基因工程第三章2-Jun-finalversion課件

CloningVectors第三章基因工程載體CloningVectors第三章基因工程載體1第三章

基因克隆載體第一節(jié)

質粒載體

第二節(jié)

噬菌體載體

第三節(jié)

真核細胞的克隆載體第三章

基因克隆載體第一節(jié)

質粒載體2第二節(jié)

噬菌體載體一、噬菌體的一般生物學特性二、λ噬菌體載體三、粘性質粒四、單鏈DNA噬菌體載體第二節(jié)

噬菌體載體一、噬菌體的一般生物學特性3一、噬菌體的一般生物學特性噬菌體是比細菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細胞一樣，噬菌體侵犯細菌，也可以認為它是細菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結構上有一個蛋白質外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細菌內。一、噬菌體的一般生物學特性噬菌體是比細菌還小得多的微4噬菌體的結構噬菌體的結構5基因工程第三章2-Jun-finalversion課件6烈性噬菌體溫和噬菌體溶源化細菌溶源化原噬菌體烈性噬菌體7噬菌體的侵染與包裝噬菌體的侵染與包裝8二、λ噬菌體載體二、λ噬菌體載體9λ噬菌體的電子顯微鏡照片λ噬菌體的電子顯微鏡照片10a)在噬菌體內呈線性雙鏈DNA分子(48502bp)，編碼50多個基因，在兩端各有12個堿基組成的5’單鏈互補粘性末端(Cohesiveend),進入宿主細胞后,粘性末端連接形成環(huán)狀分子(Cos位點)，是包裝的必需DNA序列．5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’b)λ基因組DNA上有56種限制酶識別位點．1.λ基因組DNA的特點（一）λDNA分子a)在噬菌體內呈線性雙鏈DNA分子(48502bp)，編11基因工程第三章2-Jun-finalversion課件12λ噬菌體基因大致分為4個區(qū)：

結構區(qū)A～J19個基因，編碼頭、尾部蛋白質為結構區(qū),重組區(qū)

att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），調控區(qū)啟動子、終止子和NCI基因，O-R為裂解區(qū).λ噬菌體的基因組圖及EcoRI酶切圖2.λ基因組DNA的結構λ噬菌體基因大致分為4個區(qū)：λ噬菌體的基因組13A：成熟包被，切開cos環(huán)，D,E：(占頭蛋白75%)W,F：頭尾連接Int(整合),Xis(刪除),Red促重組N(早期調控)促O,P(復制).Red,Xis,Int轉錄和整合。Q(晚期調控)促頭,尾,S,R基因表達和溶菌CI,CII,CIII為負調控，阻止溶菌環(huán)化后的λ基因組DNAA：成熟包被，切開cos環(huán)，環(huán)化后的λ基因組DNA14人為將λ噬菌體基因組分為3個區(qū)域：左側區(qū)：自基因A到基因J，包含外殼蛋白的全部編碼基因。中間區(qū)：介于基因J和基因N之間，這個區(qū)又稱為非必需區(qū)，與噬菌斑形成無關，被外源DNA片斷取代后，并不影響噬菌體的生命活動。中間區(qū)包含重組基因和整合切割基因。右側區(qū)：位于N基因的右側，包含全部的主要調節(jié)基因及復制基因和裂解基因。人為將λ噬菌體基因組分為3個區(qū)域：15裂解周期早期：環(huán)狀的λDNA分子按θ型雙向復制，復制起點位于O基因內，需要O、P基因編碼蛋白的參與。晚期：控制滾環(huán)型復制的開關被啟動，復制從θ型轉變?yōu)闈L環(huán)型復制，合成出一系列λDNA線性排列的多聚體分子。cos位點是λ噬菌體正確包裝的必需位點。3.λDNA的復制裂解周期3.λDNA的復制16λ噬菌體DNA的復制λ噬菌體DNA的復制17溶原性周期λDNA復制以另外一種形式進行，穩(wěn)定的整合到宿主染色體上并隨之一起復制。cI基因表達，合成參與溶菌周期活動的所有基因被阻遏的蛋白質。附著位點att，同大腸桿菌染色體DNA的局部同源位點之間的重組反應實現(xiàn)。原噬菌體的刪除作用整合作用需要int基因的表達，是一種可逆的過程：一方面，噬菌體基因組可以整合到大腸桿菌染色體DNA上，成為原噬菌體；另一方面，在適當條件下，原噬菌體又可以脫離宿主染色體，重新變成獨立的復制子，這種過程叫做原噬菌體的刪除作用。λ噬菌體的刪除，需要噬菌體xis基因和int基因的協(xié)同作用才能實現(xiàn)。溶原性周期184.λ噬菌體的組裝4.λ噬菌體的組裝191.野生型的λ噬菌體不適于直接用作基因克隆載體原因λDNA基因組中同一種限制酶具有多個識別位點，不利于外源DNA插入—體內突變和建立新的克隆位點。包裝限制:λ噬菌體頭部只能容納自身DNA的75-105%，即39-52.5Kb，天然λ僅可插入2.5Kb外源DNA片段—如若除去所有與λ裂解無關的基因和空白區(qū)，最大可插入22Kb。（二）λ噬菌體載體的構建1.野生型的λ噬菌體不適于直接用作基因克隆載體原因（二）20基因工程第三章2-Jun-finalversion課件212.λ噬菌體的改造切除非必需區(qū)段（重組基因簇）:1/3非必需區(qū)段切除必需的的RE識別位點，在非必需區(qū)引入合適的RE識別位點引入適當的選擇標記基因以便重組子的篩選建立重組λDNA分子的體外包裝系統(tǒng)，通過無意義突變將其改造成安全載體，以利于生物學防護。2.λ噬菌體的改造切除非必需區(qū)段（重組基因簇）:1/3非221)除去多余的限制酶識別位點天然的λ-DNA上有多個酶切位點，如：EcoRI5個，HindIII7個，這些多余的酶切位點必須被修飾。一般利用自然選擇法獲得限制性位點缺失的λ品系。自然選擇法可以利用一個產生EcoRI的大腸桿菌，大部分侵入細胞的λDNA分子會被限制性酶破壞，少部分能夠成活，這些就是突變型的噬菌體，其EcoRI位點缺失了。2.λ噬菌體的改造1)除去多余的限制酶識別位點2.λ噬菌體的改造23通過自然選擇法篩選無EcoRI識別位點的λ-噬菌體通過自然選擇法篩選無EcoRI識別位點的λ-噬菌體242)切除掉λDNA的非必需區(qū)載體經改造后的長度約為40kb，但在非必需區(qū)域內含有兩個相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），兩者間的距離為14kb長，使用時用酶切開，分離去除這個14kb長的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。40-14kb=26kb包裝下限為36.4kb，因此其載裝下限為10.4而上限為25.5kb。不再需要標記基因，因為空載的載體DNA只有26kb，不可能被包裝，因而無法進入受體細胞中去2.λ噬菌體的改造2)切除掉λDNA的非必需區(qū)2.λ噬菌體的改造253)引入無義突變琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型λDNA上D和E兩個頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當這種λDNA進入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴散，而基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。2.λ噬菌體的改造3)引入無義突變2.λ噬菌體的改造263.常用的λ噬菌體衍生載體載體名稱分子大小(kb)可克隆外源DNA片段大小(kb)Charon3A4.830–21.4Charon4A4.540–20.1Charon174.640-22.4Charon2040.360–21.37Charon21A41.70–21.08Charon2839.390–20.05Charon3046.760-20.24LA7–140.60–24.1Sep6-lac544.30–22.4BF10146.06.3–24.43.常用的λ噬菌體衍生載體載體名稱分子大小(kb)27插入型載體只具有一個限制性核酸內切酶的酶切位點可供外源DNA插入的λ噬菌體派生載體承載10Kb以內外源DNA片斷替換型載體(取代型載體)具有兩個限制性核酸內切酶的酶切位點，它們之間的DNA片斷可被外源DNA片斷取代承載20Kb左右外源DNA片斷有多克隆位點，即可用作插入型又可用作取代型4.λ噬菌體載體的類型插入型載體4.λ噬菌體載體的類型28體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）l-DNA載體的構建：縮短長度插入型載體體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段2943.34kbAJb527cI434EcoRⅠ43.7kbAJLacZ免疫功能失活插入型載體若CI插入外源基因溶菌透明噬斑若不插入外源基因溶源混濁斑β－半乳糖苷酶失活插入型載體若LacZ插入基因IPTG/X-gal平板有白斑若LacZ無插入基因IPTG/X-gal平板有藍斑根據插入失活效應的特異性分為兩種亞型：插入型載體的篩選

λgt10λgt1143.34kbAJb527cI434EcoRⅠ43.7kb30基因工程第三章2-Jun-finalversion課件31不同的噬菌斑形態(tài)可作為篩選重組子的標記:imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標記基因的l-載體進入受體細胞后，建立溶原狀態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑；當外源DNA插入到標記基因中，基因滅活，l-重組分子便進入溶菌循環(huán)，形成透明斑不同的噬菌斑形態(tài)可作為篩選重組子的標記:32體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（51–26）載體長度26kb插入片段最大裝載長度25kb（36–26）l-DNA載體的構建：縮短長度取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（51–33替換型載體的篩選替換型載體的基因組中具有成對的限制酶位點，在這兩個位點之間的DNA區(qū)段可以被插入的外源DNA片段所取代cos位點cos位點置換區(qū)域左臂右臂替換型載體的篩選替換型載體的基因組中具有成對的限制酶34λNM781由于λ噬菌體的感染，寄主細胞lacZ基因的琥珀突變被抑制,所以能在乳糖麥康基氏(McConkey)瓊脂培養(yǎng)基上產生紅色的噬菌斑,或是在X-gal瓊脂培養(yǎng)基上產生藍色的噬菌斑。但如果具有supE基因的EcoRⅠ片段被外源DNA所取代，那么形成的重組體噬菌體在上述的兩種指示培養(yǎng)基中都只能產生出無色的噬菌斑。應用指示性培養(yǎng)基可對這種重組體方便的篩選出來。宿主含lacZ的琥珀突變λNM781由于λ噬菌體的感染，寄主細胞lacZ基因351.轉染作用轉染：由宿主細胞捕獲噬菌體或病毒DNA的過程。轉導：以噬菌體為媒介轉移遺傳物質的過程。轉化：質粒等外源DNA引入細胞的過程。2.λDNA的體外包裝是提高λ噬菌體轉染效率的有效方法（三）λ噬菌體載體的應用1.轉染作用（三）λ噬菌體載體的應用36包裝有限制，λφDNA全長48kb，必需基因為28kb,包裝外源基因限制全長105-75％（即51－28＝23kb;36－28＝8kb）包裝限制范圍為8-23kb，一般包裝容量為15kb左右。λDNA的體外包裝包裝有限制，λφDNA全長48kb，必需基因為28kb,包37凱倫噬菌體載體(Charon)這類載體有插入型的，如Charon2；也有替換型的，如Charon30。在基因操作中用途很廣。Charon載體上具有適當數量的限制酶切位點，帶有來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ（中央區(qū)段）。插入基因經包裝后，可通過藍/白斑篩選陽性克隆。Charon載體的特點是容量大，對研究大范圍內的染色體結構很有用處。它承受外源DNA的能力為幾kb到23kb。當與外殼蛋白體外包裝，形成噬菌體顆粒，其感染效率很高，幾乎為100%，遠高于質粒的轉化率(0.1%)。（四）常用的λ噬菌體載體凱倫噬菌體載體(Charon)（四）常用的λ噬菌體載體38基因工程第三章2-Jun-finalversion課件39三、粘性質粒粘性質粒是帶有λ噬菌體的Cos位點和整個pBR322的DNA序列的載體。三、粘性質粒粘性質粒是帶有λ噬菌體的Cos位40粘性質粒（Cosmid）帶有λ噬菌體的Cos位點和整個pBR322的DNA順序。經感染進入細菌細胞以后，它就好象質粒那樣在細胞中進行復制。易環(huán)化和擴增。分子量小，可包裝30-45kb外源基因，可由Ampr抗性篩選，常用于構建基因文庫。組成：質粒復制原點，抗藥基因，多克隆位點，已連接入的λcos位點。1.粘性質粒的組成及性質粘性質粒（Cosmid）帶有λ噬菌體的Cos位點412.粘性質粒的克隆無cos點，不包裝DNA小于包裝下線，不包裝2.粘性質粒的克隆無cos點，不包裝DNA小于包裝下線，不42DigestionLigation（c）PackagingandinfectDigestionLigation（c）Packaging43λDNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質粒的構建就是為了進一步提高噬菌體DNA的裝載能力考斯質粒是一類人工構建的含有λDNAcos序列和質粒復制子的特殊類型的載體3.粘性質粒的特點λDNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb44能像λDNA那樣進行體外包裝，并高效轉染受體細胞能像質粒那樣在受體細胞中自主復制重組操作簡便，篩選容易裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍不能體內包裝，不裂解受體細胞4.粘性質粒作為載體的優(yōu)點能像λDNA那樣進行體外包裝，并高效轉染受體細胞4.粘性質45M13單鏈DNA噬菌體為細線狀DNA，呈單鏈環(huán)狀，包裝在線狀蛋白外殼中。四、單鏈DNA噬菌體載體1.M13噬菌體的生物學特性M13單鏈DNA噬菌體為細線狀DNA，呈單鏈環(huán)狀，包裝在線狀462.M13噬菌體的基因組結構—9個基因，10種蛋白基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ編碼特異性蛋白質，參與病毒顆粒的組裝基因Ⅱ參與DNA復制基因Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ編碼M13的結構蛋白基因Ⅴ參與單鏈復制過程中的環(huán)化作用基因Ⅵ是衣殼蛋白的重要組成部分IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNA2.M13噬菌體的基因組結構—9個基因，10種蛋白基因Ⅰ473.M13噬菌體感染、復制及包裝復制過程：ss（+）RF(0-1min)(復制型DNA,replicativeDNA)RFRF(0-20min)RFss(+)(20min→∞)

DNA包裝無嚴格限制3.M13噬菌體感染、復制及包裝復制過程：48+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DN49基因工程第三章2-Jun-finalversion課件504.M13噬菌體載體的構建M13-DNA上幾乎沒有非必需區(qū)域，因而載體的構建主要是插入標記基因如，lacZ、多克隆位點(polylinker)，消除多余的酶切位點。IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker4.M13噬菌體載體的構建M13-DNA上幾乎沒有非必需區(qū)51在M13上引入lacZ’基因，產生了M13mp1，這樣就可以通過插入失活鑒定重組噬菌斑。

M13mp1載體不含有任何的單一切點的的識別序列，在基因的起始端，加入含有6堿基的序列GAATTC，是一個EcoRI位點，這是通過體外定點突變獲得的，產生了M13mp2。M13mp2是最簡單的M13克隆載體，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位點，在X-gal培養(yǎng)基上可以很容易的區(qū)別出來。M13載體的構建的第二步是將限制性內切酶位點引入lacZ’基因，這一步是通過合成短的多聚核苷酸稱為polylinker，含有一系列的限制性位點和EcoRI粘端，完成的。多聚接頭插入到M13mp2的EcoRI位點上，就產生了M13mp7。4.M13噬菌體載體的構建在M13上引入lacZ’基因，產生了M13mp1，這樣就可以52基因工程第三章2-Jun-finalversion課件53基因工程第三章2-Jun-finalversion課件54基因工程第三章2-Jun-finalversion課件55CoordinatesofM13mp18/19genes(terminationcodonsincluded):I3196-4242

II6849-831

III1579-2853

IV4220-5500

V843-1106

VI2856-3194

VII1108-1209

VIII1301-1522

IX1206-1304

X496-831M13mp18M13mp19CoordinatesofM13mp18/19gene565.M13噬菌體載體的優(yōu)越性能克隆較大的DNA片斷，包裝容量M13DNA的6倍產生大量含有外源DNA序列的單鏈DNA分子:M13噬菌體載體最大的優(yōu)點就是能使插入的外源DNA片段變成單鏈。測定外源DNA片斷的插入方向可從大腸桿菌中制備雙鏈的復制型DNA兩種形式的DNA分子都能夠轉染感受態(tài)的大腸桿菌，或產生噬菌斑5.M13噬菌體載體的優(yōu)越性57M13單鏈載體有多聚接頭，可進行LacZ插入失活白斑篩選?？蓱糜诳寺』?，測序，基因突變的誘變技術。6.M13噬菌體載體的應用M13單鏈載體有多聚接頭，可進行LacZ插入失活白斑篩選?？?8克隆克隆59第三節(jié)

真核細胞的克隆載體一、在酵母細胞中克隆基因常用的載體（共同特點）1.整合型載體（YIP）2.復制型載體（YRP）3.附加體型載體（YEP）二、植物基因克隆的載體——Ti質粒三、動物細胞基因克隆的載體第三節(jié)

真核細胞的克隆載體一、在酵母細胞中克隆基因常用的60在酵母細胞中常用的載體的共同特點酵母細胞的載體，它們共同的特點是：（1）能在大腸桿菌中克隆，并且具有較高的拷貝數。這樣可使外源基因轉化到酵母細胞之前先在大腸桿菌中擴增；（2）含有在酵母中便于選擇的遺傳標記。這些標記一般能和大腸桿菌相應的突變體互補，如Leu2+、His+、Ura3+、Trpl+等。有些還攜帶用于大腸桿菌的抗菌素抗性標記；（3）含有合適的限制酶切位點，以便外源基因的插入。酵母是單細胞真核生物，可接受質粒轉化。在酵母細胞中常用的載體的共同特點酵母細胞的載體，它們共同的特61整合型附加體型復制型根據復制方式不同，載體分為三種類型整合型附加體型復制型根據復制方式不同，載體分為三種類型62整合型載體（YIP）YIP型載體是由大腸桿菌質粒和酵母的DNA片段構成的。如Pyeleu10是由ColEI質粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段構成，在細菌中復制、擴增，進入酵母后可整合表達。YIP型載體的特點是轉化率低(只有1-10轉化子/微克DNA)，但轉化子遺傳性穩(wěn)定，多用于遺傳分析工作。整合型載體（YIP）YIP型載體是由大腸桿菌質粒和酵63復制型載體（YRP）YRP型載體是帶有選擇標記和復制子的酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質粒中構成的。因為它同時含有大腸桿菌和酵母的自主復制基因，所以能在兩種細胞中存在和復制?？梢栽趦煞N截然不同的生物細胞中復制的載體稱為穿梭載體（ShuttleVector），穿梭載體在基因工程中廣泛使用。復制型載體（YRP）YRP型載體是帶有選擇標記和復制64優(yōu)點:YRP對酵母的轉化率極高(102-103轉化子/ugDNA)，拷貝數也高。以共價閉合環(huán)狀DNA分子形式存在，易從酵母中提取。缺點:在受體細胞中不穩(wěn)定，易丟失。穿梭模式優(yōu)點:YRP對酵母的轉化率極高(102-103轉化子/u65附加體型載體（YEP）YEP型載體一般由大腸桿菌質粒、2μm質粒以及酵母染色體的選擇標記構成。2μm質粒是釀酒酵母中含有的長度為2μm的內源質粒。2μm質粒含有自主復制起始區(qū)（Ori）和STB區(qū),STB序列能夠使質粒在供體細胞中維持穩(wěn)定。利用2μm質粒，人們已經構建出許多YEP型載體，比如YEP型載體PYF92。附加體型載體（YEP）YEP型載體一般由大腸桿菌質粒66YEP型載體PYF92由酵母的2μm質粒、pBR322質粒和酵母的His3+(組氨酸)基因構成。YEP型載體對酵母具有很高的轉化活性，一般為103-105轉化子/微克DNA。比YRP型載體更穩(wěn)定，拷貝數也高（25-100個/細胞），是基因克隆中的常用載體。YEP型載體PYF92由酵母的2μm質粒、pBR322質67三、動物細胞基因克隆的載體㈠SV40病毒㈡SV40病毒載體(1)取代型重組病毒載體①晚期區(qū)段取代載體②早期區(qū)段取代載體(2)重組的病毒-質粒載體三、動物細胞基因克隆的載體㈠SV40病毒68猿猴空泡病毒(SV40病毒)SV40病毒呈小型20面體，共價閉合環(huán)狀DNA，5.2kb，序列已知。外殼蛋白由VP1、VP2、VP3構成。受納細胞（permissivecell）：感染病毒后能使細胞裂解釋放感染性病毒顆粒。非受納細胞（nonpermissivecell）：感染病毒后不產生感染性病毒顆粒，但能整合到細胞染色體中產生癌變。人體細胞是半受納細胞，處于二者之間。猿猴空泡病毒(SV40病毒)SV40病毒呈小型20面體，共69早期表達區(qū)編碼大T抗原和小t抗原（即腫瘤蛋白質或抗原）。T抗原的功能是控制SV40基因組的復制和調節(jié)。小t抗原的功能不詳。晚期表達區(qū)合成Vp1、Vp2、Vp3，包裝釋放。SV40的基因結構在非受納細胞中，感染的病毒只有早期基因區(qū)段表達。病毒的基因組隨后就整合到宿主的染色體基因組上。這種整合作用是隨機的。早期表達區(qū)編碼大T抗原和小t抗原（即腫瘤蛋白質或抗原）。70優(yōu)點:感染率高，幾乎100％寄主細胞能被感染能提供完整的真核基因轉錄所需的成分侵染性具有寄主特異性改建原因：包裝范圍嚴格，超過基因組大小的(5.2kb)的重組DNA就不能被被包裝。宿主細胞范圍小，只能在受納細胞中增殖，最終導致寄主細胞裂解死亡，不能長期培養(yǎng)。SV-40的衍生物作為載體的優(yōu)缺點優(yōu)點:SV-40的衍生物作為載體的優(yōu)缺點71(1)取代型重組病毒載體取代型的重組病毒載體（recombinantVirusVector）,其特點是外源DNA直接插入在缺陷型的病毒基因組上。插入的外源DNA片段的大小和被取代的病毒基因組區(qū)段是等同的，這樣形成的重組體DNA能夠在哺乳動物的受納細胞中增殖，并被包裝成病毒顆粒。但為了補充被取代的病毒基因組DNA的功能，必須使用一種與之互補的輔助病毒。(1)取代型重組病毒載體取代型的重組病毒載體（recomb72①晚期區(qū)段取代載體SV40晚期基因被外源DNA取代后，失去合成外殼蛋白功能，若加入一種溫度敏感（ts）的輔助病毒tsA58（它是一種在41℃下便不能合成T抗原的突變體），與缺乏了整個晚期區(qū)段功能的SV40病毒，可以互補，這兩種病毒混合感染時，仍然能夠增殖。重組體病毒能提供此種T抗原，tsA58則可以復制，并合成出外殼蛋白質，這樣就能在受納細胞中擴增表達。①晚期區(qū)段取代載體SV40晚期基因被外源DNA取代后，失去73大鼠前胰島素原基因在猿猴細胞中的重組表達大鼠前胰島素原基因在猿猴細胞中的重組表達74②早期區(qū)段取代載體這種載體被外源基因取代早期基因而缺失大T抗原。COS細胞可以提供大T抗原，因此重組病毒在COS細胞中能夠增殖和擴增。②早期區(qū)段取代載體這種載體被外源基因取代早期基因而缺失大T75(2)重組的病毒-質粒載體含有完整早期區(qū)段的復制起點的病毒-質粒載體:由病毒的早期區(qū)段的復制點和大腸桿菌的質粒分子重組而成。這類質粒既能在大腸桿菌中復制，又能在哺乳動物細胞中復制，所以也叫穿梭載體，如pAC10。分兩種類型:a.穿梭載體b.微型病毒復制子-質粒載體(2)重組的病毒-質粒載體含有完整早期區(qū)段的復制起點的病毒76

穿梭載體:pAC10載體由大T抗原、復制子和pBR322構成，既能在大腸桿菌中復制，又能在哺乳動物細胞中復制。在細菌中擴增提取基因重組質粒，轉染小鼠細胞5-6天后可高拷貝擴增、進而高表達基因產物。穿梭載體:pAC10載體由大T抗原、復制子和pBR3277微型病毒復制子-質粒載體:可用特殊細胞來克隆和表達，構建很簡單，將SV40復制起點片段插入到大腸桿菌質粒載體上。這種載體只能在持久的表達病毒T抗原的特殊細胞系使用，比如Cos細胞，HFs細胞。在這些細胞中，含有SV40復制起點的任何大小的環(huán)形DNA，都能像質粒一樣進行獨立復制。微型病毒復制子-質粒載體:可用特殊細胞來克隆和表達，構78CloningVectors第三章基因工程載體CloningVectors第三章基因工程載體79第三章

基因克隆載體第一節(jié)

質粒載體

第二節(jié)

噬菌體載體

第三節(jié)

真核細胞的克隆載體第三章

基因克隆載體第一節(jié)

質粒載體80第二節(jié)

噬菌體載體一、噬菌體的一般生物學特性二、λ噬菌體載體三、粘性質粒四、單鏈DNA噬菌體載體第二節(jié)

噬菌體載體一、噬菌體的一般生物學特性81一、噬菌體的一般生物學特性噬菌體是比細菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細胞一樣，噬菌體侵犯細菌，也可以認為它是細菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結構上有一個蛋白質外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細菌內。一、噬菌體的一般生物學特性噬菌體是比細菌還小得多的微82噬菌體的結構噬菌體的結構83基因工程第三章2-Jun-finalversion課件84烈性噬菌體溫和噬菌體溶源化細菌溶源化原噬菌體烈性噬菌體85噬菌體的侵染與包裝噬菌體的侵染與包裝86二、λ噬菌體載體二、λ噬菌體載體87λ噬菌體的電子顯微鏡照片λ噬菌體的電子顯微鏡照片88a)在噬菌體內呈線性雙鏈DNA分子(48502bp)，編碼50多個基因，在兩端各有12個堿基組成的5’單鏈互補粘性末端(Cohesiveend),進入宿主細胞后,粘性末端連接形成環(huán)狀分子(Cos位點)，是包裝的必需DNA序列．5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’b)λ基因組DNA上有56種限制酶識別位點．1.λ基因組DNA的特點（一）λDNA分子a)在噬菌體內呈線性雙鏈DNA分子(48502bp)，編89基因工程第三章2-Jun-finalversion課件90λ噬菌體基因大致分為4個區(qū)：

結構區(qū)A～J19個基因，編碼頭、尾部蛋白質為結構區(qū),重組區(qū)

att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），調控區(qū)啟動子、終止子和NCI基因，O-R為裂解區(qū).λ噬菌體的基因組圖及EcoRI酶切圖2.λ基因組DNA的結構λ噬菌體基因大致分為4個區(qū)：λ噬菌體的基因組91A：成熟包被，切開cos環(huán)，D,E：(占頭蛋白75%)W,F：頭尾連接Int(整合),Xis(刪除),Red促重組N(早期調控)促O,P(復制).Red,Xis,Int轉錄和整合。Q(晚期調控)促頭,尾,S,R基因表達和溶菌CI,CII,CIII為負調控，阻止溶菌環(huán)化后的λ基因組DNAA：成熟包被，切開cos環(huán)，環(huán)化后的λ基因組DNA92人為將λ噬菌體基因組分為3個區(qū)域：左側區(qū)：自基因A到基因J，包含外殼蛋白的全部編碼基因。中間區(qū)：介于基因J和基因N之間，這個區(qū)又稱為非必需區(qū)，與噬菌斑形成無關，被外源DNA片斷取代后，并不影響噬菌體的生命活動。中間區(qū)包含重組基因和整合切割基因。右側區(qū)：位于N基因的右側，包含全部的主要調節(jié)基因及復制基因和裂解基因。人為將λ噬菌體基因組分為3個區(qū)域：93裂解周期早期：環(huán)狀的λDNA分子按θ型雙向復制，復制起點位于O基因內，需要O、P基因編碼蛋白的參與。晚期：控制滾環(huán)型復制的開關被啟動，復制從θ型轉變?yōu)闈L環(huán)型復制，合成出一系列λDNA線性排列的多聚體分子。cos位點是λ噬菌體正確包裝的必需位點。3.λDNA的復制裂解周期3.λDNA的復制94λ噬菌體DNA的復制λ噬菌體DNA的復制95溶原性周期λDNA復制以另外一種形式進行，穩(wěn)定的整合到宿主染色體上并隨之一起復制。cI基因表達，合成參與溶菌周期活動的所有基因被阻遏的蛋白質。附著位點att，同大腸桿菌染色體DNA的局部同源位點之間的重組反應實現(xiàn)。原噬菌體的刪除作用整合作用需要int基因的表達，是一種可逆的過程：一方面，噬菌體基因組可以整合到大腸桿菌染色體DNA上，成為原噬菌體；另一方面，在適當條件下，原噬菌體又可以脫離宿主染色體，重新變成獨立的復制子，這種過程叫做原噬菌體的刪除作用。λ噬菌體的刪除，需要噬菌體xis基因和int基因的協(xié)同作用才能實現(xiàn)。溶原性周期964.λ噬菌體的組裝4.λ噬菌體的組裝971.野生型的λ噬菌體不適于直接用作基因克隆載體原因λDNA基因組中同一種限制酶具有多個識別位點，不利于外源DNA插入—體內突變和建立新的克隆位點。包裝限制:λ噬菌體頭部只能容納自身DNA的75-105%，即39-52.5Kb，天然λ僅可插入2.5Kb外源DNA片段—如若除去所有與λ裂解無關的基因和空白區(qū)，最大可插入22Kb。（二）λ噬菌體載體的構建1.野生型的λ噬菌體不適于直接用作基因克隆載體原因（二）98基因工程第三章2-Jun-finalversion課件992.λ噬菌體的改造切除非必需區(qū)段（重組基因簇）:1/3非必需區(qū)段切除必需的的RE識別位點，在非必需區(qū)引入合適的RE識別位點引入適當的選擇標記基因以便重組子的篩選建立重組λDNA分子的體外包裝系統(tǒng)，通過無意義突變將其改造成安全載體，以利于生物學防護。2.λ噬菌體的改造切除非必需區(qū)段（重組基因簇）:1/3非1001)除去多余的限制酶識別位點天然的λ-DNA上有多個酶切位點，如：EcoRI5個，HindIII7個，這些多余的酶切位點必須被修飾。一般利用自然選擇法獲得限制性位點缺失的λ品系。自然選擇法可以利用一個產生EcoRI的大腸桿菌，大部分侵入細胞的λDNA分子會被限制性酶破壞，少部分能夠成活，這些就是突變型的噬菌體，其EcoRI位點缺失了。2.λ噬菌體的改造1)除去多余的限制酶識別位點2.λ噬菌體的改造101通過自然選擇法篩選無EcoRI識別位點的λ-噬菌體通過自然選擇法篩選無EcoRI識別位點的λ-噬菌體1022)切除掉λDNA的非必需區(qū)載體經改造后的長度約為40kb，但在非必需區(qū)域內含有兩個相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），兩者間的距離為14kb長，使用時用酶切開，分離去除這個14kb長的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。40-14kb=26kb包裝下限為36.4kb，因此其載裝下限為10.4而上限為25.5kb。不再需要標記基因，因為空載的載體DNA只有26kb，不可能被包裝，因而無法進入受體細胞中去2.λ噬菌體的改造2)切除掉λDNA的非必需區(qū)2.λ噬菌體的改造1033)引入無義突變琥珀型突變（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。將野生型λDNA上D和E兩個頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG。當這種λDNA進入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴散，而基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。2.λ噬菌體的改造3)引入無義突變2.λ噬菌體的改造1043.常用的λ噬菌體衍生載體載體名稱分子大小(kb)可克隆外源DNA片段大小(kb)Charon3A4.830–21.4Charon4A4.540–20.1Charon174.640-22.4Charon2040.360–21.37Charon21A41.70–21.08Charon2839.390–20.05Charon3046.760-20.24LA7–140.60–24.1Sep6-lac544.30–22.4BF10146.06.3–24.43.常用的λ噬菌體衍生載體載體名稱分子大小(kb)105插入型載體只具有一個限制性核酸內切酶的酶切位點可供外源DNA插入的λ噬菌體派生載體承載10Kb以內外源DNA片斷替換型載體(取代型載體)具有兩個限制性核酸內切酶的酶切位點，它們之間的DNA片斷可被外源DNA片斷取代承載20Kb左右外源DNA片斷有多克隆位點，即可用作插入型又可用作取代型4.λ噬菌體載體的類型插入型載體4.λ噬菌體載體的類型106體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段大?。?-14kb（51–37）l-DNA載體的構建：縮短長度插入型載體體外包裝插入位點體外包裝插入片段載體長度37kb插入片段10743.34kbAJb527cI434EcoRⅠ43.7kbAJLacZ免疫功能失活插入型載體若CI插入外源基因溶菌透明噬斑若不插入外源基因溶源混濁斑β－半乳糖苷酶失活插入型載體若LacZ插入基因IPTG/X-gal平板有白斑若LacZ無插入基因IPTG/X-gal平板有藍斑根據插入失活效應的特異性分為兩種亞型：插入型載體的篩選

λgt10λgt1143.34kbAJb527cI434EcoRⅠ43.7kb108基因工程第三章2-Jun-finalversion課件109不同的噬菌斑形態(tài)可作為篩選重組子的標記:imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標記基因的l-載體進入受體細胞后，建立溶原狀態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑；當外源DNA插入到標記基因中，基因滅活，l-重組分子便進入溶菌循環(huán)，形成透明斑不同的噬菌斑形態(tài)可作為篩選重組子的標記:110體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（51–26）載體長度26kb插入片段最大裝載長度25kb（36–26）l-DNA載體的構建：縮短長度取代型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度10kb（51–111替換型載體的篩選替換型載體的基因組中具有成對的限制酶位點，在這兩個位點之間的DNA區(qū)段可以被插入的外源DNA片段所取代cos位點cos位點置換區(qū)域左臂右臂替換型載體的篩選替換型載體的基因組中具有成對的限制酶112λNM781由于λ噬菌體的感染，寄主細胞lacZ基因的琥珀突變被抑制,所以能在乳糖麥康基氏(McConkey)瓊脂培養(yǎng)基上產生紅色的噬菌斑,或是在X-gal瓊脂培養(yǎng)基上產生藍色的噬菌斑。但如果具有supE基因的EcoRⅠ片段被外源DNA所取代，那么形成的重組體噬菌體在上述的兩種指示培養(yǎng)基中都只能產生出無色的噬菌斑。應用指示性培養(yǎng)基可對這種重組體方便的篩選出來。宿主含lacZ的琥珀突變λNM781由于λ噬菌體的感染，寄主細胞lacZ基因1131.轉染作用轉染：由宿主細胞捕獲噬菌體或病毒DNA的過程。轉導：以噬菌體為媒介轉移遺傳物質的過程。轉化：質粒等外源DNA引入細胞的過程。2.λDNA的體外包裝是提高λ噬菌體轉染效率的有效方法（三）λ噬菌體載體的應用1.轉染作用（三）λ噬菌體載體的應用114包裝有限制，λφDNA全長48kb，必需基因為28kb,包裝外源基因限制全長105-75％（即51－28＝23kb;36－28＝8kb）包裝限制范圍為8-23kb，一般包裝容量為15kb左右。λDNA的體外包裝包裝有限制，λφDNA全長48kb，必需基因為28kb,包115凱倫噬菌體載體(Charon)這類載體有插入型的，如Charon2；也有替換型的，如Charon30。在基因操作中用途很廣。Charon載體上具有適當數量的限制酶切位點，帶有來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ（中央區(qū)段）。插入基因經包裝后，可通過藍/白斑篩選陽性克隆。Charon載體的特點是容量大，對研究大范圍內的染色體結構很有用處。它承受外源DNA的能力為幾kb到23kb。當與外殼蛋白體外包裝，形成噬菌體顆粒，其感染效率很高，幾乎為100%，遠高于質粒的轉化率(0.1%)。（四）常用的λ噬菌體載體凱倫噬菌體載體(Charon)（四）常用的λ噬菌體載體116基因工程第三章2-Jun-finalversion課件117三、粘性質粒粘性質粒是帶有λ噬菌體的Cos位點和整個pBR322的DNA序列的載體。三、粘性質粒粘性質粒是帶有λ噬菌體的Cos位118粘性質粒（Cosmid）帶有λ噬菌體的Cos位點和整個pBR322的DNA順序。經感染進入細菌細胞以后，它就好象質粒那樣在細胞中進行復制。易環(huán)化和擴增。分子量小，可包裝30-45kb外源基因，可由Ampr抗性篩選，常用于構建基因文庫。組成：質粒復制原點，抗藥基因，多克隆位點，已連接入的λcos位點。1.粘性質粒的組成及性質粘性質粒（Cosmid）帶有λ噬菌體的Cos位點1192.粘性質粒的克隆無cos點，不包裝DNA小于包裝下線，不包裝2.粘性質粒的克隆無cos點，不包裝DNA小于包裝下線，不120DigestionLigation（c）PackagingandinfectDigestionLigation（c）Packaging121λDNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5kb，但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯質粒的構建就是為了進一步提高噬菌體DNA的裝載能力考斯質粒是一類人工構建的含有λDNAcos序列和質粒復制子的特殊類型的載體3.粘性質粒的特點λDNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb122能像λDNA那樣進行體外包裝，并高效轉染受體細胞能像質粒那樣在受體細胞中自主復制重組操作簡便，篩選容易裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍不能體內包裝，不裂解受體細胞4.粘性質粒作為載體的優(yōu)點能像λDNA那樣進行體外包裝，并高效轉染受體細胞4.粘性質123M13單鏈DNA噬菌體為細線狀DNA，呈單鏈環(huán)狀，包裝在線狀蛋白外殼中。四、單鏈DNA噬菌體載體1.M13噬菌體的生物學特性M13單鏈DNA噬菌體為細線狀DNA，呈單鏈環(huán)狀，包裝在線狀1242.M13噬菌體的基因組結構—9個基因，10種蛋白基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅶ編碼特異性蛋白質，參與病毒顆粒的組裝基因Ⅱ參與DNA復制基因Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ編碼M13的結構蛋白基因Ⅴ參與單鏈復制過程中的環(huán)化作用基因Ⅵ是衣殼蛋白的重要組成部分IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNA2.M13噬菌體的基因組結構—9個基因，10種蛋白基因Ⅰ1253.M13噬菌體感染、復制及包裝復制過程：ss（+）RF(0-1min)(復制型DNA,replicativeDNA)RFRF(0-20min)RFss(+)(20min→∞)

DNA包裝無嚴格限制3.M13噬菌體感染、復制及包裝復制過程：126+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DN127基因工程第三章2-Jun-finalversion課件1284.M13噬菌體載體的構建M13-DNA上幾乎沒有非必需區(qū)域，因而載體的構建主要是插入標記基因如，lacZ、多克隆位點(polylinker)，消除多余的酶切位點。IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinker4.M13噬菌體載體的構建M13-DNA上幾乎沒有非必需區(qū)129在M13上引入lacZ’基因，產生了M13mp1，這樣就可以通過插入失活鑒定重組噬菌斑。

M13mp1載體不含有任何的單一切點的的識別序列，在基因的起始端，加入含有6堿基的序列GAATTC，是一個EcoRI位點，這是通過體外定點突變獲得的，產生了M13mp2。M13mp2是最簡單的M13克隆載體，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位點，在X-gal培養(yǎng)基上可以很容易的區(qū)別出來。M13載體的構建的第二步是將限制性內切酶位點引入lacZ’基因，這一步是通過合成短的多聚核苷酸稱為polylinker，含有一系列的限制性位點和EcoRI粘端，完成的。多聚接頭插入到M13mp2的EcoRI位點上，就產生了M13mp7。4.M13噬菌體載體的構建在M13上引入lacZ’基因，產生了M13mp1，這樣就可以130基因工程第三章2-Jun-finalversion課件131基因工程第三章2-Jun-finalversion課件132基因工程第三章2-Jun-finalversion課件133CoordinatesofM13mp18/19genes(terminationcodonsincluded):I3196-4242

II6849-831

III1579-2853

IV4220-5500

V843-1106

VI2856-3194

VII1108-1209

VIII1301-1522

IX1206-1304

X496-831M13mp18M13mp19CoordinatesofM13mp18/19gene1345.M13噬菌體載體的優(yōu)越性能克隆較大的DNA片斷，包裝容量M13DNA的6倍產生大量含有外源DNA序列的單鏈DNA分子:M13噬菌體載體最大的優(yōu)點就是能使插入的外源DNA片段變成單鏈。測定外源DNA片斷的插入方向可從大腸桿菌中制備雙鏈的復制型DNA兩種形式的DNA分子都能夠轉染感受態(tài)的大腸桿菌，或產生噬菌斑5.M13噬菌體載體的優(yōu)越性135M13單鏈載體有多聚接頭，可進行LacZ插入失活白斑篩選?？蓱糜诳寺』?，測序，基因突變的誘變技術。6.M13噬菌體載體的應用M13單鏈載體有多聚接頭，可進行LacZ插入失活白斑篩選。可136克隆克隆137第三節(jié)

真核細胞的克隆載體一、在酵母細胞中克隆基因常用的載體（共同特點）1.整合型載體（YIP）2.復制型載體（YRP）3.附加體型載體（YEP）二、植物基因克隆的載體——Ti質粒三、動物細胞基因克隆的載體第三節(jié)

真核細胞的克隆載體一、在酵母細胞中克隆基因常用的138在酵母細胞中常用的載體的共同特點酵母細胞的載體，它們共同的特點是：（1）能在大腸桿菌中克隆，并且具有較高的拷貝數。這樣可使外源基因轉化到酵母細胞之前先在大腸桿菌中擴增；（2）含有在酵母中便于選擇的遺傳標記。這些標記一般能和大腸桿菌相應的突變體互補，如Leu2+、His+、Ura3+、Trpl+等。有些還攜帶用于大腸桿菌的抗菌素抗性標記；（3）含有合適的限制酶切位點，以便外源基因的插入。酵母是單細胞真核生物，可接受質粒轉化。在酵母細胞中常用的載體的共同特點酵母細胞的載體，它們共同的特139整合型附加體型復制型根據復制方式不同，載體分為三種類型整合型附加體型復制型根據復制方式不同，載體分為三種類型140整合型載體（YIP）YIP型載體是由大腸桿菌質粒和酵母的DNA片段構成的。如Pyeleu10是由ColEI質粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段構成，在細菌中復制、擴增，進入酵母后可整合表達。YIP型載體的特點是轉化率低(只有1-10轉化子/微克DNA)，但轉化子遺傳性穩(wěn)定，多用于遺傳分析工作。整合型載體（YIP）YIP型載體是由大腸桿菌質粒和酵141復制型載體（YRP）YRP型載體是帶有選擇標記和復制子的酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質粒中構成的。因為它同時含有大腸桿菌和酵母的自主復制基因，所以能在兩種細胞中存在和復制?？梢栽趦煞N截然不同的生物細胞中復制的載體稱為穿梭載體（ShuttleVector），穿梭載體在基因工程中廣泛使用。復制型載體（YRP）YRP型載體是帶有選擇標