一性重組可以介導(dǎo)3類反應(yīng)：分子間位點專一性重組產(chǎn)生整合或融合；重組位點的正向順序間的分子內(nèi)位點專一性重組產(chǎn)生剪切和解離；重組位點的反向順序間的分子間位點專一性重組產(chǎn)生倒位。56根據(jù)重組所涉及的體系和重組位點的方向，位點專一性重組可以介導(dǎo)位點特異性重組的功能：調(diào)節(jié)噬菌體DNA與宿主菌染色體DNA的整合；調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)；調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育期間程序性的DNA重排。57位點特異性重組的功能：調(diào)節(jié)噬菌體DNA與宿主菌染色體DNA的λ噬菌體DNA的整合與切除為了進(jìn)入溶源狀態(tài)，游離的DNA必須整合（intergrate）到細(xì)菌DNA中去；而為了從溶原狀態(tài)向裂解狀態(tài)轉(zhuǎn)化，原噬菌體DNA則必須從細(xì)菌染色體DNA上切除（excise）。整合和切除均通過細(xì)菌DNA和λDNA上特定位點—附著點（attachmentsite，att）之間的重組而實現(xiàn)。58λ噬菌體DNA的整合與切除58細(xì)菌染色體上的附著點（attλ）稱為attB

，含有B、O、和B’三個序列（BOB’）。突變后可以阻止λDNA的整合。λ噬菌體的附著位點稱attP，由P、O和P’三個序列組成。其中O

序列是attB和attP

所共有的，序列完全一致，稱核心序列（coresequence），是位點特異性重組發(fā)生的地方。59細(xì)菌染色體上的附著點（attλ）稱為attB，含有B、O、62606260整合反應(yīng)由λ噬菌體int基因的產(chǎn)物整合酶（integrase,Int）催化。Int是一種DNA結(jié)合蛋白，對POP’序列有強(qiáng)的親和力。整合反應(yīng)還需要一種有大腸桿菌編碼的一種細(xì)菌蛋白，稱為整合宿主因子IHF(integrationhostfactor,IHF)。Int和IHF可以在體外進(jìn)行位點特異性重組。61整合反應(yīng)由λ噬菌體int基因的產(chǎn)物整合酶（integrase64626462切除反應(yīng)發(fā)生在原噬菌體兩端的attL和attR之間，產(chǎn)物為λ噬菌體環(huán)狀DNA和細(xì)菌染色體DNA。催化切除反應(yīng)的除了Int和IHF外，還需要一種叫做切除酶（exicisionase,Xis）的蛋白參加，該酶由λ噬菌體的cis基因編碼。Xis對控制反應(yīng)方向起重要作用，它是切除反應(yīng)所需要的，但卻抑制整合反應(yīng)。63切除反應(yīng)發(fā)生在原噬菌體兩端的attL和attR之間，產(chǎn)物為λ整合和切除反應(yīng)所需要識別的序列對不相同。整合要求對attB和attP之間進(jìn)行識別，但切除要求對attL和attR識別。因此位點特異性重組的方向性特征由重組位點的特征所控制。整合和切除反應(yīng)皆需Int和IHF蛋白。64整合和切除反應(yīng)所需要識別的序列對不相同。整合要求對attBλ噬菌體DNA的整合機(jī)制

λDNA的整合涉及到attB和attP的核心序列DNA鏈的割裂和重接。首先在attB和attP位點上產(chǎn)生同樣的交錯切口，形成了5’-OH和3’-P的末端。5’單鏈區(qū)全長7個堿基。兩個核心區(qū)的斷裂完全相同，連接過程不需要任何新DNA的合成。在整合反應(yīng)中，互補(bǔ)的單鏈末端交互雜和，連接并完成整合過程。65λ噬菌體DNA的整合機(jī)制656866686669676967整個反應(yīng)中沒有可以自由旋轉(zhuǎn)的中間體。斷裂和重新結(jié)合反應(yīng)與拓?fù)洚悩?gòu)酶I催化的反應(yīng)機(jī)制相類似，不同的是相互連接的兩條鏈不是來自于同一雙螺旋，而是來自于不同的雙螺旋。68整個反應(yīng)中沒有可以自由旋轉(zhuǎn)的中間體。68第三節(jié)異常重組異常重組（illegitimaterecombination）是指發(fā)生在彼此同源性很小或沒有同源性的DNA序列之間的重組。異常重組可發(fā)生在DNA很多不同的位點之上。異常重組可能是最原始的重組類型，不需要對特異性序列進(jìn)行識別的復(fù)雜系統(tǒng)或?qū)NA同源序列進(jìn)行識別的機(jī)制。69第三節(jié)異常重組異常重組（illegitimatereco異常重組按其機(jī)制主要分為兩類：末端連接（end-joining）和鏈滑動（strand-slippage）。末端連接是指斷裂的DNA末端彼此相連。鏈滑動是指DNA復(fù)制時，由一個模板跳躍到另一個模板所引起的重組。70異常重組按其機(jī)制主要分為兩類：末端連接（end-joinin許多DNA序列都可發(fā)生上述兩類的異常重組，這直接威脅著基因組的完整性，但同時也是進(jìn)化的重要途徑。異常重組能夠產(chǎn)生許多不同的結(jié)果，例如移碼、缺失、倒位、融合和DNA擴(kuò)增。71許多DNA序列都可發(fā)生上述兩類的異常重組，這直接威脅著基因組1.末端連接末端連接在40年代首次被BarbaraMcClintock發(fā)現(xiàn)。斷裂末端可以通過斷端直接對接相連。然而，如果斷端不能直接相連（如兩末端的極性相同時），它們可以通過堿基配對，然后末端合成修復(fù)。斷裂連接后產(chǎn)生新的連接體。該過程和末端DNA的序列無關(guān)，也不要求兩端之間有任何同源性。721.末端連接末端連接在40年代首次被BarbaraMcC2.鏈滑動1966年，GeorgeStreisinger提出，通過新合成的DNA鏈與其模板的錯配可導(dǎo)致移碼突變。同樣機(jī)制在較大的范圍內(nèi)發(fā)生時，可以產(chǎn)生DNA的缺失和擴(kuò)增。某些正向重復(fù)序列似乎是鏈滑動發(fā)生的熱點。732.鏈滑動1966年，GeorgeStreisinger第四節(jié)轉(zhuǎn)座重組基因組是相對穩(wěn)定的，基因組中的序列通常處于恒定的位置。因此，我們可以通過構(gòu)建遺傳圖譜(geneticmap)來鑒定已知基因的基因座。在分子水平上，每個個體基因組之間的差異主要由重組引起，但轉(zhuǎn)座元件（transposableelement）或轉(zhuǎn)座子（transposons）的存在也可以造成基因組的改變。74第四節(jié)轉(zhuǎn)座重組基因組是相對穩(wěn)定的，基因組中的序列通常處于7575轉(zhuǎn)座子的概念及發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子(transposon或transposableelement)是基因組內(nèi)相對獨立的、可移動序列，它們不必借用噬菌體或質(zhì)粒的形式就可以從基因組的一個部位直接轉(zhuǎn)移到另一個部位，這個過程稱為轉(zhuǎn)座（transposition）。轉(zhuǎn)座子每次移動時攜帶著轉(zhuǎn)座必需的基因一起在基因組內(nèi)躍遷，所以轉(zhuǎn)座子又稱跳躍基因（jumpinggene）。76轉(zhuǎn)座子的概念及發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子(transposon或tra轉(zhuǎn)座子是基因組的正常組成成分，不以獨立的形式存在（如噬菌體或質(zhì)粒DNA）。轉(zhuǎn)座的發(fā)生不依賴于轉(zhuǎn)座子和靶位點之間任何的序列同源性，在基因組內(nèi)由一個部位直接轉(zhuǎn)移到另一個部位。轉(zhuǎn)座以很低的頻率發(fā)生，而且轉(zhuǎn)座子的插入是隨機(jī)的.77轉(zhuǎn)座子是基因組的正常組成成分，不以獨立的形式存在（如噬菌體或轉(zhuǎn)座子有時插入到一個結(jié)構(gòu)基因或基因調(diào)節(jié)序列內(nèi)，引起基因表達(dá)的改變。轉(zhuǎn)座子也可以引起基因組序列的重排，它們的移動也和進(jìn)化有關(guān)。7878轉(zhuǎn)座元件首先是由BarbaraMcClintock于40年代在玉米的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的，她稱之為控制元件（controllingelement），因為它不僅能夠在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)移，而且還能夠改變基因的活性并引起功能的改變。現(xiàn)在認(rèn)為轉(zhuǎn)座子存在于地球上所有的生物。79轉(zhuǎn)座元件首先是由BarbaraMcClintock于40年8080轉(zhuǎn)座子的分類轉(zhuǎn)座子分為兩個基本類型：一種是以編碼蛋白質(zhì)的DNA序列的形式存在，其編碼的蛋白能直接操作DNA，從而使轉(zhuǎn)座子能夠在基因組內(nèi)繁殖其自身。另一種與反轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)，并且它們可移動的特性來自于它們能由RNA轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生DNA拷貝，這種DNA拷貝然后被整合到基因組的新位點。81轉(zhuǎn)座子的分類轉(zhuǎn)座子分為兩個基本類型：81轉(zhuǎn)座子的作用轉(zhuǎn)座元件可直接或間接地促進(jìn)基因組的重排。轉(zhuǎn)座子的間歇的活動性似乎為自然選擇提供了一個不確定的靶部位。82轉(zhuǎn)座子的作用轉(zhuǎn)座元件可直接或間接地促進(jìn)基因組的重排。82轉(zhuǎn)座子是位于基因組內(nèi)的一個獨立的實體。轉(zhuǎn)座子與基因組的這種關(guān)系相當(dāng)于寄生蟲與宿主的關(guān)系。轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增可能通過產(chǎn)生有害的結(jié)果而得到平衡。在原核和真核細(xì)胞內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了通過DNA移動的轉(zhuǎn)座子的存在。83轉(zhuǎn)座子是位于基因組內(nèi)的一個獨立的實體。轉(zhuǎn)座子與基因組的這種關(guān)原核生物轉(zhuǎn)座子的類型：1.插入序列(insertionalsequence,IS)2.復(fù)合轉(zhuǎn)座子(compositetransposon)3.TnA家族84原核生物轉(zhuǎn)座子的類型：1.插入序列(insertional1.插入序列最簡單的轉(zhuǎn)座子被稱為插入序列IS（insertionsequences,IS）。IS元件是細(xì)菌染色體和質(zhì)粒的正常組成部分。最早被鑒定的轉(zhuǎn)座元件是細(xì)菌操縱子中的自主插入序列。這種插入阻止了插入部位基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。851.插入序列最簡單的轉(zhuǎn)座子被稱為插入序列IS（insertIS元件是獨立的結(jié)構(gòu)單位，每個元件只編碼為自身轉(zhuǎn)座所需要的蛋白質(zhì)。IS元件的末端為短的反向末端重復(fù)序列（invertedterminalrepeats），通常這兩個拷貝密切相關(guān)，但并不完全一樣。86IS元件是獨立的結(jié)構(gòu)單位，每個元件只編碼為自身轉(zhuǎn)座所需要的蛋在插入部位，ISDNA總是和很短的正向重復(fù)序列（directrepeats）相連。但在插入之前靶部位只有這兩個重復(fù)序列中的一個。轉(zhuǎn)座后在轉(zhuǎn)座子的兩側(cè)各存在一個此序列的拷貝。轉(zhuǎn)座的結(jié)果是靶部位序列形成了兩個正向重復(fù)序列。87在插入部位，ISDNA總是和很短的正向重復(fù)序列（direc90889088ITRTSD89ITRTSD89IS元件具有一個典型的結(jié)構(gòu)，它的末端為反向重復(fù)序列，而與其相連的宿主DNA的末端為短的正向重復(fù)序列。當(dāng)在一段DNA序列中見到這種結(jié)構(gòu)類型時，可被用來鑒別轉(zhuǎn)座子。90IS元件具有一個典型的結(jié)構(gòu)，它的末端為反向重復(fù)序列，而與其相反向重復(fù)序列標(biāo)明了轉(zhuǎn)座子的末端。所有類型轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座皆需轉(zhuǎn)座酶（transposase）對末端的識別。阻止轉(zhuǎn)座的“順式作用”（cis-acting）突變位于末端。91反向重復(fù)序列標(biāo)明了轉(zhuǎn)座子的末端。所有類型轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座皆需轉(zhuǎn)座除IS1之外，所有的IS元件皆含有一個單一的長編碼區(qū)，其起始于一端的反向重復(fù)序列之內(nèi)，而剛好終止于另一端的反向重復(fù)序列之前或之內(nèi)，它編碼轉(zhuǎn)座酶。92除IS1之外，所有的IS元件皆含有一個單一的長編碼區(qū)，其起始2.復(fù)合型轉(zhuǎn)座子一些轉(zhuǎn)座子除了具有與轉(zhuǎn)座有關(guān)的功能外，還攜帶藥物抗性（或其他）標(biāo)志，這些轉(zhuǎn)座子被命名為Tn。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子（compositetransposons）的中心區(qū)攜帶藥物抗性標(biāo)志，兩側(cè)為由IS元件組成的臂。932.復(fù)合型轉(zhuǎn)座子一些轉(zhuǎn)座子除了具有與轉(zhuǎn)座有關(guān)的功能外，還攜9694969497959795因為臂由IS組成，每個IS具有通常的反向重復(fù)末端結(jié)構(gòu)，因此復(fù)合型轉(zhuǎn)座子具有同樣的短的反向重復(fù)末端。一個功能性的IS結(jié)構(gòu)單位能轉(zhuǎn)座它本身或整個轉(zhuǎn)座子。96因為臂由IS組成，每個IS具有通常的反向重復(fù)末端結(jié)構(gòu)，因此對于復(fù)合型轉(zhuǎn)座子來說，隨著中央序列的增長，轉(zhuǎn)座的頻率降低。所以長度的依賴性是決定普通復(fù)合型轉(zhuǎn)座子大小的一個因素。支持復(fù)合型轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的一個主要的動力是對中心區(qū)所攜帶的標(biāo)志的選擇。97對于復(fù)合型轉(zhuǎn)座子來說，隨著中央序列的增長，轉(zhuǎn)座的頻率降低。所轉(zhuǎn)座發(fā)生的機(jī)制轉(zhuǎn)座子插入到一個新的部位的通常步驟是：在靶DNA上制造一個交錯的切口，然后轉(zhuǎn)座子與突出的單鏈末端相連接，并填充切口。交錯末端的產(chǎn)生和填充解釋了在插入部位產(chǎn)生靶DNA正向重復(fù)的原因。鏈的切口之間的交錯決定了正向重復(fù)的長度。98轉(zhuǎn)座發(fā)生的機(jī)制轉(zhuǎn)座子插入到一個新的部位的通常步驟是：在靶DN1019910199（1）非復(fù)制型轉(zhuǎn)座 轉(zhuǎn)座元件作為一個物理實體直接由一個部位轉(zhuǎn)移到另一個部位。100（1）非復(fù)制型轉(zhuǎn)座100非復(fù)制型轉(zhuǎn)座103101非復(fù)制型轉(zhuǎn)座103101（2）復(fù)制型轉(zhuǎn)座（replicativetransposition）作為自身移動的一個部分，轉(zhuǎn)座子被復(fù)制，一個拷貝仍然保留在原來的位置上，而另一個則插入到一個新的部位，這樣轉(zhuǎn)座過程伴隨著轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的增加。102（2）復(fù)制型轉(zhuǎn)座（replicativetransposi復(fù)制型轉(zhuǎn)座103復(fù)制型轉(zhuǎn)座103轉(zhuǎn)座子的遺傳性效應(yīng)引起插入突變；插入位置上出現(xiàn)新的基因；造成插入位置上出現(xiàn)靶DNA的少數(shù)核苷酸對的重復(fù)；轉(zhuǎn)座后原來位置上保持原有的轉(zhuǎn)座子；引起染色體的畸變；切除。104轉(zhuǎn)座子的遺傳性效應(yīng)引起插入突變；104反轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子是基因組中可移動的獨立的DNA序列，一個轉(zhuǎn)座子可由基因組的一個位置移到另一個位置。從DNA到DNA的轉(zhuǎn)移過程稱為轉(zhuǎn)座。從DNA到RNA再到DNA的過程稱為反轉(zhuǎn)座。反轉(zhuǎn)座是經(jīng)RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座過程。105反轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子是基因組中可移動的獨立的必須經(jīng)過RNA中間體的轉(zhuǎn)座過程是真核生物所特有的。一些真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄病毒的原病毒的一般組成結(jié)構(gòu)相關(guān)，并且通過RNA中間體進(jìn)行轉(zhuǎn)座，這一類結(jié)構(gòu)單位稱為反轉(zhuǎn)座子（retroposons）。106必須經(jīng)過RNA中間體的轉(zhuǎn)座過程是真核生物所特有的。106反轉(zhuǎn)座子共有的可鑒定的特性為：插入位點會產(chǎn)生短的靶序列的正向重復(fù)。反轉(zhuǎn)錄病毒首先被觀察到的是以傳染性病毒顆粒的形式存在，并能在細(xì)胞間傳播；而反轉(zhuǎn)座子是被當(dāng)作基因組中的一部分而被發(fā)現(xiàn)的，它們可以在基因組內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)座，但不能在細(xì)胞間遷移。反轉(zhuǎn)錄病毒整合入宿主DNA中的分子機(jī)制，其本質(zhì)是轉(zhuǎn)座。

107反轉(zhuǎn)座子共有的可鑒定的特性為：插入位點會產(chǎn)生短的靶序列的正向108108演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！第六章

DNA重組110第六章

DNA重組1基因組的可變性和穩(wěn)定性之間必須維持一個恰到好處的平衡，這樣才能使生物體得以生存并能世代相傳，繁衍不息。染色體的遺傳差異主要由兩種機(jī)制產(chǎn)生，一種是突變，一種是遺傳重組。111基因組的可變性和穩(wěn)定性之間必須維持一個恰到好處的平衡，這樣才突變和重組是提供進(jìn)化起始物質(zhì)的兩個過程。突變引起的遺傳改變能引起蛋白質(zhì)中氨基酸序列的變化，該變化引起表型的改變，通過自然選擇發(fā)生作用。重組提供一個基因組結(jié)構(gòu)的變化，也會引起表型的變化，也通過自然選擇發(fā)揮作用。112突變和重組是提供進(jìn)化起始物質(zhì)的兩個過程。3

DNA重組（recombination）是指發(fā)生在DNA分子內(nèi)或DNA分子之間核苷酸序列的交換、重排和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，是已有遺傳物質(zhì)的重新組合過程。113DNA重組（recombinatio遺傳重組的存在確保了遺傳物質(zhì)代與代之間基因組的重排，從而形成一個物種內(nèi)部個體之間的遺傳差異。遺傳重組不僅僅發(fā)生于代與代之間，一個個體的基因組也可以發(fā)生重排。重組不只是在減數(shù)分裂和體細(xì)胞核基因中發(fā)生，也在線粒體基因間和葉綠體基因間發(fā)生。114遺傳重組的存在確保了遺傳物質(zhì)代與代之間基因組的重排，從而形DNA重組的意義是能迅速增加群體的遺傳多樣性，通過優(yōu)化組合積累有利突變，推動生物進(jìn)化。此外，DNA重組還參與DNA損傷修復(fù)，某些基因表達(dá)的調(diào)控等重要的生物學(xué)過程。115DNA重組的意義是能迅速增加群體的遺傳多樣性，通過優(yōu)化組合積根據(jù)不同的機(jī)制，可將重組分成4類：同源性重組（homologousrecombination）位點特異性重組（site-specificrecombination）異常重組（illegitimaterecombination)轉(zhuǎn)座重組（transpositionrecombination）116根據(jù)不同的機(jī)制，可將重組分成4類：7許多重組反應(yīng)利用不止一種機(jī)制進(jìn)行，例如免疫球蛋白VDJ連接涉及到位點特異性識別和類似異常重組的過程；酵母接合型的轉(zhuǎn)換既有同源性重組和位點特異性重組的特征，也具有復(fù)制轉(zhuǎn)座過程的特征。通過同源性重組將DNA序列引入真核基因組已經(jīng)為研究高等生物開辟了一條新途徑。117許多重組反應(yīng)利用不止一種機(jī)制進(jìn)行，例如免疫球蛋白VDJ連接涉用人工操作構(gòu)建DNA重組體，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)，稱為DNA克隆或分子克?。╩olecularcloning）。118用人工操作構(gòu)建DNA重組體，將其導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)，稱為第一節(jié)同源重組同源重組（homologousrecombination）發(fā)生在兩個同源DNA片段之間，是在兩個DNA分子的同源序列之間直接進(jìn)行交換的一種重組形式。同源重組主要是利用DNA序列的同源性識別重組對象，由堿基序列提供識別的特異性。同源性重組最主要特征是相關(guān)的酶可以利用任何一對同源序列為底物。119第一節(jié)同源重組同源重組（homologousrecomb真核生物減數(shù)分裂時的染色體之間的交換，某些低等真核生物及細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合，噬菌體的整合等都屬于同源性重組這一類型。在整個基因組中，同源重組的頻率并不恒定，并且跟染色體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。例如在異染色體附近遺傳物質(zhì)的交換要受到抑制。120真核生物減數(shù)分裂時的染色體之間的交換，某些低等真核生物及細(xì)菌1.進(jìn)行同源重組的基本條件（1）在交換區(qū)具有相同或相似的序列發(fā)生同源性重組的兩個區(qū)域的核苷酸序列必須是相同或非常相似的。同源性重組常常只發(fā)生在兩個DNA分子中的相同部位。1211.進(jìn)行同源重組的基本條件（1）在交換區(qū)具有相同或相似的序（2）雙鏈DNA分子之間互補(bǔ)堿基進(jìn)行配對兩個DNA分子的鏈之間互補(bǔ)的堿基配對確保重組只發(fā)生在同樣的基因座之間。在該部位兩個雙鏈DNA分子通過鏈之間互補(bǔ)的堿基配對被維系在一起稱為聯(lián)會。122（2）雙鏈DNA分子之間互補(bǔ)堿基進(jìn)行配對13（3）重組酶參與重組反應(yīng)的酶，保證重組的順利進(jìn)行。重組過程中，每個分子的鏈?zhǔn)紫葦嗔?，然后進(jìn)行修復(fù)和連接，兩個DNA分子之間發(fā)生交換。重組完成后，重組分子的解離和釋放等過程均是在酶催化下進(jìn)行的。123（3）重組酶14（4）異源雙鏈區(qū)的形成同源性重組時，在兩個DNA分子之間互補(bǔ)堿基配對的區(qū)域稱為異源雙鏈區(qū)（heteroduplexregion）。兩個DNA分子通過一段異源DNA雙螺旋共價相互連接。124（4）異源雙鏈區(qū)的形成15125162.同源性重組的分子模型第一個被廣泛接受的重組模型是1964年由RobinHolliday提出的Holliday模型。即將發(fā)生重組的兩個DNA分子同一個部位的兩個單鏈的斷裂，從而引發(fā)重組。兩個斷裂單鏈的游離端彼此交換，形成兩個異源雙鏈，然后末端連接形成Holliday連接體（HollidayJunction）。（1）Holliday模型1262.同源性重組的分子模型第一個被廣泛接受的重組模型是196201272018一旦Holliday連接體形成后，它能進(jìn)行重排從而改變鏈的彼此關(guān)系。這種重排稱為異構(gòu)化，因為在此過程中沒有鍵的割裂。一旦形成Holliday連接體后，就能被拆分。是否發(fā)生重組依賴于拆分時Holliday連接體的構(gòu)象。128一旦Holliday連接體形成后，它能進(jìn)行重排從而改變鏈的彼221292220231302321241312422251322523Holliday模型被稱為雙鏈侵入模型，因為由于每一個DNA分子的一條鏈侵入到另一個DNA分子，它解釋了在重組時兩個DNA分子的異源雙鏈?zhǔn)侨绾涡纬傻?。Holliday連接體也能通過堿基之間氫鍵的斷裂和再連接而發(fā)生左右移動。這個過程稱為支鏈遷移（branchmigration)。133Holliday模型被稱為雙鏈侵入模型，因為由于每一個DNA271342725Holliday認(rèn)為在DNA分子上存在某些位點，特殊的引發(fā)重組的酶能夠識別這些位點，確保兩條鏈在相同的部位被切斷。目前還沒有足夠的證據(jù)證明這些位點的存在。135Holliday認(rèn)為在DNA分子上存在某些位點，特殊的引發(fā)重（2）單鏈侵入模型單鏈侵入模型是對Holliday模型的修改。在該模型中，兩個DNA分子中的一個單鏈在隨機(jī)部位被切斷，然后暴露的末端侵入到另一個雙鏈DNA分子，發(fā)現(xiàn)它的互補(bǔ)序列以后將替代與它相同的鏈。然后DNA聚合酶將用留下的那條鏈作為模板，填充上侵入鏈所留下的缺口。被替代的鏈被降解，它的殘留末端與另一分子中新合成的DNA鏈相連接形成Holliday連接體。136（2）單鏈侵入模型27301373028Holliday連接體形成以后，就會產(chǎn)生異構(gòu)化然后拆分。單鏈侵入模型中，異源雙鏈?zhǔn)紫戎辉趦蓚€DNA分子中的一個形成。Holliday中間體形成以后通過支鏈遷移能夠在另一個DNA分子上產(chǎn)生異源雙鏈，這樣就解釋了異源雙鏈?zhǔn)侨绾涡纬傻摹?38Holliday連接體形成以后，就會產(chǎn)生異構(gòu)化然后拆分。29⑦⑤139⑦⑤30（3）雙鏈斷裂修復(fù)模型目前證明通過兩個DNA分子之中的一個雙鏈斷裂引發(fā)重組是個常見的機(jī)制。該模型認(rèn)為參與重組的兩個DNA分子之一的兩條鏈被核酸內(nèi)切酶切斷，然后在核酸外切酶作用下產(chǎn)生3’單鏈黏性末端。兩個3’游離末端之一侵入到另一個雙螺旋的同源區(qū)，置換“供體”雙螺旋的一個單鏈而形成一段異源雙鏈DNA，并同時產(chǎn)生一個D環(huán)（D-loop）。140（3）雙鏈斷裂修復(fù)模型31341413432351423533D環(huán)在DNA聚合酶的作用下修補(bǔ)而擴(kuò)展，直至D環(huán)的長度與“受體”DNA雙螺旋缺口長度相當(dāng)，互補(bǔ)的兩條單鏈退火。此時在缺口的兩側(cè)各有一段異源雙鏈DNA，兩個雜合雙螺旋之間為斷裂的缺口，并且此缺口為供體DNA序列所填充。缺口處雙鏈的完整性可以被以缺口3’端為起始的修補(bǔ)合成來修復(fù)。缺口是被兩次單鏈DNA的合成而修復(fù)的。143D環(huán)在DNA聚合酶的作用下修補(bǔ)而擴(kuò)展，直至D環(huán)的長度與“受體371443735381453836

大腸桿菌重組的分子基礎(chǔ)在分子水平上，重組事件發(fā)生的先后順序是相似的：從一個已斷裂的分子中產(chǎn)生的單鏈與其對應(yīng)的雙螺旋發(fā)生作用，配對區(qū)間擴(kuò)展，重組中間體形成直到核酸內(nèi)切酶解離此兩個雙螺旋分子。識別反應(yīng)是重組機(jī)制的不可分割的重要部分，并且只涉及到DNA分子的特定區(qū)域而不是整個完整的染色體。146大腸桿菌重組的分子基礎(chǔ)在分子水平上，重組事件發(fā)生的先后順序1.

chi位點和RecBCD核酸酶在λ噬菌體的一些突變種內(nèi)，存在一些稱為chi的位點。chi位點單一的堿基對的改變即可激發(fā)重組的發(fā)生。這些位點皆含有一個恒定的非對稱的8bp序列：

5’GCTGGTGC3’3’CGACCACC5’1471.chi位點和RecBCD核酸酶在λ噬菌體的一些突變種內(nèi)Chi位點是一個由基因recBCD編碼的RecBCD酶作用的靶部位。RecBCD酶是一種多功能酶，具有幾種不同的活性。它是一個強(qiáng)有力的降解DNA的核酸酶，早期被檢定為活性核酸外切酶V，具有解旋酶的活性。RecBCD所介導(dǎo)的解旋和切割可以被用來產(chǎn)生末端，并引發(fā)異源雙鏈的形成。148Chi位點是一個由基因recBCD編碼的RecBCD酶作用4214942404315043414415144422.RecA和Holliday連接體的形成RecA具有兩種相當(dāng)不同的活性:RecA可以促進(jìn)單鏈DNA與其在雙鏈DNA分子中互補(bǔ)的DNA鏈的堿基相配對。RecA還可以在SOS反應(yīng)中激活蛋白酶。RecA需要單鏈DNA和ATP才能激活蛋白酶。1522.RecA和Holliday連接體的形成RecA具有兩種RecA能夠利用由RecBCD在Chi位點附近切割所釋放的單鏈3’末端。RecA的DNA操作酶活性可以使一個單鏈DNA與雙螺.旋中的同源序列發(fā)生置換，這一反應(yīng)被稱為單鏈攝取(single-stranduptake)或單鏈同化(single-strandassimilation)。153RecA能夠利用由RecBCD在Chi位點附近切割所釋放的單1544515546156473.Ruv蛋白和Holliday連接體的拆分大腸桿菌有一組由三個基因編碼與隨后的重組相關(guān)聯(lián)的蛋白。ruvA和ruvB

基因的產(chǎn)物促進(jìn)異源雙鏈的形成。RuvA蛋白可以識別Holliday連接體的結(jié)構(gòu)，RuvB是一個腺苷三磷酸酶并可能提供支鏈遷移的動力。1573.Ruv蛋白和Holliday連接體的拆分大腸桿菌有一RuvA在交叉點處與DNA所有的4條鏈相結(jié)合，在交叉點的上游，兩個RuvB六聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)分別與每個雙螺旋相結(jié)合。RuvAB蛋白復(fù)合體可以使支鏈以10～20bp的速度遷移。158RuvA在交叉點處與DNA所有的4條鏈相結(jié)合，在交叉點的上第三個基因ruvC編碼一種能夠特異性地識別Holliday連接體的核酸內(nèi)切酶，此酶可以在體外切斷此種交叉而拆分重組中間體。一個含4個堿基的序列提供了RuvC拆分Holliday連接體的熱點。這一序列決定了拆分過程中哪一對DNA鏈被切斷，從而決定發(fā)生的是補(bǔ)丁型重組（patchrecombination）還是剪接型重組（splicerecombination）。159第三個基因ruvC編碼一種能夠特異性地識別Holliday531605351541615452551625553第二節(jié)位點特異性重組位點特異性重組是指發(fā)生在DNA特異性位點上的重組。與同源重組不同，位點專一性重組不是由DNA序列的同源性所引導(dǎo)，而是在結(jié)合序列部位由專一的酶來催化斷裂重接。位點專一性重組是由使相應(yīng)酶出現(xiàn)的調(diào)節(jié)過程所引發(fā)，而同源重組則是由能與RecA蛋白結(jié)合的DNA序列隨機(jī)斷裂引發(fā)的。

163第二節(jié)位點特異性重組位點特異性重組是指發(fā)生在DNA特異性位位點特異性重組最早是在λ噬菌體的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的。λ噬菌體DNA通過重組整合到大腸桿菌染色體的專一性位點上，轉(zhuǎn)變成為原噬菌體DNA的非活性狀態(tài)。λ噬菌體有兩種存在型式：裂解狀態(tài)和溶源狀態(tài)。兩種類型間的轉(zhuǎn)換是通過位點特異性重組實現(xiàn)的。164位點特異性重組最早是在λ噬菌體的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的。55根據(jù)重組所涉及的體系和重組位點的方向，位點專一性重組可以介導(dǎo)3類反應(yīng)：分子間位點專一性重組產(chǎn)生整合或融合；重組位點的正向順序間的分子內(nèi)位點專一性重組產(chǎn)生剪切和解離；重組位點的反向順序間的分子間位點專一性重組產(chǎn)生倒位。165根據(jù)重組所涉及的體系和重組位點的方向，位點專一性重組可以介導(dǎo)位點特異性重組的功能：調(diào)節(jié)噬菌體DNA與宿主菌染色體DNA的整合；調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)；調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育期間程序性的DNA重排。166位點特異性重組的功能：調(diào)節(jié)噬菌體DNA與宿主菌染色體DNA的λ噬菌體DNA的整合與切除為了進(jìn)入溶源狀態(tài)，游離的DNA必須整合（intergrate）到細(xì)菌DNA中去；而為了從溶原狀態(tài)向裂解狀態(tài)轉(zhuǎn)化，原噬菌體DNA則必須從細(xì)菌染色體DNA上切除（excise）。整合和切除均通過細(xì)菌DNA和λDNA上特定位點—附著點（attachmentsite，att）之間的重組而實現(xiàn)。167λ噬菌體DNA的整合與切除58細(xì)菌染色體上的附著點（attλ）稱為attB

，含有B、O、和B’三個序列（BOB’）。突變后可以阻止λDNA的整合。λ噬菌體的附著位點稱attP，由P、O和P’三個序列組成。其中O

序列是attB和attP

所共有的，序列完全一致，稱核心序列（coresequence），是位點特異性重組發(fā)生的地方。168細(xì)菌染色體上的附著點（attλ）稱為attB，含有B、O、621696260整合反應(yīng)由λ噬菌體int基因的產(chǎn)物整合酶（integrase,Int）催化。Int是一種DNA結(jié)合蛋白，對POP’序列有強(qiáng)的親和力。整合反應(yīng)還需要一種有大腸桿菌編碼的一種細(xì)菌蛋白，稱為整合宿主因子IHF(integrationhostfactor,IHF)。Int和IHF可以在體外進(jìn)行位點特異性重組。170整合反應(yīng)由λ噬菌體int基因的產(chǎn)物整合酶（integrase641716462切除反應(yīng)發(fā)生在原噬菌體兩端的attL和attR之間，產(chǎn)物為λ噬菌體環(huán)狀DNA和細(xì)菌染色體DNA。催化切除反應(yīng)的除了Int和IHF外，還需要一種叫做切除酶（exicisionase,Xis）的蛋白參加，該酶由λ噬菌體的cis基因編碼。Xis對控制反應(yīng)方向起重要作用，它是切除反應(yīng)所需要的，但卻抑制整合反應(yīng)。172切除反應(yīng)發(fā)生在原噬菌體兩端的attL和attR之間，產(chǎn)物為λ整合和切除反應(yīng)所需要識別的序列對不相同。整合要求對attB和attP之間進(jìn)行識別，但切除要求對attL和attR識別。因此位點特異性重組的方向性特征由重組位點的特征所控制。整合和切除反應(yīng)皆需Int和IHF蛋白。173整合和切除反應(yīng)所需要識別的序列對不相同。整合要求對attBλ噬菌體DNA的整合機(jī)制

λDNA的整合涉及到attB和attP的核心序列DNA鏈的割裂和重接。首先在attB和attP位點上產(chǎn)生同樣的交錯切口，形成了5’-OH和3’-P的末端。5’單鏈區(qū)全長7個堿基。兩個核心區(qū)的斷裂完全相同，連接過程不需要任何新DNA的合成。在整合反應(yīng)中，互補(bǔ)的單鏈末端交互雜和，連接并完成整合過程。174λ噬菌體DNA的整合機(jī)制65681756866691766967整個反應(yīng)中沒有可以自由旋轉(zhuǎn)的中間體。斷裂和重新結(jié)合反應(yīng)與拓?fù)洚悩?gòu)酶I催化的反應(yīng)機(jī)制相類似，不同的是相互連接的兩條鏈不是來自于同一雙螺旋，而是來自于不同的雙螺旋。177整個反應(yīng)中沒有可以自由旋轉(zhuǎn)的中間體。68第三節(jié)異常重組異常重組（illegitimaterecombination）是指發(fā)生在彼此同源性很小或沒有同源性的DNA序列之間的重組。異常重組可發(fā)生在DNA很多不同的位點之上。異常重組可能是最原始的重組類型，不需要對特異性序列進(jìn)行識別的復(fù)雜系統(tǒng)或?qū)NA同源序列進(jìn)行識別的機(jī)制。178第三節(jié)異常重組異常重組（illegitimatereco異常重組按其機(jī)制主要分為兩類：末端連接（end-joining）和鏈滑動（strand-slippage）。末端連接是指斷裂的DNA末端彼此相連。鏈滑動是指DNA復(fù)制時，由一個模板跳躍到另一個模板所引起的重組。179異常重組按其機(jī)制主要分為兩類：末端連接（end-joinin許多DNA序列都可發(fā)生上述兩類的異常重組，這直接威脅著基因組的完整性，但同時也是進(jìn)化的重要途徑。異常重組能夠產(chǎn)生許多不同的結(jié)果，例如移碼、缺失、倒位、融合和DNA擴(kuò)增。180許多DNA序列都可發(fā)生上述兩類的異常重組，這直接威脅著基因組1.末端連接末端連接在40年代首次被BarbaraMcClintock發(fā)現(xiàn)。斷裂末端可以通過斷端直接對接相連。然而，如果斷端不能直接相連（如兩末端的極性相同時），它們可以通過堿基配對，然后末端合成修復(fù)。斷裂連接后產(chǎn)生新的連接體。該過程和末端DNA的序列無關(guān)，也不要求兩端之間有任何同源性。1811.末端連接末端連接在40年代首次被BarbaraMcC2.鏈滑動1966年，GeorgeStreisinger提出，通過新合成的DNA鏈與其模板的錯配可導(dǎo)致移碼突變。同樣機(jī)制在較大的范圍內(nèi)發(fā)生時，可以產(chǎn)生DNA的缺失和擴(kuò)增。某些正向重復(fù)序列似乎是鏈滑動發(fā)生的熱點。1822.鏈滑動1966年，GeorgeStreisinger第四節(jié)轉(zhuǎn)座重組基因組是相對穩(wěn)定的，基因組中的序列通常處于恒定的位置。因此，我們可以通過構(gòu)建遺傳圖譜(geneticmap)來鑒定已知基因的基因座。在分子水平上，每個個體基因組之間的差異主要由重組引起，但轉(zhuǎn)座元件（transposableelement）或轉(zhuǎn)座子（transposons）的存在也可以造成基因組的改變。183第四節(jié)轉(zhuǎn)座重組基因組是相對穩(wěn)定的，基因組中的序列通常處于18475轉(zhuǎn)座子的概念及發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子(transposon或transposableelement)是基因組內(nèi)相對獨立的、可移動序列，它們不必借用噬菌體或質(zhì)粒的形式就可以從基因組的一個部位直接轉(zhuǎn)移到另一個部位，這個過程稱為轉(zhuǎn)座（transposition）。轉(zhuǎn)座子每次移動時攜帶著轉(zhuǎn)座必需的基因一起在基因組內(nèi)躍遷，所以轉(zhuǎn)座子又稱跳躍基因（jumpinggene）。185轉(zhuǎn)座子的概念及發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子(transposon或tra轉(zhuǎn)座子是基因組的正常組成成分，不以獨立的形式存在（如噬菌體或質(zhì)粒DNA）。轉(zhuǎn)座的發(fā)生不依賴于轉(zhuǎn)座子和靶位點之間任何的序列同源性，在基因組內(nèi)由一個部位直接轉(zhuǎn)移到另一個部位。轉(zhuǎn)座以很低的頻率發(fā)生，而且轉(zhuǎn)座子的插入是隨機(jī)的.186轉(zhuǎn)座子是基因組的正常組成成分，不以獨立的形式存在（如噬菌體或轉(zhuǎn)座子有時插入到一個結(jié)構(gòu)基因或基因調(diào)節(jié)序列內(nèi)，引起基因表達(dá)的改變。轉(zhuǎn)座子也可以引起基因組序列的重排，它們的移動也和進(jìn)化有關(guān)。18778轉(zhuǎn)座元件首先是由BarbaraMcClintock于40年代在玉米的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的，她稱之為控制元件（controllingelement），因為它不僅能夠在基因組內(nèi)轉(zhuǎn)移，而且還能夠改變基因的活性并引起功能的改變?，F(xiàn)在認(rèn)為轉(zhuǎn)座子存在于地球上所有的生物。188轉(zhuǎn)座元件首先是由BarbaraMcClintock于40年18980轉(zhuǎn)座子的分類轉(zhuǎn)座子分為兩個基本類型：一種是以編碼蛋白質(zhì)的DNA序列的形式存在，其編碼的蛋白能直接操作DNA，從而使轉(zhuǎn)座子能夠在基因組內(nèi)繁殖其自身。另一種與反轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)，并且它們可移動的特性來自于它們能由RNA轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生DNA拷貝，這種DNA拷貝然后被整合到基因組的新位點。190轉(zhuǎn)座子的分類轉(zhuǎn)座子分為兩個基本類型：81轉(zhuǎn)座子的作用轉(zhuǎn)座元件可直接或間接地促進(jìn)基因組的重排。轉(zhuǎn)座子的間歇的活動性似乎為自然選擇提供了一個不確定的靶部位。191轉(zhuǎn)座子的作用轉(zhuǎn)座元件可直接或間接地促進(jìn)基因組的重排。82轉(zhuǎn)座子是位于基因組內(nèi)的一個獨立的實體。轉(zhuǎn)座子與基因組的這種關(guān)系相當(dāng)于寄生蟲與宿主的關(guān)系。轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增可能通過產(chǎn)生有害的結(jié)果而得到平衡。在原核和真核細(xì)胞內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了通過DNA移動的轉(zhuǎn)座子的存在。192轉(zhuǎn)座子是位于基因組內(nèi)的一個獨立的實體。轉(zhuǎn)座子與基因組的這種關(guān)原核生物轉(zhuǎn)座子的類型：1.插入序列(insertionalsequence,IS)2.復(fù)合轉(zhuǎn)座子(compositetransposon)3.TnA家族193原核生物轉(zhuǎn)座子的類型：1.插入序列(inse