王憬惺 用于出血和血栓性疾病治療的血液制品課件

用于出血和血栓性疾病

治療的血液制品中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所王憬惺

用于出血和血栓性疾病

治療的血液制品中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所1

用于出血或血栓性

疾病治療的血液制品

及其臨床適應(yīng)癥

用于出血或血栓性

疾病治療的血液制品

2血源性血液制品

冷沉淀制品、凝血因子VIII濃縮制品、

凝血酶原復(fù)合物制品、凝血因子IX濃縮制品

纖維蛋白原制品、纖維蛋白粘合劑

抗凝血酶III、蛋白C制品

臨床使用安全性的現(xiàn)狀血源性血液制品

冷沉淀制品、凝血因子VIII濃縮制品、

凝3基因重組的血液制品

▲重組人凝血因子VIII

▲重組人凝血因子VIIa

重組人凝血因子IX

重組人激活的蛋白C

（ActivatedproteinC）

制造及臨床使用的概況

基因重組的血液制品

▲重組人凝血因子VIII

▲重組人凝血4一、血源性血液制品臨床使用安全性的現(xiàn)狀

通過血源性血液制品傳播的主要病毒

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

病毒經(jīng)血細(xì)胞傳播經(jīng)血漿和血液制品傳播

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

HAV十十

HBV

十十

HCV十十

HIV-l

十十

HIV-2

十十

B19PV

十十

WNV

十十

SARS？？

vCJD?!?!

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－一、血源性血液制品臨床使用安全性的現(xiàn)狀

5血源性凝血因子VIII傳播HIV的慘痛教訓(xùn)

在HIV檢測技術(shù)和血液制品病毒滅活技術(shù)未被實(shí)際使用前，血友病患者面臨很高的感染艾滋病的危險(xiǎn):

法國、德國和加拿大的狀告政府案、美國的狀告拜耳公司案、日本的狀告政府和綠十字公司案

我國

1985年就報(bào)道了在浙江省18例使用過進(jìn)口凝血因子VIII制劑的血友病患者中查出４例HIV抗體陽性者；

至2003年11月30日，我國的血友病患者中，已經(jīng)有62人因使用國產(chǎn)未經(jīng)病毒滅活處理的凝血因子VIII制劑感染了艾滋病病毒。

血源性凝血因子VIII傳播HIV的慘痛教訓(xùn)

62.我國為保障血液制品臨床使用安全

性已采取的措施

血液安全是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，為保障血液制品臨床使用的安全性，我國采取了下列綜合措施：

（1）1984年9月17日,中國政府發(fā)布了“關(guān)于限制進(jìn)口血液制品防止AIDS病傳入我國的通知”;

同年，血液制品病毒滅活技術(shù)的研究在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所啟動(dòng)，1992年開始實(shí)際用于凝血因子VIII濃縮制品和靜脈注射免疫球蛋白制品的生產(chǎn)。

2.我國為保障血液制品臨床使用安全

性已采取的措施

7

（2）中國從1993年開始將HIV抗體檢測和HCV抗體檢測同時(shí)列為獻(xiàn)血者篩查的必檢項(xiàng)目；并根據(jù)我國HBV的人群高攜帶率的特點(diǎn)，對(duì)于血液制品原料血漿的供漿者，供漿前需進(jìn)行乙型肝炎疫苗的免疫接種。

（2）中國從1993年開始將HIV抗體檢測和8

（3）1995年7月20日,中國衛(wèi)生部下發(fā)了“關(guān)于禁止生產(chǎn)和臨床使用未經(jīng)病毒去除或滅活的凝血因子類血液制品的通知”，使我國生產(chǎn)的血液制品的安全性得到進(jìn)一步提高。（3）1995年7月20日,中國衛(wèi)生部下發(fā)了“9

（4）1997年12月29日,“中華人民共和國獻(xiàn)血法”頒布，中國開始告別有償供血，進(jìn)入無償獻(xiàn)血的新階段。也從血液來源的層面，進(jìn)一步提高了輸血和血液制品的安全性。（4）1997年12月29日,“中華人民共和國獻(xiàn)10

因此，我國目前生產(chǎn)和使用的血液制品，在病毒安全性方面是歷史上最高的。和提供臨床使用的全血和血細(xì)胞成分相比，由于在血液制品的生產(chǎn)過程中全部采用了病毒去除和/或滅活處理的措施，有更高的安全性。

但是，和提供臨床使用的全血和血細(xì)胞成分一樣，血液制品的臨床使用至今仍不是100％安全的。

和發(fā)達(dá)國家相比，在保障血液制品臨床使用安全性所采取的措施方面，也仍有一定的差距。因此，我國目前生產(chǎn)和使用的血液制品，在病毒安113.發(fā)達(dá)國家為保障血液制品臨床

使用安全性已采取的措施

發(fā)達(dá)國家血液安全措施隨技術(shù)進(jìn)步而更新：

（1）檢測（2）血漿儲(chǔ)存（3）新病原體3.發(fā)達(dá)國家為保障血液制品臨床

使用安全性已采取的12二、基因重組血液制品臨床使用的概況

由于血源性血液制品有傳播病毒性疾病的危險(xiǎn)，而基因重組血液制品不僅純度極高，又無傳播病毒性疾病之虞，使基因重組技術(shù)生產(chǎn)血液制品這一開發(fā)領(lǐng)域十分活躍。目前，已形成商品供應(yīng)臨床使用的有凝血因子VIII、凝血因子VIIa、凝血因子IX和激活的蛋白C四種基因重組血液制品。

基因重組凝血因子VIII不僅已在臨床使用的份額上與血源性凝血因子VIII產(chǎn)品平分秋色，更可望在5年內(nèi)（至2010年）在臨床使用的份額上占主導(dǎo)地位；基因重組凝血因子VIIa則已成為非常有特色的產(chǎn)品，在臨床的使用日趨廣泛。

二、基因重組血液制品臨床使用的概況

13（一）重組人凝血因子VIII（rhFVIII）

1.凝血因子VIII的分子生物學(xué)

凝血因子VIII(FVIII)基因位于X染色體長臂(Xq28),基因長度為186kb,有26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)顯子。其mRNA長度為9kb,編碼由2351個(gè)氨基酸殘基組成的FVIII前體多肽，切除N末端由19個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽后，成熟的FVIII分子由2332個(gè)氨基酸殘基組成。

（一）重組人凝血因子VIII（rhFVIII）

1.凝血14

在血漿中，F(xiàn)VIII是由一條從C端衍生來的分子量為80kd的輕鏈(A3-C1-C2)和一條從N端衍生來的分子量為90-200kd的重鏈(A1-A2,或A1-A2-B)組成；輕、重鏈之間經(jīng)Ca2+以非共價(jià)鍵相結(jié)合。重鏈與FVIII促凝活性(FVIII:C)有關(guān)，輕鏈則對(duì)FVIII和vonWillebrand因子(vWF)的結(jié)合具有重要性。

在血漿中，F(xiàn)VIII152.基因工程FVIII制品的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用

(1)基因工程FVIII制品的生產(chǎn)

①FVIII基因在基因工程改造后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)：如美國Baxter公司選用中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)株，重組基因可同時(shí)表達(dá)重組FVIII(rFVIII)和重組vWF(rvWF)蛋白；由于vWF是rFVIII的穩(wěn)定成分，是在細(xì)胞培養(yǎng)基中生產(chǎn)rFVIII所必需的，因此生產(chǎn)細(xì)胞株本身同時(shí)表達(dá)rvWF乃是一種既經(jīng)濟(jì)又易于控制的過程。

2.基因工程FVIII制品的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用

(1)基因16②重組因子VIII(Recombinate)的制備過程

A.建立適用于生產(chǎn)的細(xì)胞庫體系，包括：主細(xì)胞庫(MCB)、工作細(xì)胞庫(WCB)、延伸細(xì)胞庫(ECB)和中間細(xì)胞庫(ICB)。

B.對(duì)WCB的細(xì)胞進(jìn)行一系列鑒定，以確保每一批都符合預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)：a.致腫瘤性;b.鑒別試驗(yàn);c.生產(chǎn)性能標(biāo)準(zhǔn);d.工作細(xì)胞庫的穩(wěn)定性。

C.重組細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng),收獲細(xì)胞懸液,經(jīng)分離、免疫親和層析、以及兩種離子交換層析的純化過程，就可獲得rFVIII制品。②重組因子VIII(Recombinate)的制備過17③rFVIII制品的質(zhì)量保證

FVIII制品的生產(chǎn)過程嚴(yán)格按GMP規(guī)定的要求執(zhí)行，質(zhì)量保證體系包括：

生產(chǎn)過程有效性驗(yàn)證，生產(chǎn)過程的監(jiān)控和取樣檢測，以及產(chǎn)品交付臨床使用前的檢測。

成品的檢測除常規(guī)的理化和生物學(xué)檢測外，還包括rFⅧ特性的確定，如用加和不加凝血酶的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)進(jìn)行多肽分析，凝血酶裂解前后的逆相高壓液相層析，F(xiàn)VIII:C測定等。

安全方面的特定檢測項(xiàng)目包括CHO蛋白、純化時(shí)使用的單克隆抗體蛋白、DNA及其他混雜物質(zhì)的殘存量測定，必需低于預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)。③rFVIII制品的質(zhì)量保證

F18(2)基因工程FVIII制品的臨床應(yīng)用

美國兩家公司(Baxter和Miles)生產(chǎn)的基因工程FVIII制品，自1988年開始臨床試驗(yàn)，1992年末至1993年初被美國食品和藥品管理署(FDA)正式批準(zhǔn)上市，供臨床治療血友病A患者出血使用。

至2004，年銷售額已達(dá)20億美元，在臨床使用的份額（提供的量）上與血源性凝血因子VIII產(chǎn)品大約各占50％。

其療效與血源性的FVIII制品無異，至今未見傳播病毒性疾病的報(bào)導(dǎo)，但產(chǎn)生抑制劑的發(fā)生率似比輸注血源性FVIII制品者稍高。(2)基因工程FVIII制品的臨床應(yīng)用

19（二）重組人凝血因子VIIa（rhFVIIa）

1.凝血因子VIIa的分子生物學(xué)和生理學(xué)

FVII是一種以單鏈前體形式存在的糖基化的維生素Ｋ依賴的絲氨酸蛋白酶，分子量為50kD，由406個(gè)氨基酸殘基組成。而具活性的FVIIa則是FVII的152位Arg和153位Ile肽鍵斷裂后形成的雙鏈分子，其輕鏈為23kD，重鏈為28kD，二者以鏈間二硫鍵相連。

（二）重組人凝血因子VIIa（rhFVIIa）

20

在凝血外源性途徑中，F(xiàn)VII占有舉足輕重的地位。

當(dāng)血管損傷后，人體內(nèi)的組織因子（TissueFactor,TF）與血液中的FVII接觸并在Ca2+參與下結(jié)合形成FVII-TF復(fù)合物，其中的FVII被激活成VIIa，血液中FVIIa含量升高后，即觸發(fā)一系列凝血反應(yīng)，達(dá)到止血效果。

在凝血外源性途徑中，F(xiàn)VII占有舉足輕重的地21血管壁損傷導(dǎo)致血液和內(nèi)皮細(xì)胞的接觸在細(xì)胞表面，F(xiàn)Xa和FVa結(jié)合TF和FVIIa復(fù)合物激活FIX和FX組織因子(TF)被暴露，并和FVIIa或FVII結(jié)合，后者隨后也被激活為FVIIa凝血外源性途徑的啟動(dòng)血管壁損傷導(dǎo)致血液在細(xì)胞表面，F(xiàn)Xa和FVaTF和FVIFXa/FVa復(fù)合物將少量凝血酶原激活成凝血酶所形成的少量凝血酶激活FVIII、FV、FXI和局部的血小板，F(xiàn)XIa進(jìn)而將FIX激活成FIXa放大相激活的血小板結(jié)合FVa、FVIIIa和FIXaFXa/FVa復(fù)合物將少所形成的少量凝血酶激活放大相激活的在激活的血小板表面，F(xiàn)VIIIa/FIXa復(fù)合物

激活FX“凝血酶爆發(fā)”導(dǎo)致纖維蛋白凝塊的形成FXa和FVa結(jié)合，將大量凝血酶原激活成凝血酶，

即“凝血酶爆發(fā)”.止血凝塊的形成在激活的血小板表面，“凝血酶爆發(fā)”導(dǎo)致纖維FXa和FVa結(jié)合2.人重組凝血因子FVIIa制品的

開發(fā)和臨床應(yīng)用

以往人們普遍認(rèn)為，血漿FVII水平升高，是除了纖維蛋白原濃度升高之外容易導(dǎo)致心、腦血管血栓性疾病的又一病危因素。

但研究表明，F(xiàn)VII-TF復(fù)合物只形成于損傷部位局部，這就可以避免全身性血栓形成的可能性。

2.人重組凝血因子FVIIa制品的

開發(fā)和臨床應(yīng)用25在應(yīng)用FVIII、FIX及凝血酶原復(fù)合物（PCC）制劑治療血友病患者的出血性疾病時(shí)，經(jīng)常遇到的問題就是抑制劑的產(chǎn)生。

臨床治療這類血友病人的方法包括：①輸注大劑量FVIII或FIX，②免疫耐受治療，③輸注豬FVIII制品，④使用PCC的凝血因子VIII抑制劑旁路活性（FactorEightInhibitorBypassActivity，

FEIBA）。

通常認(rèn)為,FVIIa在PCC的FEIBA治療中起著關(guān)鍵的作用，應(yīng)可用FVIIa代替PCC的FEIBA治療。

在應(yīng)用FVIII、FIX及凝血酶原復(fù)合物（26（1）rhFVIIa制品的開發(fā)生產(chǎn)

Hagen于1986年獲得FVII的cDNA克隆

丹麥Novo公司生產(chǎn)的rFVIIa，NovoSeven

由于rFVIIa為糖基化蛋白，且富含半胱氨酸Cys殘基，故生產(chǎn)選用的表達(dá)體系為幼年倉鼠腎細(xì)胞（babyhamsterkidneycells,BHK）。

從細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取到的是單鏈rFVII，活性僅為rFVIIa的４%。但在離子交換層析中，rFVII會(huì)被自動(dòng)激活成雙鏈的rFVIIa，激活的程度在一定程度上取決于層析介質(zhì)單位體積所吸附的FVII量，而激活的起始則源于那部分低活性的單鏈FVII。

（1）rhFVIIa制品的開發(fā)生產(chǎn)

27（2）rhFVIIa制品的臨床應(yīng)用

NovoSeven于1988年開始用于臨床

1999年美國FDA批準(zhǔn)用于有抑止劑的血友病患者

1996年，Novo公司介紹了其rFVIIa（NovoSeven）近10年的臨床應(yīng)用情況。NovoSeven為一種未添加任何人源性蛋白的凍干制劑。有279名病人（254名甲型血友病，13名乙型血友病，12名含抗FVIII抗體的非血友病人）接受了輸注治療，總共涉及出血癥狀1270次。開始主要治療腹內(nèi)及腹膜后嚴(yán)重出血病人，以后擴(kuò)大至中輕度出血患者，多數(shù)為關(guān)節(jié)出血。止血的總有效率為80%-90%,大手術(shù)的止血有效率為94％,副作用極少。

輸注劑量一般為75-100μg／kg體重，開始每2ｈ間隔給藥一次，等已達(dá)到滿意止血時(shí)，可使用維持劑量一段時(shí)間。

（2）rhFVIIa制品的臨床應(yīng)用

28

最近（2005），美國的一個(gè)研究小組發(fā)表了用NovoSeven治療315例非血友病患者的多中心結(jié)果評(píng)估報(bào)告：

37.8%患者用于預(yù)防出血[大多為臨近手術(shù)而有高度出血危險(xiǎn)，國際正?；戎担↖NR）＞1.5,或aPTT＞正常值上限2倍的患者]，62.2%患者用于出血治療。使用劑量分別為75.6μg/kg和89.4μg/kg。

rFVIIa給藥后，兩組患者的INR都顯著降低（分別從2.81±2.10降到1.34±0.64,從2.13±1.68降

到1.34±1.14);輸血和血液產(chǎn)品的使用量減少到給藥前的85.1%。

在預(yù)防出血組，只有14.3%的患者在手術(shù)后6小時(shí)內(nèi)實(shí)際發(fā)生出血。

在出血治療治療組，52.6%的患者在rFVIIa給藥后6小時(shí)內(nèi)停止出血。最近（2005），美國的一個(gè)研究小組發(fā)表29

目前，除了已廣泛用于被批準(zhǔn)的適應(yīng)證，即有凝血因子VIII或凝血因子IX抑制劑的血友病患者和先天性凝血因子VII缺乏患者的出血治療外，rFVIIa還成功試用于治療包括獲得性血友病患者、血小板病患者、肝病患者、外科和創(chuàng)傷患者的難以控制的、威脅生命的嚴(yán)重出血。成為一種非常有特色的治療各類嚴(yán)重出血的基因工程藥物。

目前，除了已廣泛用于被批準(zhǔn)的適應(yīng)證，即有30用于出血和血栓性疾病

治療的血液制品中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所王憬惺

用于出血和血栓性疾病

治療的血液制品中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所31

用于出血或血栓性

疾病治療的血液制品

及其臨床適應(yīng)癥

用于出血或血栓性

疾病治療的血液制品

32血源性血液制品

冷沉淀制品、凝血因子VIII濃縮制品、

凝血酶原復(fù)合物制品、凝血因子IX濃縮制品

纖維蛋白原制品、纖維蛋白粘合劑

抗凝血酶III、蛋白C制品

臨床使用安全性的現(xiàn)狀血源性血液制品

冷沉淀制品、凝血因子VIII濃縮制品、

凝33基因重組的血液制品

▲重組人凝血因子VIII

▲重組人凝血因子VIIa

重組人凝血因子IX

重組人激活的蛋白C

（ActivatedproteinC）

制造及臨床使用的概況

基因重組的血液制品

▲重組人凝血因子VIII

▲重組人凝血34一、血源性血液制品臨床使用安全性的現(xiàn)狀

通過血源性血液制品傳播的主要病毒

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

病毒經(jīng)血細(xì)胞傳播經(jīng)血漿和血液制品傳播

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－

HAV十十

HBV

十十

HCV十十

HIV-l

十十

HIV-2

十十

B19PV

十十

WNV

十十

SARS？？

vCJD?!?!

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－一、血源性血液制品臨床使用安全性的現(xiàn)狀

35血源性凝血因子VIII傳播HIV的慘痛教訓(xùn)

在HIV檢測技術(shù)和血液制品病毒滅活技術(shù)未被實(shí)際使用前，血友病患者面臨很高的感染艾滋病的危險(xiǎn):

法國、德國和加拿大的狀告政府案、美國的狀告拜耳公司案、日本的狀告政府和綠十字公司案

我國

1985年就報(bào)道了在浙江省18例使用過進(jìn)口凝血因子VIII制劑的血友病患者中查出４例HIV抗體陽性者；

至2003年11月30日，我國的血友病患者中，已經(jīng)有62人因使用國產(chǎn)未經(jīng)病毒滅活處理的凝血因子VIII制劑感染了艾滋病病毒。

血源性凝血因子VIII傳播HIV的慘痛教訓(xùn)

362.我國為保障血液制品臨床使用安全

性已采取的措施

血液安全是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，為保障血液制品臨床使用的安全性，我國采取了下列綜合措施：

（1）1984年9月17日,中國政府發(fā)布了“關(guān)于限制進(jìn)口血液制品防止AIDS病傳入我國的通知”;

同年，血液制品病毒滅活技術(shù)的研究在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所啟動(dòng)，1992年開始實(shí)際用于凝血因子VIII濃縮制品和靜脈注射免疫球蛋白制品的生產(chǎn)。

2.我國為保障血液制品臨床使用安全

性已采取的措施

37

（2）中國從1993年開始將HIV抗體檢測和HCV抗體檢測同時(shí)列為獻(xiàn)血者篩查的必檢項(xiàng)目；并根據(jù)我國HBV的人群高攜帶率的特點(diǎn)，對(duì)于血液制品原料血漿的供漿者，供漿前需進(jìn)行乙型肝炎疫苗的免疫接種。

（2）中國從1993年開始將HIV抗體檢測和38

（3）1995年7月20日,中國衛(wèi)生部下發(fā)了“關(guān)于禁止生產(chǎn)和臨床使用未經(jīng)病毒去除或滅活的凝血因子類血液制品的通知”，使我國生產(chǎn)的血液制品的安全性得到進(jìn)一步提高。（3）1995年7月20日,中國衛(wèi)生部下發(fā)了“39

（4）1997年12月29日,“中華人民共和國獻(xiàn)血法”頒布，中國開始告別有償供血，進(jìn)入無償獻(xiàn)血的新階段。也從血液來源的層面，進(jìn)一步提高了輸血和血液制品的安全性。（4）1997年12月29日,“中華人民共和國獻(xiàn)40

因此，我國目前生產(chǎn)和使用的血液制品，在病毒安全性方面是歷史上最高的。和提供臨床使用的全血和血細(xì)胞成分相比，由于在血液制品的生產(chǎn)過程中全部采用了病毒去除和/或滅活處理的措施，有更高的安全性。

但是，和提供臨床使用的全血和血細(xì)胞成分一樣，血液制品的臨床使用至今仍不是100％安全的。

和發(fā)達(dá)國家相比，在保障血液制品臨床使用安全性所采取的措施方面，也仍有一定的差距。因此，我國目前生產(chǎn)和使用的血液制品，在病毒安413.發(fā)達(dá)國家為保障血液制品臨床

使用安全性已采取的措施

發(fā)達(dá)國家血液安全措施隨技術(shù)進(jìn)步而更新：

（1）檢測（2）血漿儲(chǔ)存（3）新病原體3.發(fā)達(dá)國家為保障血液制品臨床

使用安全性已采取的42二、基因重組血液制品臨床使用的概況

由于血源性血液制品有傳播病毒性疾病的危險(xiǎn)，而基因重組血液制品不僅純度極高，又無傳播病毒性疾病之虞，使基因重組技術(shù)生產(chǎn)血液制品這一開發(fā)領(lǐng)域十分活躍。目前，已形成商品供應(yīng)臨床使用的有凝血因子VIII、凝血因子VIIa、凝血因子IX和激活的蛋白C四種基因重組血液制品。

基因重組凝血因子VIII不僅已在臨床使用的份額上與血源性凝血因子VIII產(chǎn)品平分秋色，更可望在5年內(nèi)（至2010年）在臨床使用的份額上占主導(dǎo)地位；基因重組凝血因子VIIa則已成為非常有特色的產(chǎn)品，在臨床的使用日趨廣泛。

二、基因重組血液制品臨床使用的概況

43（一）重組人凝血因子VIII（rhFVIII）

1.凝血因子VIII的分子生物學(xué)

凝血因子VIII(FVIII)基因位于X染色體長臂(Xq28),基因長度為186kb,有26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)顯子。其mRNA長度為9kb,編碼由2351個(gè)氨基酸殘基組成的FVIII前體多肽，切除N末端由19個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽后，成熟的FVIII分子由2332個(gè)氨基酸殘基組成。

（一）重組人凝血因子VIII（rhFVIII）

1.凝血44

在血漿中，F(xiàn)VIII是由一條從C端衍生來的分子量為80kd的輕鏈(A3-C1-C2)和一條從N端衍生來的分子量為90-200kd的重鏈(A1-A2,或A1-A2-B)組成；輕、重鏈之間經(jīng)Ca2+以非共價(jià)鍵相結(jié)合。重鏈與FVIII促凝活性(FVIII:C)有關(guān)，輕鏈則對(duì)FVIII和vonWillebrand因子(vWF)的結(jié)合具有重要性。

在血漿中，F(xiàn)VIII452.基因工程FVIII制品的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用

(1)基因工程FVIII制品的生產(chǎn)

①FVIII基因在基因工程改造后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)：如美國Baxter公司選用中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)株，重組基因可同時(shí)表達(dá)重組FVIII(rFVIII)和重組vWF(rvWF)蛋白；由于vWF是rFVIII的穩(wěn)定成分，是在細(xì)胞培養(yǎng)基中生產(chǎn)rFVIII所必需的，因此生產(chǎn)細(xì)胞株本身同時(shí)表達(dá)rvWF乃是一種既經(jīng)濟(jì)又易于控制的過程。

2.基因工程FVIII制品的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用

(1)基因46②重組因子VIII(Recombinate)的制備過程

A.建立適用于生產(chǎn)的細(xì)胞庫體系，包括：主細(xì)胞庫(MCB)、工作細(xì)胞庫(WCB)、延伸細(xì)胞庫(ECB)和中間細(xì)胞庫(ICB)。

B.對(duì)WCB的細(xì)胞進(jìn)行一系列鑒定，以確保每一批都符合預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)：a.致腫瘤性;b.鑒別試驗(yàn);c.生產(chǎn)性能標(biāo)準(zhǔn);d.工作細(xì)胞庫的穩(wěn)定性。

C.重組細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng),收獲細(xì)胞懸液,經(jīng)分離、免疫親和層析、以及兩種離子交換層析的純化過程，就可獲得rFVIII制品。②重組因子VIII(Recombinate)的制備過47③rFVIII制品的質(zhì)量保證

FVIII制品的生產(chǎn)過程嚴(yán)格按GMP規(guī)定的要求執(zhí)行，質(zhì)量保證體系包括：

生產(chǎn)過程有效性驗(yàn)證，生產(chǎn)過程的監(jiān)控和取樣檢測，以及產(chǎn)品交付臨床使用前的檢測。

成品的檢測除常規(guī)的理化和生物學(xué)檢測外，還包括rFⅧ特性的確定，如用加和不加凝血酶的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)進(jìn)行多肽分析，凝血酶裂解前后的逆相高壓液相層析，F(xiàn)VIII:C測定等。

安全方面的特定檢測項(xiàng)目包括CHO蛋白、純化時(shí)使用的單克隆抗體蛋白、DNA及其他混雜物質(zhì)的殘存量測定，必需低于預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)。③rFVIII制品的質(zhì)量保證

F48(2)基因工程FVIII制品的臨床應(yīng)用

美國兩家公司(Baxter和Miles)生產(chǎn)的基因工程FVIII制品，自1988年開始臨床試驗(yàn)，1992年末至1993年初被美國食品和藥品管理署(FDA)正式批準(zhǔn)上市，供臨床治療血友病A患者出血使用。

至2004，年銷售額已達(dá)20億美元，在臨床使用的份額（提供的量）上與血源性凝血因子VIII產(chǎn)品大約各占50％。

其療效與血源性的FVIII制品無異，至今未見傳播病毒性疾病的報(bào)導(dǎo)，但產(chǎn)生抑制劑的發(fā)生率似比輸注血源性FVIII制品者稍高。(2)基因工程FVIII制品的臨床應(yīng)用

49（二）重組人凝血因子VIIa（rhFVIIa）

1.凝血因子VIIa的分子生物學(xué)和生理學(xué)

FVII是一種以單鏈前體形式存在的糖基化的維生素Ｋ依賴的絲氨酸蛋白酶，分子量為50kD，由406個(gè)氨基酸殘基組成。而具活性的FVIIa則是FVII的152位Arg和153位Ile肽鍵斷裂后形成的雙鏈分子，其輕鏈為23kD，重鏈為28kD，二者以鏈間二硫鍵相連。

（二）重組人凝血因子VIIa（rhFVIIa）

50

在凝血外源性途徑中，F(xiàn)VII占有舉足輕重的地位。

當(dāng)血管損傷后，人體內(nèi)的組織因子（TissueFactor,TF）與血液中的FVII接觸并在Ca2+參與下結(jié)合形成FVII-TF復(fù)合物，其中的FVII被激活成VIIa，血液中FVIIa含量升高后，即觸發(fā)一系列凝血反應(yīng)，達(dá)到止血效果。

在凝血外源性途徑中，F(xiàn)VII占有舉足輕重的地51血管壁損傷導(dǎo)致血液和內(nèi)皮細(xì)胞的接觸在細(xì)胞表面，F(xiàn)Xa和FVa結(jié)合TF和FVIIa復(fù)合物激活FIX和FX組織因子(TF)被暴露，并和FVIIa或FVII結(jié)合，后者隨后也被激活為FVIIa凝血外源性途徑的啟動(dòng)血管壁損傷導(dǎo)致血液在細(xì)胞表面，F(xiàn)Xa和FVaTF和FVIFXa/FVa復(fù)合物將少量凝血酶原激活成凝血酶所形成的少量凝血酶激活FVIII、FV、FXI和局部的血小板，F(xiàn)XIa進(jìn)而將FIX激活成FIXa放大相激活的血小板結(jié)合FVa、FVIIIa和FIXaFXa/FVa復(fù)合物將少所形成的少量凝血酶激活放大相激活的在激活的血小板表面，F(xiàn)VIIIa/FIXa復(fù)合物

激活FX“凝血酶爆發(fā)”導(dǎo)致纖維蛋白凝塊的形成FXa和FVa結(jié)合，將大量凝血酶原激活成凝血酶，

即“凝血酶爆發(fā)”.止血凝塊的形成在激活的血小板表面，“凝血酶爆發(fā)”導(dǎo)致纖維FXa和FVa結(jié)合2.人重組凝血因子FVIIa制品的

開發(fā)和臨床應(yīng)用

以往人們普遍認(rèn)為，血漿FVII水平升高，是除了纖維蛋白原濃度升高之外容易導(dǎo)致心、腦血管血栓性疾病的又一病危因素。

但研究表明，F(xiàn)VII-TF復(fù)合物只形成于損傷部位局部，這就可以避免全身性血栓形成的可能性。

2.人重組凝血因子FVIIa制品的

開發(fā)和臨床應(yīng)用55在應(yīng)用FVIII、FIX及凝血酶原復(fù)合物（PCC）制劑治療血友病患者的出血性疾病時(shí)，經(jīng)常遇到的問題就是抑制劑的產(chǎn)生。

臨床治療這類血友病人的方法包括：①輸注大劑量FVIII或FIX，②免疫耐受治療，③輸注豬FVIII制品，④使用PCC的凝血因子VIII抑制劑旁路活性（FactorEightInhibitorBypassActivi