臨床檢驗(yàn)技師-臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)(2019)講義第六章沉淀反應(yīng)

第第8頁共8頁第六章沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在特定條件下發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。第一節(jié)沉淀反應(yīng)的特點(diǎn)沉淀反應(yīng)中的抗原多為蛋白質(zhì)、多糖、血清、毒素等可溶性物質(zhì)。沉淀反應(yīng)分兩個(gè)階段，特異性結(jié)合肉眼不可見免疫復(fù)合物，約需幾十分鐘到數(shù)小時(shí)才能完成，如沉淀線、沉淀環(huán)。第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)一、絮狀沉淀試驗(yàn)抗原抗體溶液在電解質(zhì)的存在下結(jié)合，形成絮狀沉淀物，這種絮狀沉淀受抗原和抗體比例的直接影響，因此常用來作為測定抗原抗體反應(yīng)最適比例的方法，常見類型有：（一）抗原稀釋法抗原進(jìn)行一系列稀釋與恒定濃度抗血清反應(yīng)。（二）抗體稀釋法抗體進(jìn)行一系列稀釋與恒定濃度抗原反應(yīng)。（三）方陣滴定法即棋盤滴定法。二、免疫濁度測定微量抗原、抗體及小分子半抗原定量檢測。（一）免疫比濁測定的影響因素抗原抗體的比例是濁度形成的關(guān)鍵因素。當(dāng)抗原過量時(shí)，形成的IC分子小，而且會發(fā)生再解離，使?jié)岫确炊陆?，光散射亦減少，這就是高劑量鉤狀效應(yīng)。當(dāng)抗體過量時(shí)，IC的形成隨著抗原遞增而增加，至抗原、抗體最適比例處達(dá)最高峰，這就是經(jīng)典的海德堡曲線理論。在反應(yīng)體系中需保持抗體適當(dāng)過量，如形成抗原過量則造成測定的準(zhǔn)確性降低。特異性強(qiáng)效價(jià)高：（＜1:20）抗體會增加非特異性濁度（偽濁度）的產(chǎn)生。則抗體的活性高，可加快抗原抗體反應(yīng)的速度，且形成的IC（4）R型和H型抗體：R型抗體是指以家兔為代表的小型動物被注射抗原免疫后制備的抗血清。這類抗血清的特點(diǎn)是親和力較強(qiáng)，抗原抗體結(jié)合后不易發(fā)生解離。H型抗體是指以馬為代表的大型動物注射抗原后制備的抗血清，這類抗血清的親和力弱，抗原抗體結(jié)合后極易解離?？乖贵w反應(yīng)的溶液反應(yīng)液最適pH為6.5～8.5。常使用磷酸鹽緩沖液作為免疫比濁法的反應(yīng)液。在一定范圍內(nèi)，離子強(qiáng)度大，IC形成越快。增濁劑某些非離子型親水劑對促進(jìn)IC的形成有顯著的增強(qiáng)作用，如聚乙二醇（PEG）、吐溫-20，其作用是消除蛋白質(zhì)（抗原或抗體）分子周圍的電子云和水化層，促進(jìn)抗原、抗體分子靠近，結(jié)合形成大分子復(fù)合物。（二）免疫比濁法方法分類透射免疫比濁法合物。散射免疫比濁法散射光強(qiáng)度來定量抗原抗體的復(fù)合物。免疫膠乳比濁法是以膠乳作為載體定的靈敏度。第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)利用可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠內(nèi)擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原與抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。凝膠支持物的種類有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠等。不同分子量的物質(zhì)在凝膠中擴(kuò)散速度不同，借此可用以識別不同待測物分子量的差別。一、單向擴(kuò)散試驗(yàn)在瓊脂內(nèi)混入抗體，待測抗原從局部向瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，如抗原和相應(yīng)抗體結(jié)合，則形成沉淀環(huán)。（一）試管法將一定量的抗體混入0.7%瓊脂糖溶液中，注入小試管內(nèi)，上層加抗原溶液，使其自由擴(kuò)散，在抗原抗體比例恰當(dāng)位置形成沉淀環(huán)。（二0.9%瓊脂糖行自由擴(kuò)散，24～48小時(shí)兩種計(jì)算方法：Mancini曲線適用大分子抗原長時(shí)間擴(kuò)散（48小時(shí)的結(jié)果，沉淀環(huán)直徑的平方d2）濃度（c）。Fahey小分子抗原的結(jié)果處理，用半對數(shù)紙畫線，濃度對數(shù)logc散環(huán)直徑其中c）。（三）影響因素抗血清必須特異性強(qiáng)、效價(jià)高、親和力強(qiáng)，在良好條件下保存。每次測定都必須作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次測定時(shí)必須用質(zhì)控血清作質(zhì)控。注意雙環(huán)現(xiàn)象（出現(xiàn)了兩種抗原性相同成分）。二、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)抗原抗體。根據(jù)試驗(yàn)形式可分為試管法和平板法兩種。（一）試管法抗體——瓊脂——抗原（二）平板法是鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一?？乖蚩贵w的存在與否以及相對含量的估計(jì)靠近抗原孔抗體較大；靠近抗體孔抗原較大；不出現(xiàn)沉淀線抗體（抗原）抗原過量。抗原或抗體相對分子量的分析，反之則較慢。；如果兩者分子量大致相等，則形成直線?？乖再|(zhì)的分析兩個(gè)抗原相同；相切有部分相同；交叉而過完全不同?？贵w效價(jià)的滴定。。第四節(jié)免疫電泳技術(shù)電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。一、優(yōu)點(diǎn)（一）加快了沉淀反應(yīng)的速度；（二）電場規(guī)定了抗原抗體的擴(kuò)散方向，使其集中，提高了靈敏度；（三）可將某些蛋白組分根據(jù)其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)。二、對流免疫電泳雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的定向加速的免疫擴(kuò)散技術(shù)。在pH8.6緩沖液中，大多蛋白質(zhì)帶強(qiáng)負(fù)電荷，在電場中向正極移動；而IgG等電點(diǎn)偏高（pH6～7），在pH8.6時(shí)帶負(fù)電荷較少，且分子量較大，移動速度慢。在凝膠的電滲作用下，隨水流向負(fù)極。IgG3和IgG4泳向正極，而IgG1和IgG2因其帶電荷少，受電滲的作用力大于電泳，所以被水分子挾裹向負(fù)極移動。三、火箭免疫電泳個(gè)形狀如火箭的不溶性復(fù)合物沉淀峰。，未達(dá)終點(diǎn)。作IgG定量時(shí)，因電滲呈紡錘狀，可用甲醛與IgG上的氨基結(jié)合（甲酰化負(fù)電荷，加快了電泳速度。四、免疫電泳區(qū)帶電泳技術(shù)將抗原在凝膠中電泳，分成肉平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清，置室溫18～24小時(shí)后免疫電泳為定性試驗(yàn)，目前主要應(yīng)用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常免疫球蛋白的識別與鑒定方面，例如多發(fā)性骨髓瘤患者血清在免疫電泳后，可觀察到異常的M蛋白沉淀弧。五、免疫固定電泳各種蛋白質(zhì)區(qū)帶電泳，將蛋白質(zhì)分離成不同區(qū)帶，然其上覆蓋抗血清后通過漂洗和染色，并與蛋白質(zhì)參考泳道對照分析，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進(jìn)行分型。本法可用于遷移率近似的蛋白和M蛋白的鑒定與分型，免疫球蛋白輕鏈，尿液中的本-周蛋白檢測及κ、λ分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢測及分型，鑒定游離輕鏈，補(bǔ)體裂解產(chǎn)物等。免疫固定電泳最大的優(yōu)勢是分辨率強(qiáng)，敏感度高，操作周期短，僅需數(shù)小時(shí)，結(jié)果易于分析。六、交叉免疫電泳將區(qū)帶電泳和火箭免疫電泳相結(jié)合的技術(shù)。定量白質(zhì)裂解產(chǎn)物和不正常片段等進(jìn)行定性分析。第五節(jié)沉淀反應(yīng)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用免疫濁度法主要用于血液、體液中蛋白質(zhì)的測定。穩(wěn)定性好，敏感度高（達(dá)ng/L），精確度高（CV＜5%），簡便快速，易于自動化，無放射性核素污染，適合于大批量標(biāo)本的檢測。血清中M（1～4題共用答案）A.帶現(xiàn)象B.前帶C.后帶D.等價(jià)帶E.拖尾現(xiàn)象沉淀反應(yīng)中抗原過量的現(xiàn)象稱為『正確答案』C沉淀反應(yīng)中抗體過量的現(xiàn)象稱為『正確答案』B沉淀反應(yīng)的反應(yīng)曲線中，抗原抗體分子比例合適的范圍稱為『正確答案』D沉淀反應(yīng)的反應(yīng)曲線中，抗原或抗體極度過剩而引起無沉淀物形成的現(xiàn)象稱為『正確答案』A過剩而引起無沉淀物形成的現(xiàn)象稱為帶現(xiàn)象。沉淀反應(yīng)的抗原是A.顆粒性抗原B.可溶性抗原C.半抗原D.超抗原E『正確答案』B『答案解析』沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在特定條件下發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。關(guān)于免疫濁度法測定錯誤的是A.反應(yīng)液中抗體過量B.反應(yīng)液中抗原過量C.反應(yīng)液中抗原、抗體比例合適D.常用聚乙二醇等增濁劑E.通常用磷酸鹽反應(yīng)液『正確答案』B抗原抗體的比例抗原過量IC分子小，抗體過量時(shí)，IC的形成隨著抗原遞增而增加，至抗原、抗體最適比例處達(dá)最高峰，這就是經(jīng)典的海德堡曲線理論。在反應(yīng)，如形成抗原過量則造成測定的準(zhǔn)確性降低。下列有關(guān)沉淀反應(yīng)第一階段的說法，錯誤的是A.抗原抗體的特異性結(jié)合BC.可用散射比濁測定反應(yīng)結(jié)果D.出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線或沉淀環(huán)E.肉眼見不到免疫復(fù)合物『正確答案』D能完成，如沉淀線、沉淀環(huán)。免疫沉淀反應(yīng)常用于顆粒性抗原檢測C.用于可溶性抗原的檢測D.不能用于定量檢測E.可不考慮抗原抗體的比例『正確答案』C用于可溶性抗原的檢測。A.需先將抗原混入瓊脂內(nèi)B.有試管法和平板法C.需先將抗體混入瓊脂內(nèi)D.可用于定量檢測E.抗原抗體的比例合適處形成沉淀環(huán)『正確答案』A體結(jié)合，則形成沉淀環(huán)。通過觀察雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的結(jié)果，不能解決的問題是A.是否存在相應(yīng)的抗原或抗體B.抗原和抗體相對含量的估計(jì)CDE.抗體濃度的確定『正確答案』E『答案解析』雙向擴(kuò)散試驗(yàn)?zāi)芙鉀Q的問題：1.抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計(jì)2.抗原或抗體相對分子量的分析3.抗原性質(zhì)的分析4.抗體效價(jià)的滴定5.抗原或抗體純度鑒定。免疫電泳的影響因素不包括A.電場強(qiáng)度B.溶液pHC.離子強(qiáng)度D.抗體純度E.電滲『正確答案』D『答案解析』免疫電泳的影響因素不包括抗體純度。單向擴(kuò)散試驗(yàn)時(shí)錯誤的是AB.每次測定必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線CD.將抗原加入所打的孔中E.24～48『正確答案』C『答案解析』單向擴(kuò)散試驗(yàn)影響因素12.34.注意雙環(huán)現(xiàn)象（出現(xiàn)了兩種抗原性相同成分）C雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)中，若抗原的含量比抗體多且分子量比抗體小，則沉淀線應(yīng)為A.靠近抗原孔，且弧線彎向抗原側(cè)B.靠近抗原孔，且弧線彎向抗體側(cè)C.靠近抗體孔，且弧線彎向抗原側(cè)D.靠近抗體孔，且弧線彎向抗體側(cè)E.居于抗原抗體孔中間，且弧線彎向抗原側(cè)『正確答案』D抗原或抗體的存在與否以及相對含量的估計(jì)沉淀線靠近抗體孔，不出現(xiàn)沉淀線則無對應(yīng)的抗體（抗原）2量的分析（1）分子量小者擴(kuò)散快，反之則較慢。由于慢者擴(kuò)散圈小，局部濃度則較大，形成的沉淀線彎向分子量大的一方；如果兩者分子量大致相等，則形成直線。雙擴(kuò)平板法測量兩種不相關(guān)成分的抗原時(shí)，沉淀線A.二條直線相交叉BCD.二條弧線不連接E.二條直線平行『正確答案』A抗原性質(zhì)的分析兩條沉淀線互相吻合相連，表明抗體與兩個(gè)抗原中兩條沉淀線交叉而過，說明兩個(gè)抗原完全不同。雙擴(kuò)平板法出現(xiàn)多條沉淀線的原因是A.抗原過剩B.抗體過剩C.抗原缺乏D.抗體缺乏E.抗原或抗體不純『正確答案』E『答案解析』雙擴(kuò)平板法抗原或抗體純度鑒定：用混合抗