順烏頭酸酶（ACO）活性檢測(cè)試劑盒說明書-紫外分光光度法UPLC-MS-4326

電話：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網(wǎng)址：本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用！請(qǐng)勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測(cè)等用途！-上海液質(zhì)檢測(cè)技術(shù)有限公司第第頁(yè)順烏頭酸酶（ACO）活性檢測(cè)試劑盒說明書貨號(hào)：UPLC-MS-4326規(guī)格：50T/48S

紫外分光光度法產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系工作人員。試劑名稱規(guī)格保存條件試劑一液體80mL×1瓶2-8℃保存試劑二液體35mL×1瓶2-8℃保存試劑三液體0.6mL×2支-20℃保存試劑四液體50mL×1瓶2-8℃保存溶液的配制：1、試劑三：易揮發(fā)試劑，使用后盡快擰緊蓋子，密封后放入-20℃保存；產(chǎn)品說明：順烏頭酸酶（Aconitase,ACO）是細(xì)胞內(nèi)一種重要的鐵硫蛋白酶，主要存在于胞漿與線粒體中。ACO催化細(xì)胞內(nèi)檸檬酸經(jīng)中間產(chǎn)物順烏頭酸生成異檸檬酸的可逆反應(yīng)，對(duì)維持三羧酸循環(huán)及乙醛酸循環(huán)的順利進(jìn)行起著重要作用。順烏頭酸酶催化異檸檬酸生成順烏頭酸，順烏頭酸在240nm有特征吸收峰，通過檢測(cè)順烏頭酸的產(chǎn)生速率來計(jì)算該酶活性。ACOIsocitricAcid CIS-Aconitate(240nm)注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計(jì)、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、超聲波細(xì)胞破碎儀、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。操作步驟：一、順烏頭酸酶的提?。蛇m當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）A、總順烏頭酸酶的提取0.1g500（細(xì)菌1mL10μL300W3915次），4℃，11000×g（Cpr1）測(cè)定總順烏頭酸酶活性（建議將樣本用蒸餾水稀釋4-10倍后檢測(cè)）。B、胞漿與線粒體順烏頭酸酶的提取0.3g15001.5mL15μL試劑三，用勻漿器或研缽于冰上勻漿。4℃，600×g5min。（Cpr2）將上清液移至另一離心管中，4℃，11000×g15min。上清液即胞漿提取物，用于測(cè)定胞漿中的順烏頭酸酶活性（4-10倍后檢測(cè)）。600μL6μL（3915次），4℃，5000×g2min，取上清置于冰上待測(cè)。用于測(cè)定線粒體中順烏頭酸酶活性（4-10倍后檢測(cè)）。注意：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇性提取細(xì)胞總順烏頭酸酶、胞漿烏頭酸酶或線粒體烏頭酸酶。二、測(cè)定步驟紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至240nm，蒸餾水調(diào)零。樣本測(cè)定25℃15min以上；1mL石英比色皿中分別加入：試劑名稱（μL）測(cè)定管工作液900樣本100240nm10s25℃5min5min10sA2ΔA=A2-A1。三、順烏頭酸酶活性的計(jì)算1、總順烏頭酸酶活性計(jì)算：按樣本蛋白濃度計(jì)算酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個(gè)酶活力單位。ACO酶活(U/mgprot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×106]÷(V樣×Cpr1)÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr1×N按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個(gè)酶活力單位。ACO酶活(U/g質(zhì)量)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×106]÷(V樣÷V提取×W）÷T×N=561.11×ΔA÷W×N按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算1041nmolACO酶活(U/104cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×106]÷(V樣÷V提取×細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè)))÷T×N=561.11×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè))×NV反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3L；ε：順烏頭酸消光系數(shù)，3.6L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mmol=1×106nmol；N：稀釋倍數(shù)；W：樣本質(zhì)量，g。2、胞漿順烏頭酸酶活性計(jì)算：按樣本蛋白濃度計(jì)算酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個(gè)酶活力單位。ACO酶活(U/mgprot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×106]÷(V樣×Cpr2)÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個(gè)酶活力單位。ACO酶活(U/g質(zhì)量)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×106]÷(V樣÷V提取×W）÷T×N=841.67×ΔA÷W×N按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算1041nmolO酶活(U104cel)=[ΔA×V反總÷（×d）×106]÷（V樣÷V提取×細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）÷T×N=841.67×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）×NV反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3L；ε：順烏頭酸消光系數(shù)，3.6L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：106：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mmol=1×106nmol；N：稀釋倍數(shù)；W：樣本質(zhì)量，g。3、線粒體順烏頭酸酶活性計(jì)算：按樣本蛋白濃度計(jì)算酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個(gè)酶活力單位。ACO酶活(U/mgprot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×106]÷(V樣×Cpr2)÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘凈生產(chǎn)1nmol順烏頭酸定義為一個(gè)酶活力單位。ACO酶活(U/g質(zhì)量)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×106]÷(V樣÷V樣總×W）÷T×N=336.67×ΔA÷W×N按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算1041nmolO酶活(U104cel)=[ΔA×V反總÷（×d）×106]÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）÷T×N=336.67×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)）×NV反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3L；ε：順烏頭酸消光系數(shù)，3.6L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：106：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mmol=1×106nmol；N：稀釋倍數(shù)