微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇課件

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇1二.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)路線三.提高內(nèi)生菌紫杉醇的產(chǎn)量的方法一、紫杉醇的概況和作用機制二.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)路線三.提高內(nèi)生菌紫杉醇的產(chǎn)2紅豆杉樹一、紫杉醇的概況和作用機制紅豆杉樹一、紫杉醇的概況和作用機制3微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇課件4紫杉醇（Paclitaxel,商品名Taxol）的概述：1963年美國化學(xué)家瓦尼（M.C.Wani）和沃爾（MonreE.Wall）首次從一種生長在美國西部大森林中稱謂太平洋杉（PacificYew）樹皮和木材中分離到了紫杉醇的粗提物。1971年Wall和Wani將粗提物進行純化，并確定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)（一種四環(huán)二萜化合物，并把它命名為紫杉醇（taxol））。2001年HuangQ等通過實驗獲得紫杉醇生物合成的重要中間產(chǎn)物紫杉二烯(Taxadiene,產(chǎn)量達13mg/L),成為基因工程菌合成紫杉醇中間體的先例。紫杉醇發(fā)現(xiàn)到臨床應(yīng)用大約經(jīng)歷了30年的時間。紫杉醇（Paclitaxel,商品名Taxol）的概述：195注：紫杉醇是一種復(fù)雜的具有抗癌活性的三環(huán)二萜類生物堿。注：紫杉醇是一種復(fù)雜的具有抗癌活性的三環(huán)二萜類生物堿。6微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇課件7微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇課件8二微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)路線實驗材料羅漢松的樹皮實驗方法1內(nèi)生真菌分離2內(nèi)生真菌純化、鑒定與保存3發(fā)酵培養(yǎng)4發(fā)酵產(chǎn)物的處理（紫杉醇的提取、純化、含量測定）二微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)路線實驗材料1內(nèi)生真菌分離91內(nèi)生真菌分離1）對植物組織表面進行消毒,以控制表生真菌的生長,使內(nèi)生真菌得以分離。其分離方法是先用水沖洗已剪碎的植物材料,然后在75%乙醇中浸泡3min后,最后用無菌水沖洗。2）分離所用的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。為了防止細菌污染可在培養(yǎng)基中加抗菌素,如鏈霉素、四環(huán)素等。溫箱中28℃培養(yǎng)3-4d后觀察.在分離內(nèi)生真菌時常添加一些宿主植物的提取液，以滿足內(nèi)生真菌的一些特殊的營養(yǎng)需求1內(nèi)生真菌分離1）對植物組織表面進行消毒,以控制表生真菌10

2內(nèi)生真菌純化、鑒定與保存

待培養(yǎng)基上初步長出菌落后，選擇長勢較好的菌落，挑取菌絲到PDA平板上純化，根據(jù)經(jīng)典形態(tài)學(xué)方法鑒定菌種。純化的菌株在PDA斜面4℃下保持，備用。

2內(nèi)生真菌純化、鑒定與保存

待培養(yǎng)基上初步長出菌落后，選113發(fā)酵培養(yǎng)從PDA平板上切取5mm×5mm小塊菌落,接種至裝有150mL液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,于28℃,100r/min搖床上振蕩培養(yǎng)10-14d.3發(fā)酵培養(yǎng)124發(fā)酵產(chǎn)物的處理

1）紫杉醇的提取常用的有機溶劑：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等提取原則：能夠充分萃取出發(fā)酵液和菌絲中的紫杉醇具體方法：4發(fā)酵產(chǎn)物的處理1）紫杉醇的提取13發(fā)酵液過濾后,菌絲研磨（加適量石英砂），濾液稱量體積。濾渣烘干(低于50℃),濾渣用適量乙酸乙酯萃取,濾液用1/2濾液體積的乙酸乙酯萃取(30min),下層水層再用乙酸乙酯萃取一次,合并乙酸乙酯,減壓蒸餾。用適量甲醇洗滌減壓蒸餾得到的固體,再用正己烷洗滌15min,收集下層甲醇,加入乙酸乙酯和水(1：1)進行萃取(30min),將收集的乙酸乙酯進行減壓蒸餾,用一定量的乙腈洗下固體,0℃密封保存。發(fā)酵液過濾后,菌絲研磨（加適量石英砂），濾液稱量體積。142）紫杉醇的純化紫杉醇的純化多采用色譜法。已報道的用于紫杉醇分離的方法除薄層色譜法、柱層析法外還有膠束電動毛細管色譜法、高速逆流色譜法、樹脂吸附分離法、膜分離法、沉淀法、化學(xué)反應(yīng)法和藥理作用靶點法。3）紫杉醇含量測定

真菌發(fā)酵液中紫杉醇的定量可采用薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、UV免疫分析、生物學(xué)方法和放射性前體標(biāo)記等。2）紫杉醇的純化15高效液相色譜(HPLC)

HPLC是最常用的、較為有效的分析檢測方法。HPLC不僅可以測定紫杉醇含量,而且還能追蹤分離紫杉醇。色譜條件：惠普1100系列，采用XDB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相為甲醇與水混合物(V甲醇:V水=65:35)，柱溫為25℃，波長為227nm，流速1.0mL/min，進樣量10μL。用紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品做對照。高效液相色譜(HPLC)HPLC是最常用的、較為有效的16預(yù)期結(jié)果從羅漢松樹皮中成功篩選出一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌株。預(yù)期結(jié)果17微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的優(yōu)勢內(nèi)生真菌能在簡單的培養(yǎng)基上良好生長產(chǎn)生大量的發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵周期短可以在生物反應(yīng)器中人為控制各種參數(shù)可通過誘變育種等手段來提高菌種性能，以提高紫杉醇產(chǎn)量微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的優(yōu)勢內(nèi)生真菌能在簡單的培養(yǎng)基上良好生18微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇

面臨的困境（1）缺乏良好的適合發(fā)酵的工業(yè)菌株（2）由于發(fā)酵條件的限制，單位培養(yǎng)液中紫杉醇的含量低微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇

面臨的困境19三提高內(nèi)生菌紫杉醇的產(chǎn)量的方法（一）改良菌種1.利用常規(guī)的誘變改良菌種2.利用原生質(zhì)體融合改良菌種3.利用基因工程構(gòu)建工程菌分離紫杉醇合成代謝酶類和獲得它們的cDNA克隆，將已經(jīng)構(gòu)建的攜帶紫杉醇合成途徑關(guān)鍵酶基因的真菌表達載體轉(zhuǎn)入高產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌中，獲得高產(chǎn)紫杉醇工程菌株三提高內(nèi)生菌紫杉醇的產(chǎn)量的方法（一）改良菌種20（二）優(yōu)化發(fā)酵條件1.培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化依據(jù)不同產(chǎn)紫杉醇真菌的生長條件，選擇合適的培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)最佳發(fā)酵條件，以期提高紫杉醇的產(chǎn)量2.添加紫杉醇合成的前體物質(zhì)加入前體一方面可通過增加底物量來加快反應(yīng)速度和提高產(chǎn)率，另一方面還能夠反饋抑制分支路徑而促進反應(yīng)順利進行，有效提高紫杉醇產(chǎn)量。如：鈉不僅能摻入到乙?；?，而且能摻入到苯環(huán)及紫杉烷骨架中，是紫杉醇合成的有效前體（二）優(yōu)化發(fā)酵條件1.培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化21（二）優(yōu)化發(fā)酵條件3.添加代謝產(chǎn)物的抑制劑真菌的次生代謝產(chǎn)物十分豐富，估計有3,000多種，如果研究清楚紫杉醇與其他次生代謝物之間合成關(guān)系，對人為抑制其他次級代謝物的合成，能有效促進紫杉醇的生物合成量4.添加誘導(dǎo)物誘導(dǎo)子是一類可以引起代謝途徑改變或強度改變的物質(zhì)，包括植物激素、無機離子、多糖、真菌培養(yǎng)物等（二）優(yōu)化發(fā)酵條件3.添加代謝產(chǎn)物的抑制劑22（三）與“前提內(nèi)生真菌”一起培養(yǎng)

如產(chǎn)紫杉醇合成前體10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III的內(nèi)生真菌（三）與“前提內(nèi)生真菌”一起培養(yǎng)23謝謝！謝謝！24微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇25二.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)路線三.提高內(nèi)生菌紫杉醇的產(chǎn)量的方法一、紫杉醇的概況和作用機制二.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)路線三.提高內(nèi)生菌紫杉醇的產(chǎn)26紅豆杉樹一、紫杉醇的概況和作用機制紅豆杉樹一、紫杉醇的概況和作用機制27微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇課件28紫杉醇（Paclitaxel,商品名Taxol）的概述：1963年美國化學(xué)家瓦尼（M.C.Wani）和沃爾（MonreE.Wall）首次從一種生長在美國西部大森林中稱謂太平洋杉（PacificYew）樹皮和木材中分離到了紫杉醇的粗提物。1971年Wall和Wani將粗提物進行純化，并確定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)（一種四環(huán)二萜化合物，并把它命名為紫杉醇（taxol））。2001年HuangQ等通過實驗獲得紫杉醇生物合成的重要中間產(chǎn)物紫杉二烯(Taxadiene,產(chǎn)量達13mg/L),成為基因工程菌合成紫杉醇中間體的先例。紫杉醇發(fā)現(xiàn)到臨床應(yīng)用大約經(jīng)歷了30年的時間。紫杉醇（Paclitaxel,商品名Taxol）的概述：1929注：紫杉醇是一種復(fù)雜的具有抗癌活性的三環(huán)二萜類生物堿。注：紫杉醇是一種復(fù)雜的具有抗癌活性的三環(huán)二萜類生物堿。30微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇課件31微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇課件32二微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)路線實驗材料羅漢松的樹皮實驗方法1內(nèi)生真菌分離2內(nèi)生真菌純化、鑒定與保存3發(fā)酵培養(yǎng)4發(fā)酵產(chǎn)物的處理（紫杉醇的提取、純化、含量測定）二微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)路線實驗材料1內(nèi)生真菌分離331內(nèi)生真菌分離1）對植物組織表面進行消毒,以控制表生真菌的生長,使內(nèi)生真菌得以分離。其分離方法是先用水沖洗已剪碎的植物材料,然后在75%乙醇中浸泡3min后,最后用無菌水沖洗。2）分離所用的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。為了防止細菌污染可在培養(yǎng)基中加抗菌素,如鏈霉素、四環(huán)素等。溫箱中28℃培養(yǎng)3-4d后觀察.在分離內(nèi)生真菌時常添加一些宿主植物的提取液，以滿足內(nèi)生真菌的一些特殊的營養(yǎng)需求1內(nèi)生真菌分離1）對植物組織表面進行消毒,以控制表生真菌34

2內(nèi)生真菌純化、鑒定與保存

待培養(yǎng)基上初步長出菌落后，選擇長勢較好的菌落，挑取菌絲到PDA平板上純化，根據(jù)經(jīng)典形態(tài)學(xué)方法鑒定菌種。純化的菌株在PDA斜面4℃下保持，備用。

2內(nèi)生真菌純化、鑒定與保存

待培養(yǎng)基上初步長出菌落后，選353發(fā)酵培養(yǎng)從PDA平板上切取5mm×5mm小塊菌落,接種至裝有150mL液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,于28℃,100r/min搖床上振蕩培養(yǎng)10-14d.3發(fā)酵培養(yǎng)364發(fā)酵產(chǎn)物的處理

1）紫杉醇的提取常用的有機溶劑：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等提取原則：能夠充分萃取出發(fā)酵液和菌絲中的紫杉醇具體方法：4發(fā)酵產(chǎn)物的處理1）紫杉醇的提取37發(fā)酵液過濾后,菌絲研磨（加適量石英砂），濾液稱量體積。濾渣烘干(低于50℃),濾渣用適量乙酸乙酯萃取,濾液用1/2濾液體積的乙酸乙酯萃取(30min),下層水層再用乙酸乙酯萃取一次,合并乙酸乙酯,減壓蒸餾。用適量甲醇洗滌減壓蒸餾得到的固體,再用正己烷洗滌15min,收集下層甲醇,加入乙酸乙酯和水(1：1)進行萃取(30min),將收集的乙酸乙酯進行減壓蒸餾,用一定量的乙腈洗下固體,0℃密封保存。發(fā)酵液過濾后,菌絲研磨（加適量石英砂），濾液稱量體積。382）紫杉醇的純化紫杉醇的純化多采用色譜法。已報道的用于紫杉醇分離的方法除薄層色譜法、柱層析法外還有膠束電動毛細管色譜法、高速逆流色譜法、樹脂吸附分離法、膜分離法、沉淀法、化學(xué)反應(yīng)法和藥理作用靶點法。3）紫杉醇含量測定

真菌發(fā)酵液中紫杉醇的定量可采用薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、UV免疫分析、生物學(xué)方法和放射性前體標(biāo)記等。2）紫杉醇的純化39高效液相色譜(HPLC)

HPLC是最常用的、較為有效的分析檢測方法。HPLC不僅可以測定紫杉醇含量,而且還能追蹤分離紫杉醇。色譜條件：惠普1100系列，采用XDB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相為甲醇與水混合物(V甲醇:V水=65:35)，柱溫為25℃，波長為227nm，流速1.0mL/min，進樣量10μL。用紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品做對照。高效液相色譜(HPLC)HPLC是最常用的、較為有效的40預(yù)期結(jié)果從羅漢松樹皮中成功篩選出一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌菌株。預(yù)期結(jié)果41微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的優(yōu)勢內(nèi)生真菌能在簡單的培養(yǎng)基上良好生長產(chǎn)生大量的發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)酵周期短可以在生物反應(yīng)器中人為控制各種參數(shù)可通過誘變育種等手段來提高菌種性能，以提高紫杉醇產(chǎn)量微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的優(yōu)勢內(nèi)生真菌能在簡單的培養(yǎng)基上良好生42微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇

面臨的困境（1）缺乏良好的適合發(fā)酵的工業(yè)菌株（2）由于發(fā)酵條件的限制，單位培養(yǎng)液中紫杉醇的含量低微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇

面臨的困境43三提高內(nèi)生菌紫杉醇的產(chǎn)量的方法（一）改良菌種1.利用常規(guī)的誘變改良菌種2.利用原生質(zhì)體融合改良菌種3.利用基因工程構(gòu)建工程菌分離紫杉醇合成代謝酶類和獲得它們的cDNA克隆，將已經(jīng)構(gòu)建的攜帶紫杉醇合成途徑關(guān)鍵酶基因的真菌表達載體轉(zhuǎn)入高產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌中，獲得高產(chǎn)紫杉醇工程菌株三提高內(nèi)生菌紫杉醇的產(chǎn)量的方法（一）