體內(nèi)藥物分析概述課件

1體內(nèi)藥物分析

BiopharmaceuticalAnalysis;

BiomedicalAnalysis。1體內(nèi)藥物分析

BiopharmaceuticalAnal2乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：口服。成人常用量：支氣管感染、肺部感染：一次2片，一日2次，或一次1片，一日3次，療程7-14日。急性單純性下尿路感染：一次1片，一日2次，療程5～7日；復(fù)雜性尿路感染：一次2片，一日2次，或一次1片，一日3次，療程10～14日。細(xì)菌性前列腺炎：一次2片，一日2次，療程6周。0.3-0.4g/日0.2g/日0.4g/日2乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：0.3-0.4g/3抗菌藥物的抗菌活性藥物抑制或者殺滅病原菌的能力最低抑菌濃度（minimuminhibitoryconcentration）抑制培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌生長的最低濃度。MIC最低殺菌濃度（minimumbactericidalconcentration）殺滅培養(yǎng)基內(nèi)99.9%的微生物。MBC喹諾酮類藥物對(duì)致病菌的殺菌作用取決于藥物血藥濃度的峰濃度，即藥物濃度越高，殺菌作用越強(qiáng)?！獫舛纫蕾囆詴r(shí)間依賴性——?dú)⒕钚耘c藥物濃度維持在MIC以上時(shí)間的長短有關(guān)。β-內(nèi)酰胺類、林可霉素類等抗生素。3抗菌藥物的抗菌活性藥物抑制或者殺滅病原菌的能力4乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：口服。成人常用量：支氣管感染、肺部感染：

藥物隨著血液到各個(gè)組織急性單純性下尿路感染：

藥物通過尿液排泄在下尿路發(fā)揮治療作用細(xì)菌性前列腺炎：

藥物隨著血液到前列腺組織0.3-0.4g/日0.2g/日0.4g/日測(cè)定血液、尿液甚至組織中的藥物濃度4乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：0.3-0.4g/51.1體內(nèi)藥物分析的定義體內(nèi)樣品（生物體液、器官或組織）中藥物及其代謝產(chǎn)物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的定性、定量分析。體內(nèi)樣品——確定分析對(duì)象藥物、代謝產(chǎn)物、內(nèi)源性生物活性物質(zhì)——確定待分析物定性、定量分析——如何選擇分析手段、建立方法并驗(yàn)證1.概述51.1體內(nèi)藥物分析的定義體內(nèi)樣品（生物體液、器官或組織）中6體內(nèi)·藥物·分析原料藥純度高

干擾少容量分析為主制劑主藥一或多

輔料干擾多儀器分析為主體內(nèi)藥物成分復(fù)雜

干擾眾多

濃度很低高靈敏度

高選擇性的方法6體內(nèi)·藥物·分析原料藥制劑體內(nèi)藥物成分復(fù)雜

干擾眾多

濃度71.2體內(nèi)藥物分析對(duì)象和待測(cè)物特點(diǎn)★成分復(fù)雜、干擾眾多生物基質(zhì)的干擾——蛋白質(zhì)、糖、脂肪、離子……其他藥物的干擾——卡馬西平治療癲癇的有效血藥濃度為3~8μg/ml，潛在中毒濃度為12μg/ml。病人可能之前用過其他抗癲癇藥物如丙戊酸鈉、乙琥胺等。代謝產(chǎn)物與原型藥物互相干擾——抗抑郁藥米氮平DMR8-OHMN-O-MRT方法選擇性要高71.2體內(nèi)藥物分析對(duì)象和待測(cè)物特點(diǎn)★成分復(fù)雜、干擾眾多DM8體內(nèi)藥物分析對(duì)象和待測(cè)物特點(diǎn)★采樣量小，濃度很低常見的生物樣品采樣量少，特定條件采集，不易重新獲得

血漿：人1~3ml；犬1~5ml；大鼠0.3~0.5ml濃度為ng/ml~μg/ml數(shù)量級(jí)血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液、膽汁、乳汁、腦脊液等均勻生物樣品心、肝、脾、肺、腎、腦等非均勻生物樣品方法靈敏度要高8體內(nèi)藥物分析對(duì)象和待測(cè)物特點(diǎn)★采樣量小，濃度很低血液（血漿91.3體內(nèi)藥物分析方法的特點(diǎn)★對(duì)分析方法的要求高：滿足靈敏度及專屬性的要求樣品需要經(jīng)過前處理，才能分析分析工作量大，方法驗(yàn)證要求嚴(yán)格，測(cè)試數(shù)據(jù)處理和結(jié)果闡明較為復(fù)雜1.概述91.3體內(nèi)藥物分析方法的特點(diǎn)★對(duì)分析方法的要求高：滿足靈101.4體內(nèi)藥物分析的任務(wù)定性分析——藥物代謝產(chǎn)物、內(nèi)源性物質(zhì)是什么定量分析——血漿、組織、尿液藥物及代謝物濃度藥物代謝與動(dòng)力學(xué)（drugmetabolismandpharmacokinetics，DMPK）研究——新藥研發(fā)治療藥物監(jiān)測(cè)（TherapeuticDrugMonitoring，TDM）——臨床應(yīng)用內(nèi)源性物質(zhì)檢測(cè)——疾病標(biāo)志物社會(huì)事件中的分析——食品安全、法醫(yī)毒物分析等1.概述101.4體內(nèi)藥物分析的任務(wù)定性分析——藥物代謝產(chǎn)物、內(nèi)源性11體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：DMPK藥代動(dòng)力學(xué)研究涉及藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄等動(dòng)態(tài)過程，需要研究血藥/組織濃度－時(shí)間曲線的變化，探討藥物分布與藥理作用的關(guān)系。1,2–Stability+Solubility3–Passive+ActiveTrans.4–Pgpefflux+CYP3A45-Hepaticfirstpasseffect11體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：DMPK藥代動(dòng)力學(xué)研究涉及藥物在體內(nèi)12藥物代謝與動(dòng)力學(xué)血藥濃度-時(shí)間曲線尿藥累積排泄曲線生物等效性評(píng)價(jià)絕對(duì)生物利用度相對(duì)生物利用度代謝途徑代謝酶……12藥物代謝與動(dòng)力學(xué)血藥濃度-時(shí)間曲線13體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：TDMTDM即測(cè)定血液中或其它體液中藥物濃度，觀察臨床藥物反應(yīng)，考察藥物治療效果，必要時(shí)根據(jù)藥動(dòng)學(xué)原理調(diào)整給藥方案。方向是實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥，目的為臨床合理用藥服務(wù)，達(dá)到最佳的藥物治療效果。治療范圍中毒范圍無效范圍C最大耐受濃度最小有效濃度13體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：TDMTDM即測(cè)定血液中或其它體液中14治療藥物監(jiān)測(cè)血藥濃度μg/ml10~2020~3030~40>40藥理及

毒性反應(yīng)有效血藥濃度眼球震顫運(yùn)動(dòng)失調(diào)精神異?？拱d癇藥苯妥英鈉血藥濃度與藥理作用及毒性反應(yīng)患者女性，25歲，因癲癇強(qiáng)直陣攣性發(fā)作入院，遂靜脈注射負(fù)荷劑量苯妥英鈉800mg并開始口服維持劑量250mg/d。測(cè)得苯妥英鈉的濃度為3.6μg/ml，醫(yī)生考慮到尚未達(dá)到治療濃度范圍，故增加劑量到400mg/d?；颊叱霈F(xiàn)痙攣等類似癲癇發(fā)作癥狀。測(cè)得血藥濃度為10.9μg/ml，醫(yī)生擬打算再次增加劑量。患者白蛋白為20g/L(正常范圍是34~48g/L)，于是建議檢查患者游離苯妥英鈉濃度。結(jié)果顯示游離苯妥英鈉濃度為4.9μg/ml（游離藥物治療濃度范圍1~2μg/ml），判定患者苯妥英鈉中毒，建議降低劑量為250mg/d。14治療藥物監(jiān)測(cè)血藥濃度μg/ml10~2020~3030~15體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：內(nèi)源性物質(zhì)檢測(cè)體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)如氨基酸、激素、兒茶酚胺、肌酐、草酸、尿酸等。機(jī)體正常生理?xiàng)l件或機(jī)體發(fā)生病變：測(cè)定體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)或疾病標(biāo)志物的含量，疾病的輔助診斷或及早預(yù)防。藥物（中藥）代謝組學(xué)研究15體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：內(nèi)源性物質(zhì)檢測(cè)體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)如氨基酸16體內(nèi)藥物分析的中心任務(wù)體內(nèi)藥物分析方法學(xué)研究生物樣品預(yù)處理方法分離分析實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化選擇考察體內(nèi)分析方法的靈敏度、專屬性、準(zhǔn)確度、線性范圍等為臨床藥理學(xué)、臨床藥學(xué)等相關(guān)學(xué)科提供專一、靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的體內(nèi)藥物分析方法。16體內(nèi)藥物分析的中心任務(wù)體內(nèi)藥物分析方法學(xué)研究172.1體內(nèi)樣品的種類與采集血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液、膽汁、乳汁、腦脊液等均勻生物樣品心、肝、脾、肺、腎、腦等非均勻生物樣品樣品選取原則（1）必須是能夠反映出濃度與藥物效應(yīng)之間關(guān)系；（2）易于獲得；（3）便于處理，適合于分析；（4）根據(jù)不同目的與要求進(jìn)行選取。2.體內(nèi)樣品的種類、采集與貯存172.1體內(nèi)樣品的種類與采集血液（血漿、血清、全血）、尿液18體內(nèi)樣品種類與采集血液自然凝結(jié)加抗凝劑離心離心全血上層：血清serum（比血漿少纖維蛋白原）（40%）下層：血細(xì)胞（凝塊）上層：血漿

plasma（50%）下層：血細(xì)胞血樣Blood一般在給藥后的不同時(shí)間點(diǎn)采集血樣18體內(nèi)樣品種類與采集血液自然凝結(jié)加抗凝劑離心離心全血上層：19體內(nèi)樣品種類與采集尿樣Urine特點(diǎn)：尿藥濃度通常變化較大；尿藥大多呈結(jié)合狀態(tài)。優(yōu)點(diǎn)：易得，且樣品量多；正常尿液僅含微量蛋白。缺點(diǎn)：尿液是一種良好的細(xì)菌培養(yǎng)基；尿液中多具有紫外吸收的化合物。一般在給藥后的不同時(shí)間段收集尿樣19體內(nèi)樣品種類與采集尿樣Urine一般在給藥后的不同時(shí)間段20體內(nèi)樣品種類與采集唾液Saliva優(yōu)點(diǎn)：非傷害性采樣，且不受時(shí)間地點(diǎn)限制。缺點(diǎn)1：唾液藥濃一般低于血漿藥濃；

某些藥物的唾液藥濃（S）與血漿游離藥濃（UP）十分接近，但兩者相關(guān)系數(shù)不明確；

pH改變會(huì)影響弱酸性和弱堿性藥物在唾液中的藥物濃度。一般自然采集或刺激采集，量少20體內(nèi)樣品種類與采集唾液Saliva一般自然采集或刺激采集21體內(nèi)樣品的種類與采集組織tissue指各種體內(nèi)臟器，需要對(duì)其進(jìn)行均勻化制備，使之成勻漿溶液反應(yīng)藥物在臟器的分布與蓄積情況頭發(fā)hair取樣方便，可以獲得長期的用藥史信息前處理復(fù)雜，需要排除頭發(fā)表面的各種干擾21體內(nèi)樣品的種類與采集組織tissue222.2體內(nèi)樣品貯存與處理室溫放置時(shí)間短期保存溫度與時(shí)間長期保存溫度與時(shí)間-20、-40、-80℃分裝保存——便于測(cè)定去活性保存——防止酶降解保存溫度與時(shí)間由

什么決定？2.體內(nèi)樣品的種類、采集與貯存222.2體內(nèi)樣品貯存與處理室溫放置時(shí)間保存溫度與時(shí)間由

23研究維生素C泡騰片進(jìn)入人體后血藥濃度-時(shí)間曲線變化，通過測(cè)定給藥后人血漿中維生素C實(shí)現(xiàn)。問：采集血樣之后如何保存？維生素C的性質(zhì)？維生素C容易氧化，因此采集血樣后加入抗氧劑保存。23研究維生素C泡騰片進(jìn)入人體后血藥濃度-時(shí)間曲線變化，通過243.1體內(nèi)藥物分析的一般流程

血樣尿液唾液膽汁組織器官前處理方法

分離純化濃集樣品測(cè)定方法建立方法優(yōu)化方法學(xué)研究靈敏度準(zhǔn)確度精密度線性和范圍耐用性……靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便3.體內(nèi)藥物分析方法的建立與評(píng)價(jià)243.1體內(nèi)藥物分析的一般流程前處理方法樣品測(cè)定方法學(xué)25新藥臨床藥物代謝動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)新藥I期臨床試驗(yàn)階段中進(jìn)行藥物在健康志愿者體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)，探討藥物在體內(nèi)吸收、分布和消除的特點(diǎn)，為II期臨床實(shí)驗(yàn)的給藥方案制定提供倫理依據(jù)。研究內(nèi)容包括健康受試者單次與多次給藥的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究、飲食的影響、代謝產(chǎn)物的代謝動(dòng)力學(xué)研究、藥物-藥物的代謝動(dòng)力學(xué)相互作用研究等。體內(nèi)藥物分析方法是關(guān)鍵25新藥臨床藥物代謝動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)新藥I期臨床試驗(yàn)階段中進(jìn)行藥物26人血漿中普盧利沙星活性代謝產(chǎn)物NM394的檢測(cè)羧基：酸性基團(tuán)哌嗪環(huán)：堿性、水溶性增加共軛結(jié)構(gòu)26人血漿中普盧利沙星活性代謝產(chǎn)物NM394的檢測(cè)羧基：酸性27分析方法建立分析待測(cè)物——NM394分析目標(biāo)——建立分析方法可以專屬、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)出血漿中NM394HPLC法——分離分析選擇內(nèi)標(biāo)化合物——準(zhǔn)確定量選擇前處理方法——消除干擾、提高檢測(cè)濃度27分析方法建立分析待測(cè)物——NM39428分析方法的建立—色譜條件及優(yōu)化體外方法的建立色譜柱：DiamonsilC18柱(5μm,200mm×4.6mmi.d.)保護(hù)柱：DiamonsilTMODS流動(dòng)相：乙腈-0.5%三乙胺（磷酸調(diào)pH3.0）為21:79流速：1ml/min熒光檢測(cè)：λex-280nm,λem-425nm柱溫：30℃內(nèi)標(biāo)化合物為洛美沙星（結(jié)構(gòu)類似、性質(zhì)相近）28分析方法的建立—色譜條件及優(yōu)化體外方法的建立29分析方法的建立—樣品前處理分析方法的優(yōu)化必須考慮

生物樣品的前處理的影響？29分析方法的建立—樣品前處理分析方法的優(yōu)化必須考慮

生物樣303.2體內(nèi)分析樣品前處理3.2.1生物樣品前處理的目的純化藥物，消除干擾凈化滿足檢測(cè)靈敏度的要求富集減少對(duì)分析儀器的污染改善分析環(huán)境除非生物樣品基質(zhì)不會(huì)干擾檢測(cè)，也不會(huì)污染儀器，同時(shí)還有較好的靈敏度3.體內(nèi)藥物分析方法的建立與評(píng)價(jià)303.2體內(nèi)分析樣品前處理3.2.1生物樣品前處理的目的31示例：血液中酒精的檢測(cè)（直接測(cè)定）頂空氣相色譜火焰離子化檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)0.2ml全血和0.5ml內(nèi)標(biāo)放到小瓶后迅速封口小瓶被放到頂空進(jìn)樣器上自動(dòng)加熱獲得氣液兩相平衡將液上氣體注入GC分析31示例：血液中酒精的檢測(cè)（直接測(cè)定）頂空氣相色譜火焰離子化323.2.2蛋白沉淀proteinprecipitationPPT★測(cè)定血樣時(shí)用，去除蛋白質(zhì)，使結(jié)合的藥物釋放出來有機(jī)溶劑沉淀法（甲醇、乙腈）中性鹽析法（飽和硫酸銨）強(qiáng)酸沉淀法（高氯酸）使蛋白變性后除去323.2.2蛋白沉淀proteinprecipitat33蛋白沉淀過程示意圖A B C DA血漿樣品200μlB加入甲醇600μlC渦旋混合3min后D10000rpm離心10min后33蛋白沉淀過程示意圖A B C DA血漿樣品200μl3434沉淀劑每1容積血漿加入沉淀劑容積0.21.02.03.04.0甲醇17.673.498.798.999.2乙腈13.497.299.799.899.810%三氯醋酸99.799.599.899.899.8鎢酸鹽-硫酸3.399.799.899.9100.0(飽和)硫酸銨21.353.498.3**CuSO4-Na2WO436.597.599.9100.0100.0ZnSO4-NaOH41.194.299.398.899.6常用蛋白沉淀劑的用量及沉淀蛋白的百分率*：樣品渾濁，妨礙準(zhǔn)確測(cè)定3434沉淀劑每1容積血漿加入沉淀劑容積0.21.02.0335蛋白沉淀應(yīng)用特點(diǎn)確定沉淀劑與血漿的最佳比例稀釋倍數(shù)滿足檢測(cè)靈敏度的要求盡可能多沉淀蛋白，減少對(duì)儀器的污染適合濃度較高的血樣處理過程快速，適合不穩(wěn)定的藥物測(cè)定35蛋白沉淀應(yīng)用特點(diǎn)確定沉淀劑與血漿的最佳比例363.2.3液液萃取liquid-liquidextractionLLE★常選擇與水不混溶的有機(jī)溶劑，根據(jù)藥物在水中與有機(jī)溶劑中的溶解度不同而將目標(biāo)藥物和干擾物質(zhì)分開，隨后濃縮含有目標(biāo)藥物的有機(jī)層體液中內(nèi)源性物質(zhì)多為極性成分藥物多為親脂性弱酸或弱堿363.2.3液液萃取liquid-liquidextr37液液萃取示意圖取1ml血漿

置具塞玻璃離心管中精密加入5ml

乙酸乙酯

提取溶劑充分渦旋混合3min37液液萃取示意圖取1ml血漿

置具塞玻璃離心管中精密加入538液液萃取示意圖4000rpm

離心10min后準(zhǔn)確取出上層有機(jī)溶劑置另一干凈具塞玻璃離心管置N2下水浴揮干溶劑殘留物用流動(dòng)相溶解離心后進(jìn)樣HPLC分析便于純化與富集38液液萃取示意圖4000rpm

離心10min后準(zhǔn)確取出39液液萃取應(yīng)用特點(diǎn)確定合適的萃取溶劑依據(jù)相似相溶原則正己烷→乙醚→乙酸乙酯→正丁醇

極性增大有機(jī)相:水相=1:1~5:139液液萃取應(yīng)用特點(diǎn)確定合適的萃取溶劑40示例：尿液中甲基苯丙胺與苯丙胺的檢測(cè)（液液萃取）取尿液2ml，置于5ml離心管中，加入5ml乙醚，渦旋，離心，取乙醚層置另一5ml離心管中，60度水浴氮?dú)饬飨聯(lián)]干取尿液2ml，置于5ml離心管中，加入100μl0.1mol/lNaOH，混勻后加入5ml乙醚，渦旋，離心，取乙醚層置另一5ml離心管中，60度水浴氮?dú)饬飨聯(lián)]干甲基苯丙胺（冰毒）苯丙胺40示例：尿液中甲基苯丙胺與苯丙胺的檢測(cè)（液液萃取）甲基苯丙41液液萃取應(yīng)用特點(diǎn)調(diào)節(jié)水相pH值水相pH值主要由藥物的pKa確定堿性藥物最佳pH值要高于pKa值1-2個(gè)pH單位酸性藥物則要低1-2個(gè)pH單位pKa9.9pKa10.1酸化：0.1mol/lHCl

堿化：0.1mol/lNaOH41液液萃取應(yīng)用特點(diǎn)調(diào)節(jié)水相pH值pKa9.9pKa10423.2.4.固相萃取solid-phaseextractionSPE

★根據(jù)色譜理論發(fā)展的一種前處理方式將具有吸附、分配或離子交換性質(zhì)的擔(dān)體作為萃取劑填入小柱，溶劑淋洗活化后，將生物樣品通過小柱，使其藥物或雜質(zhì)保留在擔(dān)體上，選擇一種溶劑洗去雜質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑將藥物洗脫下來。常用擔(dān)體：疏水性的C18化學(xué)鍵合硅膠等423.2.4.固相萃取solid-phaseextr43固相萃取基本操作固定相C18先甲醇潤濕小柱

再用水除去多余甲醇1)活化43固相萃取基本操作固定相C18先甲醇潤濕小柱

再用水除去44固相萃取基本操作1)活化2)上樣液體樣品內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物44固相萃取基本操作1)活化液體樣品內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)45固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗選擇不同極性溶劑

依次為：水，由低到高比例的甲醇內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑45固相萃取基本操作1)活化3)淋洗選擇不同極性溶劑

依次46固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗淋洗的目的：除去生物樣品的干擾，待測(cè)藥物仍然保留在SPE柱上內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑46固相萃取基本操作1)活化3)淋洗淋洗的目的：除去生物樣47固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗4)洗脫100%甲醇為洗脫劑內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑洗脫溶劑47固相萃取基本操作1)活化3)淋洗4)洗脫100%甲醇48固相萃取基本操作收集洗脫液，其中含有待測(cè)藥物直接進(jìn)樣分析

濃縮后進(jìn)樣分析待測(cè)藥物洗脫溶劑1)活化2)上樣3)淋洗4)洗脫48固相萃取基本操作收集洗脫液，其中含有待測(cè)藥物直接進(jìn)樣分析49固相萃取基本操作內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑洗脫溶劑活化上樣淋洗洗脫49固相萃取基本操作內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑50固相萃取應(yīng)用特點(diǎn)根據(jù)藥物性質(zhì)選擇適合的柱填料，以提高提取回收率處理速度快，具有一定通量，較容易自動(dòng)化或聯(lián)用50固相萃取應(yīng)用特點(diǎn)根據(jù)藥物性質(zhì)選擇適合的柱填料，以提高提取513.2.5其他處理方式固體樣品均勻化處理組織樣品——按照1:4(w/v)用生理鹽水或緩沖液進(jìn)行勻漿，勻漿前剪碎組織糞便樣品——低溫烘干后，取樣品研碎，用適當(dāng)溶劑萃?。ǔ暎┳⒁獗ＷC取樣均一513.2.5其他處理方式固體樣品均勻化處理52523.2.5其他處理方式綴合物的水解藥物或者其代謝產(chǎn)物與體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合生成的產(chǎn)物稱為綴合物。常見葡萄糖醛酸苷綴合物和硫酸酯綴合物綴合物較原型藥物具有較大的極性，有機(jī)溶劑不易提取。常用酸水解、酶水解的方法使藥物釋放出52523.2.5其他處理方式綴合物的水解53血漿中NM394的樣品前處理液液萃?。河幸欢ㄋ苄?，提取溶劑中需要加入一些極性溶劑蛋白沉淀：完全可以固相萃取：完全可以本實(shí)驗(yàn)研究選擇蛋白沉淀為前處理方法：200μl血漿+50μl內(nèi)標(biāo)溶液+100μl

10%高氯酸溶液→渦旋混勻3min→10000rpm離心10min→上清液取出二次離心10000rpm10min→上清液20μl進(jìn)樣HPLC分析考察不同蛋白沉淀劑對(duì)方法專屬性的影響，和對(duì)絕對(duì)回收率的影響——決定的檢測(cè)靈敏度53血漿中NM394的樣品前處理液液萃?。河幸欢ㄋ苄裕崛?43.3體內(nèi)樣品分析方法學(xué)驗(yàn)證特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍定量下限精密度與準(zhǔn)確度穩(wěn)定性提取回收率分析過程質(zhì)量控制超限樣品處理3.體內(nèi)藥物分析方法的建立與評(píng)價(jià)專屬性標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍定量限/檢測(cè)限精密度與準(zhǔn)確度耐用性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證內(nèi)容體內(nèi)樣品分析方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容概念相似方法不同543.3體內(nèi)樣品分析方法學(xué)驗(yàn)證特異性3.體內(nèi)藥物分析方法的55血漿中NM394檢測(cè)的特異性內(nèi)標(biāo)NM394內(nèi)源性物質(zhì)是否有干擾未知代謝物是否有干擾與色譜分析方法有關(guān)與前處理方法有關(guān)55血漿中NM394檢測(cè)的特異性內(nèi)標(biāo)NM394內(nèi)源性物質(zhì)是否56血漿中NM394檢測(cè)的提取回收率提取回收率又叫絕對(duì)回收率，指從生物樣品中回收得到待測(cè)物的響應(yīng)值與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的響應(yīng)值的比值。

180μl血漿+20μl1μg/ml對(duì)照品溶液=200μl標(biāo)準(zhǔn)添加血漿0.1μg/ml前處理：+50μl內(nèi)標(biāo)溶液+100μl

10%高氯酸溶液沉淀濃度0.1*0.2/0.35→分子上的響應(yīng)值流動(dòng)相配制濃度為0.1*0.2/0.35的對(duì)照品溶液→分母上的響應(yīng)值56血漿中NM394檢測(cè)的提取回收率提取回收率又叫絕對(duì)回收率57血漿中NM394檢測(cè)的提取回收率評(píng)價(jià)分析方法將體內(nèi)樣品中的待測(cè)物從生物基質(zhì)中提取出來的能力★提取回收率高，檢測(cè)靈敏度就高要求在不同濃度上，具有較為接近的提取回收率即可測(cè)定濃度μg/ml提取回收率0.0278.30.1081.50.8084.357血漿中NM394檢測(cè)的提取回收率評(píng)價(jià)分析方法將體內(nèi)樣品中58血漿中NM394的線性范圍、定量下限采用內(nèi)標(biāo)工作曲線法定量配制血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度樣品（標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品也是經(jīng)過前處理之后才能進(jìn)樣分析的，這與體外質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完全不同）0.01,0.02,0.05,0.10,0.20,0.50,1.00μg/ml范圍由預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，定量下限需要滿足準(zhǔn)確測(cè)定出藥物經(jīng)過3~5個(gè)半衰期后體內(nèi)濃度；或者藥物達(dá)峰濃度的1/10~1/20。定量上限應(yīng)高于達(dá)峰濃度。較寬的工作曲線范圍。58血漿中NM394的線性范圍、定量下限采用內(nèi)標(biāo)工作曲線法定59血漿中NM394的線性范圍、定量下限定量下限濃度μg/ml內(nèi)標(biāo)NM394比值0.01234882.65801.60.02470.012334505532.10.0236970.01246342.85205.90.0211330.01235620.25320.10.0225790.0122145051220.023129y=2.3051x-0.0062定量下限濃度一般較低，因此該濃度點(diǎn)的準(zhǔn)確度、精密度也是需要考察的內(nèi)容59血漿中NM394的線性范圍、定量下限定量下限濃度μg/m60血漿中NM394測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度生物樣品的處理過程非常復(fù)雜，隨著前處理步驟的增多，測(cè)定的準(zhǔn)確度、精密度都會(huì)變差。準(zhǔn)確度85~115%，RSD<15%。定量下限準(zhǔn)確度80%~120%，RSD<20%60血漿中NM394測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度生物樣品的處理過程非61血漿中NM394測(cè)定的穩(wěn)定性含藥生物樣品需要從臨床或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移至分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)定，需要時(shí)間；樣品量巨大，一天無法完成，需要多日完成。短期穩(wěn)定性——室溫放置的生物樣品長期穩(wěn)定性——冷凍條件下放置自動(dòng)進(jìn)樣器穩(wěn)定性——處理后的生物樣品放置凍融穩(wěn)定性——涉及到生物樣品復(fù)測(cè)的反復(fù)凍融61血漿中NM394測(cè)定的穩(wěn)定性含藥生物樣品需要從臨床或動(dòng)物62分析過程的質(zhì)量控制QC（qualitycontrol）質(zhì)量控制QC樣品即在空白生物樣品中+已知待測(cè)物的對(duì)照品制得，用于進(jìn)行分析方法的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)，以及監(jiān)測(cè)每一批分析過程的完整性和正確性。隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線定量本批次樣品QC樣品的準(zhǔn)確度確定本批次方法是否準(zhǔn)確62分析過程的質(zhì)量控制QC（qualitycontrol）63藥時(shí)曲線63藥時(shí)曲線64小結(jié)1.概述★2.常用體內(nèi)樣品的種類、采集與貯藏體內(nèi)樣品的種類與采集體內(nèi)樣品的貯存與處理3.體內(nèi)藥物分析方法的建立與評(píng)價(jià)★體內(nèi)藥物分析的一般流程體內(nèi)分析樣品前處理★★體內(nèi)樣品分析方法學(xué)驗(yàn)證★64小結(jié)1.概述★65體內(nèi)藥物分析

BiopharmaceuticalAnalysis;

BiomedicalAnalysis。1體內(nèi)藥物分析

BiopharmaceuticalAnal66乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：口服。成人常用量：支氣管感染、肺部感染：一次2片，一日2次，或一次1片，一日3次，療程7-14日。急性單純性下尿路感染：一次1片，一日2次，療程5～7日；復(fù)雜性尿路感染：一次2片，一日2次，或一次1片，一日3次，療程10～14日。細(xì)菌性前列腺炎：一次2片，一日2次，療程6周。0.3-0.4g/日0.2g/日0.4g/日2乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：0.3-0.4g/67抗菌藥物的抗菌活性藥物抑制或者殺滅病原菌的能力最低抑菌濃度（minimuminhibitoryconcentration）抑制培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌生長的最低濃度。MIC最低殺菌濃度（minimumbactericidalconcentration）殺滅培養(yǎng)基內(nèi)99.9%的微生物。MBC喹諾酮類藥物對(duì)致病菌的殺菌作用取決于藥物血藥濃度的峰濃度，即藥物濃度越高，殺菌作用越強(qiáng)?！獫舛纫蕾囆詴r(shí)間依賴性——?dú)⒕钚耘c藥物濃度維持在MIC以上時(shí)間的長短有關(guān)。β-內(nèi)酰胺類、林可霉素類等抗生素。3抗菌藥物的抗菌活性藥物抑制或者殺滅病原菌的能力68乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：口服。成人常用量：支氣管感染、肺部感染：

藥物隨著血液到各個(gè)組織急性單純性下尿路感染：

藥物通過尿液排泄在下尿路發(fā)揮治療作用細(xì)菌性前列腺炎：

藥物隨著血液到前列腺組織0.3-0.4g/日0.2g/日0.4g/日測(cè)定血液、尿液甚至組織中的藥物濃度4乳酸左氧氟沙星（0.1g/片）用法用量：0.3-0.4g/691.1體內(nèi)藥物分析的定義體內(nèi)樣品（生物體液、器官或組織）中藥物及其代謝產(chǎn)物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的定性、定量分析。體內(nèi)樣品——確定分析對(duì)象藥物、代謝產(chǎn)物、內(nèi)源性生物活性物質(zhì)——確定待分析物定性、定量分析——如何選擇分析手段、建立方法并驗(yàn)證1.概述51.1體內(nèi)藥物分析的定義體內(nèi)樣品（生物體液、器官或組織）中70體內(nèi)·藥物·分析原料藥純度高

干擾少容量分析為主制劑主藥一或多

輔料干擾多儀器分析為主體內(nèi)藥物成分復(fù)雜

干擾眾多

濃度很低高靈敏度

高選擇性的方法6體內(nèi)·藥物·分析原料藥制劑體內(nèi)藥物成分復(fù)雜

干擾眾多

濃度711.2體內(nèi)藥物分析對(duì)象和待測(cè)物特點(diǎn)★成分復(fù)雜、干擾眾多生物基質(zhì)的干擾——蛋白質(zhì)、糖、脂肪、離子……其他藥物的干擾——卡馬西平治療癲癇的有效血藥濃度為3~8μg/ml，潛在中毒濃度為12μg/ml。病人可能之前用過其他抗癲癇藥物如丙戊酸鈉、乙琥胺等。代謝產(chǎn)物與原型藥物互相干擾——抗抑郁藥米氮平DMR8-OHMN-O-MRT方法選擇性要高71.2體內(nèi)藥物分析對(duì)象和待測(cè)物特點(diǎn)★成分復(fù)雜、干擾眾多DM72體內(nèi)藥物分析對(duì)象和待測(cè)物特點(diǎn)★采樣量小，濃度很低常見的生物樣品采樣量少，特定條件采集，不易重新獲得

血漿：人1~3ml；犬1~5ml；大鼠0.3~0.5ml濃度為ng/ml~μg/ml數(shù)量級(jí)血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液、膽汁、乳汁、腦脊液等均勻生物樣品心、肝、脾、肺、腎、腦等非均勻生物樣品方法靈敏度要高8體內(nèi)藥物分析對(duì)象和待測(cè)物特點(diǎn)★采樣量小，濃度很低血液（血漿731.3體內(nèi)藥物分析方法的特點(diǎn)★對(duì)分析方法的要求高：滿足靈敏度及專屬性的要求樣品需要經(jīng)過前處理，才能分析分析工作量大，方法驗(yàn)證要求嚴(yán)格，測(cè)試數(shù)據(jù)處理和結(jié)果闡明較為復(fù)雜1.概述91.3體內(nèi)藥物分析方法的特點(diǎn)★對(duì)分析方法的要求高：滿足靈741.4體內(nèi)藥物分析的任務(wù)定性分析——藥物代謝產(chǎn)物、內(nèi)源性物質(zhì)是什么定量分析——血漿、組織、尿液藥物及代謝物濃度藥物代謝與動(dòng)力學(xué)（drugmetabolismandpharmacokinetics，DMPK）研究——新藥研發(fā)治療藥物監(jiān)測(cè)（TherapeuticDrugMonitoring，TDM）——臨床應(yīng)用內(nèi)源性物質(zhì)檢測(cè)——疾病標(biāo)志物社會(huì)事件中的分析——食品安全、法醫(yī)毒物分析等1.概述101.4體內(nèi)藥物分析的任務(wù)定性分析——藥物代謝產(chǎn)物、內(nèi)源性75體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：DMPK藥代動(dòng)力學(xué)研究涉及藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄等動(dòng)態(tài)過程，需要研究血藥/組織濃度－時(shí)間曲線的變化，探討藥物分布與藥理作用的關(guān)系。1,2–Stability+Solubility3–Passive+ActiveTrans.4–Pgpefflux+CYP3A45-Hepaticfirstpasseffect11體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：DMPK藥代動(dòng)力學(xué)研究涉及藥物在體內(nèi)76藥物代謝與動(dòng)力學(xué)血藥濃度-時(shí)間曲線尿藥累積排泄曲線生物等效性評(píng)價(jià)絕對(duì)生物利用度相對(duì)生物利用度代謝途徑代謝酶……12藥物代謝與動(dòng)力學(xué)血藥濃度-時(shí)間曲線77體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：TDMTDM即測(cè)定血液中或其它體液中藥物濃度，觀察臨床藥物反應(yīng)，考察藥物治療效果，必要時(shí)根據(jù)藥動(dòng)學(xué)原理調(diào)整給藥方案。方向是實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥，目的為臨床合理用藥服務(wù)，達(dá)到最佳的藥物治療效果。治療范圍中毒范圍無效范圍C最大耐受濃度最小有效濃度13體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：TDMTDM即測(cè)定血液中或其它體液中78治療藥物監(jiān)測(cè)血藥濃度μg/ml10~2020~3030~40>40藥理及

毒性反應(yīng)有效血藥濃度眼球震顫運(yùn)動(dòng)失調(diào)精神異常抗癲癇藥苯妥英鈉血藥濃度與藥理作用及毒性反應(yīng)患者女性，25歲，因癲癇強(qiáng)直陣攣性發(fā)作入院，遂靜脈注射負(fù)荷劑量苯妥英鈉800mg并開始口服維持劑量250mg/d。測(cè)得苯妥英鈉的濃度為3.6μg/ml，醫(yī)生考慮到尚未達(dá)到治療濃度范圍，故增加劑量到400mg/d?；颊叱霈F(xiàn)痙攣等類似癲癇發(fā)作癥狀。測(cè)得血藥濃度為10.9μg/ml，醫(yī)生擬打算再次增加劑量。患者白蛋白為20g/L(正常范圍是34~48g/L)，于是建議檢查患者游離苯妥英鈉濃度。結(jié)果顯示游離苯妥英鈉濃度為4.9μg/ml（游離藥物治療濃度范圍1~2μg/ml），判定患者苯妥英鈉中毒，建議降低劑量為250mg/d。14治療藥物監(jiān)測(cè)血藥濃度μg/ml10~2020~3030~79體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：內(nèi)源性物質(zhì)檢測(cè)體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)如氨基酸、激素、兒茶酚胺、肌酐、草酸、尿酸等。機(jī)體正常生理?xiàng)l件或機(jī)體發(fā)生病變：測(cè)定體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)或疾病標(biāo)志物的含量，疾病的輔助診斷或及早預(yù)防。藥物（中藥）代謝組學(xué)研究15體內(nèi)藥物分析的任務(wù)：內(nèi)源性物質(zhì)檢測(cè)體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)如氨基酸80體內(nèi)藥物分析的中心任務(wù)體內(nèi)藥物分析方法學(xué)研究生物樣品預(yù)處理方法分離分析實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化選擇考察體內(nèi)分析方法的靈敏度、專屬性、準(zhǔn)確度、線性范圍等為臨床藥理學(xué)、臨床藥學(xué)等相關(guān)學(xué)科提供專一、靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的體內(nèi)藥物分析方法。16體內(nèi)藥物分析的中心任務(wù)體內(nèi)藥物分析方法學(xué)研究812.1體內(nèi)樣品的種類與采集血液（血漿、血清、全血）、尿液、唾液、膽汁、乳汁、腦脊液等均勻生物樣品心、肝、脾、肺、腎、腦等非均勻生物樣品樣品選取原則（1）必須是能夠反映出濃度與藥物效應(yīng)之間關(guān)系；（2）易于獲得；（3）便于處理，適合于分析；（4）根據(jù)不同目的與要求進(jìn)行選取。2.體內(nèi)樣品的種類、采集與貯存172.1體內(nèi)樣品的種類與采集血液（血漿、血清、全血）、尿液82體內(nèi)樣品種類與采集血液自然凝結(jié)加抗凝劑離心離心全血上層：血清serum（比血漿少纖維蛋白原）（40%）下層：血細(xì)胞（凝塊）上層：血漿

plasma（50%）下層：血細(xì)胞血樣Blood一般在給藥后的不同時(shí)間點(diǎn)采集血樣18體內(nèi)樣品種類與采集血液自然凝結(jié)加抗凝劑離心離心全血上層：83體內(nèi)樣品種類與采集尿樣Urine特點(diǎn)：尿藥濃度通常變化較大；尿藥大多呈結(jié)合狀態(tài)。優(yōu)點(diǎn)：易得，且樣品量多；正常尿液僅含微量蛋白。缺點(diǎn)：尿液是一種良好的細(xì)菌培養(yǎng)基；尿液中多具有紫外吸收的化合物。一般在給藥后的不同時(shí)間段收集尿樣19體內(nèi)樣品種類與采集尿樣Urine一般在給藥后的不同時(shí)間段84體內(nèi)樣品種類與采集唾液Saliva優(yōu)點(diǎn)：非傷害性采樣，且不受時(shí)間地點(diǎn)限制。缺點(diǎn)1：唾液藥濃一般低于血漿藥濃；

某些藥物的唾液藥濃（S）與血漿游離藥濃（UP）十分接近，但兩者相關(guān)系數(shù)不明確；

pH改變會(huì)影響弱酸性和弱堿性藥物在唾液中的藥物濃度。一般自然采集或刺激采集，量少20體內(nèi)樣品種類與采集唾液Saliva一般自然采集或刺激采集85體內(nèi)樣品的種類與采集組織tissue指各種體內(nèi)臟器，需要對(duì)其進(jìn)行均勻化制備，使之成勻漿溶液反應(yīng)藥物在臟器的分布與蓄積情況頭發(fā)hair取樣方便，可以獲得長期的用藥史信息前處理復(fù)雜，需要排除頭發(fā)表面的各種干擾21體內(nèi)樣品的種類與采集組織tissue862.2體內(nèi)樣品貯存與處理室溫放置時(shí)間短期保存溫度與時(shí)間長期保存溫度與時(shí)間-20、-40、-80℃分裝保存——便于測(cè)定去活性保存——防止酶降解保存溫度與時(shí)間由

什么決定？2.體內(nèi)樣品的種類、采集與貯存222.2體內(nèi)樣品貯存與處理室溫放置時(shí)間保存溫度與時(shí)間由

87研究維生素C泡騰片進(jìn)入人體后血藥濃度-時(shí)間曲線變化，通過測(cè)定給藥后人血漿中維生素C實(shí)現(xiàn)。問：采集血樣之后如何保存？維生素C的性質(zhì)？維生素C容易氧化，因此采集血樣后加入抗氧劑保存。23研究維生素C泡騰片進(jìn)入人體后血藥濃度-時(shí)間曲線變化，通過883.1體內(nèi)藥物分析的一般流程

血樣尿液唾液膽汁組織器官前處理方法

分離純化濃集樣品測(cè)定方法建立方法優(yōu)化方法學(xué)研究靈敏度準(zhǔn)確度精密度線性和范圍耐用性……靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便3.體內(nèi)藥物分析方法的建立與評(píng)價(jià)243.1體內(nèi)藥物分析的一般流程前處理方法樣品測(cè)定方法學(xué)89新藥臨床藥物代謝動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)新藥I期臨床試驗(yàn)階段中進(jìn)行藥物在健康志愿者體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)，探討藥物在體內(nèi)吸收、分布和消除的特點(diǎn)，為II期臨床實(shí)驗(yàn)的給藥方案制定提供倫理依據(jù)。研究內(nèi)容包括健康受試者單次與多次給藥的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究、飲食的影響、代謝產(chǎn)物的代謝動(dòng)力學(xué)研究、藥物-藥物的代謝動(dòng)力學(xué)相互作用研究等。體內(nèi)藥物分析方法是關(guān)鍵25新藥臨床藥物代謝動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)新藥I期臨床試驗(yàn)階段中進(jìn)行藥物90人血漿中普盧利沙星活性代謝產(chǎn)物NM394的檢測(cè)羧基：酸性基團(tuán)哌嗪環(huán)：堿性、水溶性增加共軛結(jié)構(gòu)26人血漿中普盧利沙星活性代謝產(chǎn)物NM394的檢測(cè)羧基：酸性91分析方法建立分析待測(cè)物——NM394分析目標(biāo)——建立分析方法可以專屬、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)出血漿中NM394HPLC法——分離分析選擇內(nèi)標(biāo)化合物——準(zhǔn)確定量選擇前處理方法——消除干擾、提高檢測(cè)濃度27分析方法建立分析待測(cè)物——NM39492分析方法的建立—色譜條件及優(yōu)化體外方法的建立色譜柱：DiamonsilC18柱(5μm,200mm×4.6mmi.d.)保護(hù)柱：DiamonsilTMODS流動(dòng)相：乙腈-0.5%三乙胺（磷酸調(diào)pH3.0）為21:79流速：1ml/min熒光檢測(cè)：λex-280nm,λem-425nm柱溫：30℃內(nèi)標(biāo)化合物為洛美沙星（結(jié)構(gòu)類似、性質(zhì)相近）28分析方法的建立—色譜條件及優(yōu)化體外方法的建立93分析方法的建立—樣品前處理分析方法的優(yōu)化必須考慮

生物樣品的前處理的影響？29分析方法的建立—樣品前處理分析方法的優(yōu)化必須考慮

生物樣943.2體內(nèi)分析樣品前處理3.2.1生物樣品前處理的目的純化藥物，消除干擾凈化滿足檢測(cè)靈敏度的要求富集減少對(duì)分析儀器的污染改善分析環(huán)境除非生物樣品基質(zhì)不會(huì)干擾檢測(cè)，也不會(huì)污染儀器，同時(shí)還有較好的靈敏度3.體內(nèi)藥物分析方法的建立與評(píng)價(jià)303.2體內(nèi)分析樣品前處理3.2.1生物樣品前處理的目的95示例：血液中酒精的檢測(cè)（直接測(cè)定）頂空氣相色譜火焰離子化檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)0.2ml全血和0.5ml內(nèi)標(biāo)放到小瓶后迅速封口小瓶被放到頂空進(jìn)樣器上自動(dòng)加熱獲得氣液兩相平衡將液上氣體注入GC分析31示例：血液中酒精的檢測(cè)（直接測(cè)定）頂空氣相色譜火焰離子化963.2.2蛋白沉淀proteinprecipitationPPT★測(cè)定血樣時(shí)用，去除蛋白質(zhì)，使結(jié)合的藥物釋放出來有機(jī)溶劑沉淀法（甲醇、乙腈）中性鹽析法（飽和硫酸銨）強(qiáng)酸沉淀法（高氯酸）使蛋白變性后除去323.2.2蛋白沉淀proteinprecipitat97蛋白沉淀過程示意圖A B C DA血漿樣品200μlB加入甲醇600μlC渦旋混合3min后D10000rpm離心10min后33蛋白沉淀過程示意圖A B C DA血漿樣品200μl9898沉淀劑每1容積血漿加入沉淀劑容積0.21.02.03.04.0甲醇17.673.498.798.999.2乙腈13.497.299.799.899.810%三氯醋酸99.799.599.899.899.8鎢酸鹽-硫酸3.399.799.899.9100.0(飽和)硫酸銨21.353.498.3**CuSO4-Na2WO436.597.599.9100.0100.0ZnSO4-NaOH41.194.299.398.899.6常用蛋白沉淀劑的用量及沉淀蛋白的百分率*：樣品渾濁，妨礙準(zhǔn)確測(cè)定3434沉淀劑每1容積血漿加入沉淀劑容積0.21.02.0399蛋白沉淀應(yīng)用特點(diǎn)確定沉淀劑與血漿的最佳比例稀釋倍數(shù)滿足檢測(cè)靈敏度的要求盡可能多沉淀蛋白，減少對(duì)儀器的污染適合濃度較高的血樣處理過程快速，適合不穩(wěn)定的藥物測(cè)定35蛋白沉淀應(yīng)用特點(diǎn)確定沉淀劑與血漿的最佳比例1003.2.3液液萃取liquid-liquidextractionLLE★常選擇與水不混溶的有機(jī)溶劑，根據(jù)藥物在水中與有機(jī)溶劑中的溶解度不同而將目標(biāo)藥物和干擾物質(zhì)分開，隨后濃縮含有目標(biāo)藥物的有機(jī)層體液中內(nèi)源性物質(zhì)多為極性成分藥物多為親脂性弱酸或弱堿363.2.3液液萃取liquid-liquidextr101液液萃取示意圖取1ml血漿

置具塞玻璃離心管中精密加入5ml

乙酸乙酯

提取溶劑充分渦旋混合3min37液液萃取示意圖取1ml血漿

置具塞玻璃離心管中精密加入5102液液萃取示意圖4000rpm

離心10min后準(zhǔn)確取出上層有機(jī)溶劑置另一干凈具塞玻璃離心管置N2下水浴揮干溶劑殘留物用流動(dòng)相溶解離心后進(jìn)樣HPLC分析便于純化與富集38液液萃取示意圖4000rpm

離心10min后準(zhǔn)確取出103液液萃取應(yīng)用特點(diǎn)確定合適的萃取溶劑依據(jù)相似相溶原則正己烷→乙醚→乙酸乙酯→正丁醇

極性增大有機(jī)相:水相=1:1~5:139液液萃取應(yīng)用特點(diǎn)確定合適的萃取溶劑104示例：尿液中甲基苯丙胺與苯丙胺的檢測(cè)（液液萃取）取尿液2ml，置于5ml離心管中，加入5ml乙醚，渦旋，離心，取乙醚層置另一5ml離心管中，60度水浴氮?dú)饬飨聯(lián)]干取尿液2ml，置于5ml離心管中，加入100μl0.1mol/lNaOH，混勻后加入5ml乙醚，渦旋，離心，取乙醚層置另一5ml離心管中，60度水浴氮?dú)饬飨聯(lián)]干甲基苯丙胺（冰毒）苯丙胺40示例：尿液中甲基苯丙胺與苯丙胺的檢測(cè)（液液萃?。┘谆奖?05液液萃取應(yīng)用特點(diǎn)調(diào)節(jié)水相pH值水相pH值主要由藥物的pKa確定堿性藥物最佳pH值要高于pKa值1-2個(gè)pH單位酸性藥物則要低1-2個(gè)pH單位pKa9.9pKa10.1酸化：0.1mol/lHCl

堿化：0.1mol/lNaOH41液液萃取應(yīng)用特點(diǎn)調(diào)節(jié)水相pH值pKa9.9pKa101063.2.4.固相萃取solid-phaseextractionSPE

★根據(jù)色譜理論發(fā)展的一種前處理方式將具有吸附、分配或離子交換性質(zhì)的擔(dān)體作為萃取劑填入小柱，溶劑淋洗活化后，將生物樣品通過小柱，使其藥物或雜質(zhì)保留在擔(dān)體上，選擇一種溶劑洗去雜質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑將藥物洗脫下來。常用擔(dān)體：疏水性的C18化學(xué)鍵合硅膠等423.2.4.固相萃取solid-phaseextr107固相萃取基本操作固定相C18先甲醇潤濕小柱

再用水除去多余甲醇1)活化43固相萃取基本操作固定相C18先甲醇潤濕小柱

再用水除去108固相萃取基本操作1)活化2)上樣液體樣品內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物44固相萃取基本操作1)活化液體樣品內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)109固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗選擇不同極性溶劑

依次為：水，由低到高比例的甲醇內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑45固相萃取基本操作1)活化3)淋洗選擇不同極性溶劑

依次110固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗淋洗的目的：除去生物樣品的干擾，待測(cè)藥物仍然保留在SPE柱上內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑46固相萃取基本操作1)活化3)淋洗淋洗的目的：除去生物樣111固相萃取基本操作1)活化2)上樣3)淋洗4)洗脫100%甲醇為洗脫劑內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑洗脫溶劑47固相萃取基本操作1)活化3)淋洗4)洗脫100%甲醇112固相萃取基本操作收集洗脫液，其中含有待測(cè)藥物直接進(jìn)樣分析

濃縮后進(jìn)樣分析待測(cè)藥物洗脫溶劑1)活化2)上樣3)淋洗4)洗脫48固相萃取基本操作收集洗脫液，其中含有待測(cè)藥物直接進(jìn)樣分析113固相萃取基本操作內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑洗脫溶劑活化上樣淋洗洗脫49固相萃取基本操作內(nèi)源性物質(zhì)其他外源性物質(zhì)待測(cè)藥物淋洗溶劑114固相萃取應(yīng)用特點(diǎn)根據(jù)藥物性質(zhì)選擇適合的柱填料，以提高提取回收率處理速度快，具有一定通量，較容易自動(dòng)化或聯(lián)用50固相萃取應(yīng)用特點(diǎn)根據(jù)藥物性質(zhì)選擇適合的柱填料，以提高提取1153.2.5其他處理方式固體樣品均勻化處理組織樣品——按照1:4(w/v)用生理鹽水或緩沖液進(jìn)行勻漿，勻漿前剪碎組織糞便樣品——低溫烘干后，取樣品研碎，用適當(dāng)溶劑萃?。ǔ暎┳⒁獗ＷC取樣均一513.2.5其他處理方式固體樣品均勻化處理1161163.2.5其他處理方式綴合物的水解藥物或者其代謝產(chǎn)物與體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合生成的產(chǎn)物稱為綴合物。常見葡萄糖醛酸苷綴合物和硫酸酯綴合物綴合物較原型藥物具有較大的極性，有機(jī)溶劑不易提取。常用酸水解、酶水解的方法使藥物釋放出52523.2.5其他處理方式綴合物的水解117血漿中NM394的樣品前處理液液萃?。河幸欢ㄋ苄?，提取溶劑中需要加入一些極性溶劑蛋白沉淀：完全可以固相萃?。和耆梢员緦?shí)驗(yàn)研究選擇蛋白沉