課題3血紅蛋白的提取和分離教學設(shè)計教案

教學準備1.教學目標1、嘗試從血液中提取與別離血紅蛋白2、了解色譜法、電泳法等別離生物大分子的根本原理2.教學重點/難點教學重點：凝膠色譜法的原理與方法教學難點：樣品的預處理；色譜柱填料的處理與色譜柱的裝填3.教學用具教學課件4.標簽教學過程〔一〕引入新課蛋白質(zhì)的知識回憶：含量：占細胞干重的50％以上，是細胞中含量最多的有機化合物。2、組成元素：C、H、O、N3、根本單位：氨基酸4、分子構(gòu)造：氨基酸—多肽—蛋白質(zhì)第1頁肽鍵：—CO—NH—5、相對分子質(zhì)量：高分子化合物蛋白質(zhì)是生命活動的主要承當者，是細胞內(nèi)含量最高的有機化合物。對蛋白質(zhì)的研究有助于人們對生命過程的認識與理解。所以需要從細胞中提取蛋白質(zhì)進展研究。怎樣提取蛋白質(zhì)呢？〔二〕蛋白質(zhì)分子的差異性1．根底知識蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)與多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親與力等千差萬別，由此提取與別離各種蛋白質(zhì)。1．1凝膠色譜法〔分配色譜法〕：〔1〕原理：〔見課件圖〕分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢?！?〕凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖?！?〕別離過程：混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子＊洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。1．2緩沖溶液〔1〕原理：由弱酸與相應(yīng)的強堿弱酸鹽組成〔如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等〕，調(diào)節(jié)酸與鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液?！?〕緩沖液作用：抵抗外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。第2頁

1．3凝膠電泳法：〔1〕原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀與大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向與運動速度不同。［思考］閱讀投影補充材料后，填寫下表：〔2〕別離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺經(jīng)膠電泳等。〔3〕別離過程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團帶上正電或負電；參加帶負電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)－SDS復合物〞，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。例：聚丙烯酰胺凝膠電泳1、在測定蛋白質(zhì)分子量時常用十二烷基硫酸鈉〔SDS〕—聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺與交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑與催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀構(gòu)造的凝膠。2.原理：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素?！睸DS的作用〕為了消除凈電荷對遷移率的影響，可以在凝膠中參加SDS。3.SDS作用機理:SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子的大小?！踩?、血紅蛋白的提取與別離實驗設(shè)計蛋白質(zhì)的提取與別離一般分為哪些根本步驟？樣品處理、粗別離、純化、純度鑒定。第3頁

思考：是否所有種類的蛋白質(zhì)的提取與別離都是這樣的？為什么？不是。因為蛋白質(zhì)的來源與性質(zhì)不同，別離方法差異很大。選擇實驗材料〔1〕你認為鳥類血液與哺乳動物血液中，最好哪種血液來提取血紅蛋白？為什么？哺乳動物血液。因為該細胞中沒有細胞核，血紅蛋白含量高?！?〕請閱讀投影資料，認識哺乳動物血液組成及血紅蛋白性質(zhì)。并思考答復以下問題：血液由血漿與血細胞兩局部組成。血細胞中紅細胞細胞數(shù)量最多，細胞的含量最高的化合物是血紅蛋白。該化合物是由兩個α－肽鏈、兩個β－肽鏈與四個亞鐵紅素基團構(gòu)成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2與CO2結(jié)合的亞鐵紅素基團。2.3從紅細胞中別離出血紅蛋白的過程為：洗滌紅細胞、釋放血紅蛋白、別離血紅蛋白、透析。洗滌紅細胞的目的是什么？除去血漿蛋白的雜蛋白，有利于后續(xù)步驟的別離純化。紅細胞的洗滌過程為：血液＋檸檬酸鈉→低速短時離心→吸出上層血漿→紅細胞＋5倍體積生理鹽水→緩慢攪拌10min→低速短時離心→吸出上清液→反復洗滌直至上清液無黃色思考：參加檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？防止血液凝固；防止白細胞沉淀；防止紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。第4頁

思考：你有什么方法將紅細胞中的血紅蛋白釋放出來？參加蒸餾水，用玻璃棒快速攪拌一段時間。補充：參加蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要一樣。參加甲苯的目的是溶解細胞膜，有利于血紅蛋白的釋放與別離。此時，紅細胞破碎混合液中不僅含有血紅蛋白，而且還含有細胞破碎物、脂質(zhì)、甲苯有機溶劑等。怎樣除去這些雜質(zhì)呢？由于它們的密度不同，科學家采取了離心別離的方法：紅細胞破碎混合液→中速長時離心〔2000c/min×10min〕→濾紙過濾除去脂質(zhì)→分液漏斗別離出血紅蛋白如何除無機鹽離子與小分子有機物質(zhì)呢？。透析。半透膜的選擇透過性，大分子物質(zhì)不能通過半透膜，離子與小分子能夠通過半透膜。在透析過程中，血紅蛋白溶液中的離子與小分子不斷通過半透膜擴散進入到pH＝7的磷酸緩沖液中。思考：為何使用pH＝7的磷酸緩沖液？為什么緩沖液量遠多于血紅蛋白溶液量？維持血紅蛋白的正常特性。有利于雜質(zhì)分子充分地向外擴散?？偨Y(jié)：通過以上四個根本過程，紅細胞中的血紅蛋白就被提取出來。但其中還含有其他種類的蛋白質(zhì)分子〔如呼吸酶等〕。怎樣將雜蛋白與血紅蛋白別離開來呢？我們來研究蛋白質(zhì)提取與別離的第二個步驟――粗別離〔凝膠色譜操作〕。凝膠色譜別離蛋白質(zhì)包括：制作色譜柱、裝填色譜柱、樣品參加與洗脫。根據(jù)教材圖5－19，說出制作色譜柱需要的材料。橡皮塞2個、打孔器、小刀、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)、玻璃管、尼龍管等。第5頁

色譜柱的制作過程：準備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱下面進展第二步凝膠色譜柱的裝填。請閱讀教材：色譜柱的裝填過程。樣品參加與洗脫。其根本過程是：調(diào)節(jié)緩沖液面→參加蛋白質(zhì)樣品→調(diào)節(jié)緩沖液面→洗脫→收集分裝蛋白質(zhì)至此，血紅蛋白即可得到粗別離。在整個操作過程中，應(yīng)當注意以下事項：〔1〕紅細胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心?！?〕凝膠的預處理：沸水浴法時間短，還能除去微生物與氣泡〔3〕色譜柱的裝填：裝填盡量嚴密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流?！?〕色譜柱成功標志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動?！菜摹?、實驗結(jié)果分析與評價1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？觀察你處理的血液樣品離心后是否分層〔見教科書圖5-18〕，如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高與時間過長，會使白細胞與淋巴細胞一同沉淀，也得不到純潔的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以參加大分子的有色物質(zhì)，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的第6頁

性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。3、你能描述血紅蛋白別離的完整過程嗎？血紅蛋白提取與別離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗別離、純化與純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗別離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進展純度鑒定。4、你能觀察到蛋白質(zhì)的別離過程中紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷別離效果？如果凝膠色譜柱裝填得很成功、別離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明別離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。課堂小結(jié)當今生物科學在蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的進展，說明提取、別離高純度的蛋白質(zhì)的重要性與必要性，進而說明本節(jié)課的目的，以血紅蛋白為實驗材料，學習