人類基因組計劃與基因測序

關(guān)于人類基因組計劃與基因測序第一頁，共三十九頁，2022年，8月28日人類基因組計劃基因測序基因組概述第二頁，共三十九頁，2022年，8月28日基因組概述DNA基因基因組第三頁，共三十九頁，2022年，8月28日DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)——里程碑1953年，沃森和克里克提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),標志著生物科學(xué)的發(fā)展進入了分子生物學(xué)階段，使遺傳的研究深入到分子層次,“生命之謎”被打開,人們清楚地了解遺傳信息的構(gòu)成和傳遞的途徑。第四頁，共三十九頁，2022年，8月28日基因——控制生物性狀的基本遺傳單位?；颍╣ene）：帶有遺傳訊息的DNA片段稱為基因。結(jié)構(gòu)基因

外顯子（編碼序列)

內(nèi)含子（非編碼序列)非結(jié)構(gòu)基因

順式作用元件啟動子上游啟動子元件反應(yīng)元件增強子沉默子Poly(A)加尾信號

反式作用因子基因分類第五頁，共三十九頁，2022年，8月28日基因組——完整的單倍體序列基因組（Genome）：指單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子。人類基因組（人類基因體）：是指人的基因組，由23對染色體組成，其中包括22對體染色體、1條X染色體和1條Y染色體。人類只有一個基因組，大約有2-3萬個基因。人類基因組含有約30億個DNA堿基對，第六頁，共三十九頁，2022年，8月28日人類基因組計劃人類基因組計劃概述目的與意義《人種自傳23章》遺傳圖譜第七頁，共三十九頁，2022年，8月28日人類基因組計劃——概述人類基因組計劃(humangenomeproject,HGP)：是由美國科學(xué)家于1985年率先提出，于1990年正式啟動的。美國、英國、法國、德國、日本和我國科學(xué)家共同參與了這一預(yù)算達30億美元的人類基因組計劃。意義：人類基因組計劃與曼哈頓原子彈計劃和阿波羅計劃并稱為三大科學(xué)計劃。被譽為生命科學(xué)的“登月計劃”。中國：中國于1999年9月積極參加到這項研究計劃中的，承擔(dān)其中1%的任務(wù)，即人類3號染色體短臂上約3000萬個堿基對的測序任務(wù)。中國因此成為參加這項研究計劃的唯一的發(fā)展中國家。第八頁，共三十九頁，2022年，8月28日人類基因組計劃——概述目的：揭開組成人體2.5萬個基因的30億個堿基對的秘密；方法：要發(fā)現(xiàn)所有的人類基因，找出它們在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息，同時繪制出人類基因的圖譜。結(jié)果：2001年人類基因組工作草圖的發(fā)表（由公共基金資助的國際人類基因組計劃和私人企業(yè)塞雷拉基因組公司各自獨立完成，并分別公開發(fā)表）被認為是人類基因組計劃成功的里程碑。截止到2005年，人類基因組計劃的測序工作已經(jīng)完成。意義：解碼生命、了解生命的起源、了解生命體生長發(fā)育的規(guī)律、認識種屬之間和個體之間存在差異的起因、認識疾病產(chǎn)生的機制以及長壽與衰老等生命現(xiàn)象、為疾病的診治提供科學(xué)依據(jù)。第九頁，共三十九頁，2022年，8月28日1號染色體——生命。講生命的誕生，來源。2號染色體——物種。人類發(fā)展和近親之間的分別。3號染色體——歷史。孟德爾以及其他科學(xué)家在遺傳學(xué)上做出的貢獻。4號染色體——命運。你的命運完全在你的基因里。5號染色體——環(huán)境。推翻讓讀者覺得基因是簡單的分割開來的。6號染色體——智慧?；虻拇嬖诓皇菫榱酥虏〉?號染色體——本能。解釋行為遺傳學(xué)和進化心理學(xué)結(jié)論對人類的影響。8號染色體和9號染色體——X和Y染色體——沖突。性染色體，同性戀是否遺傳。8號染色體——自身利益?；蚪M97%都不是真正的基因?；蛑讣y測試技術(shù)。9號染色體——疾病。解釋了血型的不同以及基因?qū)膊〉牡挚沽Α?0號染色體——壓力。外部事件對基因的影響。11號染色體——個性。性格的天生以及后天對性格的影響。12號染色體——自我組裝?；蚴蔷幹坪玫囊贿B串程序，自我運行功能。13號染色體——史前。你知道你為什么能消化牛奶?你祖宗幾千里以前就學(xué)會了“偷奶”。14號染色體——永生。壽命長短實在不好說。萬一哪個基因調(diào)皮一下，你就掛了。15號染色體——性別。你出生真不是自個兒決定的事，是男是女，你爸媽也沒法決定。16號染色體——記憶。想知道為嘛你記東西老是學(xué)完就忘么。17號染色體——死亡。癌癥啊!癌癥啊!18號染色體——歷史。基因工程這玩意兒。19號染色體——預(yù)防。你又想知道，你又不想知道。20號染色體——政治。無知導(dǎo)致的悲劇。21號染色體——優(yōu)化人種論。優(yōu)化人種的歷史和現(xiàn)在遺留下來的歧視。22號染色體——自由意志。休謨之叉：我們的行為要么是事先已經(jīng)被決定了的，這樣我們就不必為它們負責(zé);要么是偶然事件的結(jié)果，這樣我們也不必為它們負責(zé)。人種自傳23章第十頁，共三十九頁，2022年，8月28日人類基因組計劃——四大遺傳圖譜

轉(zhuǎn)錄圖譜遺傳圖譜物理圖譜序列圖譜第十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日遺傳圖譜：又稱連鎖圖譜（linkagemap），它是以具有遺傳多態(tài)性（在一個遺傳位點上具有一個以上的等位基因，在群體中的出現(xiàn)頻率皆高于1%）的遺傳標記為“路標”，以遺傳學(xué)距離（在減數(shù)分裂事件中兩個位點之間進行交換、重組的百分率，1%的重組率稱為1cM）為圖距的基因組圖。第十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日物理圖譜：是利用限制性內(nèi)切酶將染色體切成片段，再根據(jù)重疊序列確定片段間連接順序，以及遺傳標志之間物理距離堿基對(bp)或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)的圖譜。第十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日序列圖譜（sequencemap）：序列分析采用一個區(qū)域的DNA序列重疊群使測序工作不斷延伸，使用其中的序列標記位點STS作為兩個片段間的重疊區(qū)域，使分別被測序的短序列進行正確的拼接，最后獲得DNA全序列圖譜。第十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄圖譜（transcriptomemap）：是在識別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達模式等信息的圖譜。在人類基因組中鑒別出占具2%~5%長度的全部基因的位置、結(jié)構(gòu)與功能，最主要的方法是通過基因的表達產(chǎn)物mRNA反追到染色體的位置。第十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日基因測序——觸手可及第十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日測序技術(shù)DNA測序：是對DNA分子的一級結(jié)構(gòu)的分析。意義：分析基因組核苷酸排列序列分析基因序列基因定點誘變的基礎(chǔ)基因工程載體構(gòu)建中DNA序列定位和排序的基礎(chǔ)確定DNA序列中蛋白質(zhì)的編碼區(qū)歷程：第一代測序技術(shù)：雙脫氧鏈終止法、化學(xué)降解法第二代測序技術(shù)：焦磷酸測序、連接酶測序第三代測序技術(shù)：單分子熒光測序第四代測序技術(shù)：納米孔測序第十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日測序技術(shù)——發(fā)展歷程第十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日第一代測序技術(shù)第一代測序技術(shù)的主要特點：優(yōu)點：測序讀長可達1000bp，準確性高達99.999%，從頭測序，從頭組裝缺點：測序成本高，通量低，難以大規(guī)模的應(yīng)用第十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日第一代測序技術(shù)——雙脫氧鏈末端終止法原理：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)，在4個DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列缺點：1、測定步驟繁瑣。一個步驟重復(fù)四次，因此需要大量相同的DNA

拷貝，樣本需求量大；2、不能測定太長的DNA

序列。意義：Sanger測定了第一個基因組序列，是噬菌體X174的，全長5375個堿基。自此，人類獲得了窺探生命遺傳差異本質(zhì)的能力，并以此為開端步入基因組學(xué)時代。在2001年，完成的首個人類基因組圖譜就是以改進了的Sanger法為其測序基礎(chǔ)。第二十頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日第一代測序技術(shù)——化學(xué)降解測序法原理：先對待測DNA末端進行放射性標記，再通過4-5組相互獨立的化學(xué)反應(yīng)分別得到部分降解產(chǎn)物，其中每一組反應(yīng)特異性地針對某一種或某一類堿基進行切割。因此，產(chǎn)生4-5組不同長度的放射性標記的DNA片段，每組中的每個片段都有放射性標記的共同起點，但長度取決于該組反應(yīng)針對的堿基在原樣品DNA分子上的位置。此后各組反應(yīng)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，通過放射自顯影檢測末端標記的分子，并直接讀取待測DNA片段的核苷酸序列。第二十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術(shù)特點：大大降低了測序成本的同時，大幅提高了測序速度，持了高準確性，序列讀長方面起第一代測序技術(shù)則要短很多。第二十三頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術(shù)——Roche454測序系統(tǒng)DNA文庫制備：

利用噴霧法將待測DNA打斷成300-800bp長的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎yDNA變性后用雜交引物進行PCR擴增，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫。第二十四頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術(shù)——Roche454測序系統(tǒng)EmulsionPCR（乳液PCR，其實是一個注水到油的獨特過程）：

將這些單鏈DNA結(jié)合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。乳液PCR最大的特點是可以形成數(shù)目龐大的獨立反應(yīng)空間以進行DNA擴增。第二十五頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術(shù)——Roche454測序系統(tǒng)焦磷酸測序：

測序反應(yīng)以磁珠上大量擴增出的單鏈DNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進行合成反應(yīng)。如果dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團。釋放的焦磷酸基團會與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光，同時由PTP板另一側(cè)的CCD照相機記錄，最后通過計算機進行光信號處理而獲得最終的測序結(jié)果。第二十六頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術(shù)——Illumina邊合成邊測序過程：DNA待測文庫構(gòu)建：超聲波打斷為200-500bp序列片段，并添加接頭；Flowcell，吸附流動DNA片段橋式PCR擴增與變性：堿基的信號強度放大測序：原理同Sanger第二十七頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術(shù)——Solid技術(shù)DNA文庫構(gòu)建：片段打斷并在兩端加上測序接頭，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫。EmulsionPCR：小水滴emulsionPCR，微珠只有1um。在擴增的同時對擴增產(chǎn)物的3’端進行修飾，這是為下一步的測序過程作的準備。3’修飾的微珠會被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個、4個或8個測序區(qū)域。第二十八頁，共三十九頁，2022年，8月28日第二代測序技術(shù)——Solid技術(shù)連接酶測序：沒有采用DNA聚合酶，而采用了連接酶。其底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，將其表示為：3’-XXnnnzzz-5’。探針的5’末端分別標記了CY5、TexasRed、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料。這個8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標記。這是Solid的獨特測序法，兩個堿基確定一個熒光信號，相當(dāng)于一次能決定兩個堿基。這種測序方法也稱之為兩堿基測序法。第二十九頁，共三十九頁，2022年，8月28日第三代測序技術(shù)——單分子測序技術(shù)案例：PacificBiosciences公司RS系統(tǒng)特點：

不需要PCR擴展，消除了潛在的擴展錯誤和不均勻?？梢灾苯娱喿xRNA的序列。例如：Helicos直接使用RNA反轉(zhuǎn)錄酶，邊RNA反轉(zhuǎn)錄合成邊測序。

可以直接閱讀包括甲基化在內(nèi)的DNA修飾。例如：Pacbio使用甲基化和非甲基化堿基的合成速率上的差異來進行區(qū)分。

讀長更長。PacBio系統(tǒng)可以測到1000bp以上。速度更快。第三十頁，共三十九頁，2022年，8月28日第三代測序技術(shù)——PacBioSMRT技術(shù)原理：對零模波導(dǎo)中的單個熒光分子進行高靈敏度檢測，從而快速獲得DNA序列信息。DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標記4種堿基（即是dNTP）,在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發(fā)出不同光,根據(jù)光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。同時這個DNA聚合酶是實現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關(guān),它主要受激光對其造成的損傷所影響。第三十一頁，共三十九頁，2022年，8月28日第四代測序技術(shù)——納米孔測序技術(shù)原理：分子在通過納米孔道時，會對通過納米孔的電流，或橫穿過納米孔的電流（隧穿電流）產(chǎn)生影響，而每種不同的分子通過時，對電流產(chǎn)生的影響具有可區(qū)別的差異。于是利用這種差異，納米孔測序技術(shù)就可以識別基因中堿基（對）的排列順序。第三十二頁，共三十九頁，2022年，8月28日第四代測序技術(shù)——納米孔測序技術(shù)特點：物理方法，無需生物化學(xué)預(yù)處理，直接對DNA進行讀取；真正實現(xiàn)單分子檢測和電子傳導(dǎo)檢測相結(jié)合的測序方法；完全擺脫了洗脫過程、PCR擴增過程；成本低廉：最有希望實現(xiàn)1000美元基因組甚至100美元基因組的技術(shù)，超高讀長；高通量；易集成，小型化；速度快，測序時間更少；數(shù)據(jù)分析更為簡單；實現(xiàn)