不同強(qiáng)度經(jīng)顱直流電刺激對(duì)帕金森大鼠旋轉(zhuǎn)行為學(xué)的影響

12/12不同強(qiáng)度經(jīng)顱直流電刺激對(duì)帕金森大鼠旋轉(zhuǎn)行為學(xué)的影響*蔣巍巍，田學(xué)隆，李一言，錢龍，俞雪鴻EffectsoftranscranialdirectcurrentstimulationonpraxiologyofparkinsonratwithdifferentintensitiesJiangWeiwei,TianXuelong,LiYiyan,QianLong,YuXuehong*基金資助：第四屆國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)課題(101061138)作者單位：重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶市400030BioengineeringCollegeofChongqingUniversity,Chongqing400030蔣巍巍，男，1991年生，重慶豐都，重慶大學(xué)在讀本科生。主要從事生物醫(yī)學(xué)信息檢測(cè)的研究。電話E-mail:20087123@Correspondingauthor:JiangWeiwei,20087123@,doudouxiaobei@田學(xué)隆，男,1957年生，重慶市，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事生物醫(yī)學(xué)信息檢測(cè)與儀器等方面的研究。電話E-mail:xltian@中圖分類號(hào)：Q-31摘要目的研究不同強(qiáng)度經(jīng)顱直流電刺激（TranscranialDirectCurrentStimulation，tDCS）對(duì)帕金森?。≒arkinson'sdisease，PD)大鼠旋轉(zhuǎn)行為學(xué)的影響。方法根據(jù)完全隨機(jī)原則，將成功的32例PD大鼠隨機(jī)分成3個(gè)刺激組和1個(gè)對(duì)照組，每組8只PD大鼠。給予3個(gè)刺激組的左側(cè)初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層（M1）區(qū)直流電強(qiáng)度分別為20μA、80μA、200μA（電流密度分別為6.36A/㎡，25.48A/㎡，63.70A/㎡）的陽極刺激,給予對(duì)照組假刺激，刺激時(shí)間持續(xù)30min。tDCS后，對(duì)PD大鼠腹腔注射阿樸嗎啡（Apomorphine，APO），記錄PD大鼠旋轉(zhuǎn)的潛伏期、持續(xù)時(shí)間和平均轉(zhuǎn)速(30min內(nèi))，采用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果刺激后，刺激組和對(duì)照組的平均轉(zhuǎn)速組間存在顯著差異性(P<0.05)。刺激組與對(duì)照組的潛伏期和持續(xù)時(shí)間組間不存在顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論tDCS的合適強(qiáng)度為80μA左右，因?yàn)榇碳?qiáng)度再加大至200μA后，平均轉(zhuǎn)速的數(shù)值雖有變化，但和80μA刺激組間無顯著性差異（P>0.05）。關(guān)鍵字經(jīng)顱直流電刺激（tDCS）；帕金森病(PD)；旋轉(zhuǎn)行為；動(dòng)物模型AbstractObjective:DiscusstheefficacywhendifferentintensityTranscranialDirectCurrentStimulation(tDCS)onParkinsondisease(PD)rats.Methods:Accordingtocompletelyrandomprinciple,32successfulmodelswereevenlydividedinto4groupsincluding1controlgroupand3tDCSgroup.Inthisexperiment,weweregivenanodaltDCSgroupsreceivedsinglestimulationat20μA,80μA,200μA(currentdensityis6.36A/㎡，25.48A/㎡，63.70A/㎡)forupto30minoverprimarymotorcortex,whiledidn'tapplytDCSinthecontrolgroup.Afterstimulating,eachratwasassessedeffectsofapomorphineonrevolvingbehavior,thenwerecordthelatency,theduration,theaveragespeed,statisticalanalysiswasdoneatlast.Results：Afterstimulating,itwasfoundthattDCScanleadtostatisticallysignificantdecreaseofaveragespeedinPDrats(P<0.05).However,nosignificantchangeswerefoundinlatencyandduration(P>0.05).Conclusion:80μAtDCSmaybeanappropriateroleonimprovementofrats’movement.Becausewhenincreasetheintensityto200μA,theaveragespeedchanges,buttheredoesn’texistsignificanttimeeffectsondecreasingaveragespeedbetweentDCSgroupgroupsandcontrolgroups.KeyWords:TranscranialDirectCurrentStimulation,ParkinsonDisease,RotationalBehavior,AnimalModelsSupportedbythefourthinnovativeexperimentalsubjectsofChina(101,061,138)0.引言tDCS作為一種無創(chuàng)、無痛的皮層刺激方式,通過在靶位置施加一定強(qiáng)度的弱電流，從而極化局部大腦區(qū)域，引起皮層興奮性可逆的改變，調(diào)節(jié)大腦皮層的功能[1]；同時(shí)調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)康復(fù)活動(dòng)，緩解視覺病患者的疲勞和不適[2]；另外還有輔助治療厭食癥的功能[3]。DavidBenninger[4]等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過重復(fù)tDCS之后，患者的步態(tài)在短時(shí)間內(nèi)得到有效提高、上肢的遲緩程度在3個(gè)多月的時(shí)間里的有一定好轉(zhuǎn)，并且統(tǒng)一帕金森病評(píng)定量表、反映時(shí)間和生理心理的綜合評(píng)分都得到了提高。FelipeFregni等人[5]的實(shí)驗(yàn)顯示，陽極刺激M1后，被刺激的受試者相對(duì)于假手術(shù)組的受試者的運(yùn)動(dòng)功能得到了顯著改善。另外PauloBoggio[6]等采用2mA和1mA的陽極經(jīng)顱直流電刺激初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層(M1)和左背外側(cè)前額葉皮層（LDLPFC），發(fā)現(xiàn)2mA刺激組的患者的工作記憶能力顯著提高。我們的研究與以往最大區(qū)別是較好地解決了電極固定在自由活動(dòng)動(dòng)物身上的問題，同時(shí)研究大量的PD大鼠模型，分析刺激后PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為學(xué)的變化，試圖探究tDCS對(duì)帕金森病的改善機(jī)制。1.材料和方法1.1動(dòng)物及材料健康雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重180–260g，鼠齡為60–80d，中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供；6-OHDA（美國(guó)Sigma公司）；Apomorphine(APO)（美國(guó)Sigma公司）；大鼠腦立體定位儀（成都儀器廠）；牙科鉆；抗壞血酸（美國(guó)Sigma公司）。1.2方法實(shí)驗(yàn)采用單側(cè)注射6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）制備PD大鼠模型。術(shù)前給大鼠注射APO確認(rèn)其無旋轉(zhuǎn)行為。采用GeorgePaxinos[7]等所著大鼠腦立體定向圖譜，采用黑質(zhì)致密部（SNC）和腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）兩點(diǎn)注射法[8]：對(duì)PD大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.5ml/100g）麻醉。頭顱水平位固定在大鼠腦立體定位儀上，保證前囟和后囟處于同一水平面。剃除大鼠頭部毛發(fā)，手術(shù)區(qū)消毒3次，于顱中部正中切開頭皮和筋膜，切口長(zhǎng)度1.5cm左右，剝離骨膜，使前囟充分暴露，確定左側(cè)SNC、VTA三維坐標(biāo)位置。左側(cè)SNC區(qū)坐標(biāo):前囟后5.6mm,中線左側(cè)1.7mm,硬膜下7.8mm；左側(cè)VTA區(qū)坐標(biāo):前囟后5.0mm,中線左側(cè)0.9mm,硬膜下7.8mm。標(biāo)記坐標(biāo)后使用牙科鉆鉆透顱骨，用微量注射器抽取2ug/μL的6-OHDA溶液（含0.2%VitC的生理鹽水）每點(diǎn)注射4uL。注射進(jìn)針?biāo)俣葹?uL/min，注射完畢停針10min。按1.0mm/min速度緩慢拔針，最后縫合皮膚、筋膜。1.3旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測(cè)術(shù)后4周進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，應(yīng)用腹腔注射阿樸嗎啡（0.5mg/kg體重），觀察其旋轉(zhuǎn)行為變化。若大鼠旋轉(zhuǎn)時(shí)，首尾相接并恒定轉(zhuǎn)向右側(cè)，且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)大于210r/30min，則視為成功PD大鼠模型。1.4動(dòng)物分組共成功造模32只PD大鼠，完全隨機(jī)分為4組，每組8只，3實(shí)驗(yàn)組和1對(duì)照組。1.5經(jīng)顱直流電刺激實(shí)驗(yàn)采用底面直徑為2mm的圓柱形塑料小管，管內(nèi)填充0.9%生理鹽水浸泡的棉花制作成刺激電極（接觸面積為3.14mm2），手術(shù)后使用牙科水泥固定在大鼠的左側(cè)M1區(qū)。參考電極的接觸面積為10cm2，通過一件由橡膠制成的緊身衣固定于胸腹部。為防止電流的中斷，刺激時(shí)用生理鹽水不斷地浸濕電極。電極在帕金森大鼠身上固定的示意圖見圖1。圖1：電極在帕金森大鼠身上固定的示意圖Image1:TheschematicoftheelectrodesfixedontothePDrat分別給予實(shí)驗(yàn)組20μA、80μA、200μA的直流電刺激；在相同環(huán)境下，給予對(duì)照組30s的直流電刺激后便不給予直流電刺激的假刺激。刺激時(shí)保證大鼠處于自由清醒狀態(tài)。1.6刺激后旋轉(zhuǎn)行為檢測(cè)刺激結(jié)束后，對(duì)PD大鼠腹腔注射APO，記錄大鼠潛伏期、持續(xù)時(shí)間和平均轉(zhuǎn)速(30min內(nèi))，觀察大鼠旋轉(zhuǎn)過程中行為學(xué)的變化。1.7染色制片方法取得潔凈的大鼠大腦，使用50ml的10％甲醛固定大鼠大腦24h，然后用30％的蔗糖溶液浸泡之后，先后置于30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇浸泡4h脫水，使用1：1的二甲苯無水乙醇過度后用二甲苯透明置換，再使用1:1的二甲苯石蠟過度，在不高于56°的石蠟液體中浸泡4次，每次30min，包埋后，使用石蠟切片機(jī)片，切片厚度為40um。然后貼片于載玻片上，置于烘箱中烘干。使用蘇木精-伊紅染色，成功之后自然晾干后封藏。1.8統(tǒng)計(jì)方法本實(shí)驗(yàn)所有結(jié)果用x±s表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。對(duì)于tDCS刺激前后的旋轉(zhuǎn)參數(shù)，利用單因素方差分析(One-wayANOVA)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，置信區(qū)間為0.95。2.結(jié)果2.1經(jīng)顱直流電刺激給予參照組假刺激，分別給予刺激組PD大鼠20μA、80μA和200μA的tDCS，刺激完畢5min，注射APO，記錄其旋轉(zhuǎn)行為。實(shí)驗(yàn)刺激前后各組旋轉(zhuǎn)參數(shù)的記錄見表1。表1：不同強(qiáng)度tDCS作用下各組大鼠旋轉(zhuǎn)行為的比較Tab1:Comparisonoftherotationalbehavioroftheratsineachgroupwithdifferentcurrentintensities分組對(duì)照組20μA刺激組80μA刺激組200μA刺激組tDCS潛伏期(min)3.5±0.423.82±0.743.62±0.583.64±0.82作用前持續(xù)時(shí)間(min)58.72±6.4457.96±4.1657.95±5.2254.20±4.92平均轉(zhuǎn)速(r/min)9.63±1.5310.12±1.549.62±1.5810.07±1.48tDCS潛伏期(min)4.66±0.545.14±0.815.02±0.624.82±0.73作用后持續(xù)時(shí)間(min)55.72±4.8351.66±3.1754.02±8.3853.1±4.32平均轉(zhuǎn)速(r/min)9.48±1.328.38±1.447.03±1.20★■6.28±0.86★■★：與對(duì)照組比較P<0.05；■：與20μA刺激組比較P<0.05；2.2刺激前后PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為學(xué)的變化分別做出刺激前后PD大鼠的潛伏期、持續(xù)時(shí)間和平均轉(zhuǎn)速的交互式線條圖為圖2、圖3、圖4。刺激前后各組各項(xiàng)參數(shù)的差異性分析如下：⑴刺激后各組間的潛伏期均不存在顯著性的差異（P>0.05）。由圖2分析而得：對(duì)照組，20μA刺激組，80μA刺激組，200μA刺激組刺激前的潛伏期為3.6min左右。刺激后的潛伏期數(shù)值相比刺激前均有所上升，其中80μA刺激組上升幅度最大從刺激前的3.62min到5.02min。圖中誤差線為刺激前后各個(gè)組潛伏期的標(biāo)準(zhǔn)差值。圖2：不同強(qiáng)度tDCS前后各組PD大鼠潛伏期的變化ThelatencychangesofthePDratsineachgroupbeforeandaftertDCSwithdifferentcurrentintensities.⑵由圖3分析而得：刺激后各組的持續(xù)時(shí)間較刺激前均有所下降，其中20μA刺激組的持續(xù)時(shí)間減少得最多，從57.96min減少到51.66min，與刺激之前不存在顯著性差異（P>0.05）。刺激后各組的持續(xù)時(shí)間均不存在顯著性差異（P>0.05）。圖中誤差線為刺激前后各個(gè)組持續(xù)時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差值。圖3：不同強(qiáng)度tDCS前后各組PD大鼠持續(xù)時(shí)間的變化ThedurationchangesofPDratsineachgroupbeforeandaftertDCSwithdifferentintensities.⑶由圖4可知，刺激前各組的平均轉(zhuǎn)速都約為10r/min（P>0.05）。分別給予不同強(qiáng)度刺激后，20μA刺激組、80μA刺激組、200μA刺激組的平均轉(zhuǎn)速分別下降到8.38r/min，7.03r/min和6.28r/min。刺激后20μA刺激組和對(duì)照組不存在顯著性差異（P>0.05）；80μA刺激組和200μA刺激組與對(duì)照組之間的存在顯著性差異（P<0.05）；但是200μA刺激組與80μA刺激組卻不存在顯著性差異（P>0.05）。自1998年以來tDCS在帕金森患者身上的應(yīng)用近100例，大多數(shù)研究者選擇的電流密度為0.57A/㎡或者0.29A/㎡，本已遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于本實(shí)驗(yàn)的電流密度（20μA、80μA、200μA的電流密度分別為6.36A/㎡，25.48A/㎡，63.70A/㎡）。80μA的刺激對(duì)PD大鼠有效，增大到200μA后改組PD大鼠與80μA刺激組無顯著性差異（P>0.05）。顯然，80μA的tDCS更有意義。圖中誤差線為刺激前后各個(gè)組平均轉(zhuǎn)速的標(biāo)準(zhǔn)差值。圖4：不同強(qiáng)度tDCS前后各組PD大鼠平均轉(zhuǎn)速的變化TheaveragespeedchangesofthePDratsineachgroupbeforeandaftertDCSwithdifferentintensities.2.3PD大鼠的M1區(qū)切片為了觀察刺激對(duì)PD大鼠運(yùn)動(dòng)皮層的影響，取對(duì)照組和200μA刺激組的PD大鼠大腦分別染色制片，觀察M1區(qū)的變化，見圖5、圖6。由圖觀察不到諸如水腫、壞死、血腫和細(xì)胞的改變。圖5：對(duì)照組PD大鼠的M1區(qū)圖6：200μA刺激組PD大鼠的M1區(qū)3.討論3.1PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為的機(jī)制制作PD大鼠模型時(shí)，將6-OHDA微量注射于左側(cè)SNC和VTA，使VTA的多巴胺能神經(jīng)纖維發(fā)生退行性病變，從而使左側(cè)紋狀體內(nèi)多巴胺(dopamine，DA)含量明顯下降，使該側(cè)紋狀體內(nèi)多巴胺D2受體數(shù)量和敏感性隨自身調(diào)節(jié)而顯著增加，導(dǎo)致兩側(cè)多巴胺受體不平衡。當(dāng)注射APO時(shí)，其便與損毀側(cè)紋狀體內(nèi)大量增加的多巴胺D2受體結(jié)合，導(dǎo)致其呈致敏現(xiàn)象，即可使大鼠產(chǎn)生不對(duì)稱行為，引起動(dòng)物向健側(cè)發(fā)生旋轉(zhuǎn)[9]。3.2tDCS的影響機(jī)制最近，一些tDCS的影響機(jī)制已經(jīng)被提出。Ardolino等人[10]發(fā)現(xiàn)tDCS的后效有一個(gè)基于神經(jīng)細(xì)胞膜功能的變化的非突觸原理。Nitsche等人[11]揭示了長(zhǎng)期持久的tDCS后效與取決于刺激的極性的NMDA受體活動(dòng)的增強(qiáng)與削弱有關(guān)。直接電流刺激改變了受體靜息膜電位改變。BesanconE[12]和ManningSM[13]的研究表明，多種渠道包括谷氨酸及NMDA受體與細(xì)胞死亡有關(guān)，而且NMDA受體阻斷劑減輕中風(fēng)模型大鼠的腦白質(zhì)損傷?？紤]到tDCS可能會(huì)影響NMDA受體激動(dòng)劑或拮抗劑的療效，tDCS可能通過調(diào)制NMDA受體影響腦白質(zhì)從而產(chǎn)生對(duì)中風(fēng)急性期缺血性損傷的保護(hù)。盡管tDCS對(duì)PD患者的運(yùn)動(dòng)功能具有康復(fù)作用，但是目前關(guān)于tDCS在PD大鼠上的實(shí)驗(yàn)并不多見，tDCS的作用機(jī)制也尚不完全清楚。在正常強(qiáng)度下tDCS對(duì)PD是有改善作用而且有一定時(shí)間的后效。Nitsche和Paulus就發(fā)現(xiàn)增加電流密度或刺激的持續(xù)時(shí)間，將得到更持久和更強(qiáng)的影響效果。但是由于電流密度的增加會(huì)增加皮膚疼痛的感覺，因?yàn)殡娏髅芏仍酱?，有效電?chǎng)的穿透深度越大，如果是想延長(zhǎng)tDCS的影響時(shí)間，建議增加刺激持續(xù)時(shí)間和不改變電流密度[14][15][16]。3.3tDCS的安全性整個(gè)刺激過程PD大鼠表現(xiàn)得非常安靜，DavidLiebetanz[17]使用陰極直流電刺激大鼠探究安全性時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)刺激電流密度達(dá)到142.9A/㎡，或刺激電荷密度為85714C/㎡時(shí)，對(duì)大鼠大腦會(huì)造成損傷。3.4tDCS的應(yīng)用意義以及對(duì)帕金森病的治療前景帕金森病是一種常見的神經(jīng)損傷類疾病，主要病理改變是位于中腦的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性或缺失，使得合成的多巴胺減少，抑制乙酰膽堿的功能降低，乙酰膽堿的興奮作用相對(duì)增強(qiáng)。兩者失衡的結(jié)果便導(dǎo)致患者出現(xiàn)靜止性震顫、僵化、動(dòng)作遲緩與姿勢(shì)不穩(wěn)定等癥狀。tDCS用于治療帕金森病的現(xiàn)狀如下：一是帕金森病患者樣本量小，PauloBoggio[6]和FelipeFregni[5]的受試者分別只有18人和17人；二是無法在自由活動(dòng)的動(dòng)物上固定好電極等原因，關(guān)于PD動(dòng)物模型的研究也很少；三是tDCS的作用機(jī)制尚不完全清楚?；谝陨显颍M管經(jīng)顱直流電刺激近年取得了一些令人鼓舞的研究成果，該方法一直未獲得在臨床的普及。tDCS與藥物治療相比，可能有較少的不利影響，尤其是運(yùn)動(dòng)障礙，運(yùn)動(dòng)波動(dòng)和磨損現(xiàn)象。tDCS和rTMS相比有優(yōu)勢(shì)，tDCS提供了可靠的假刺激的條件，而且可能會(huì)導(dǎo)致更持久的調(diào)節(jié)作用，皮質(zhì)功能，并易于管理和執(zhí)行。tDCS已作為一種非侵入性工具來調(diào)節(jié)皮質(zhì)功能。雖然tDCS可能具有以下副作用，如頭痛，頭暈，惡心，瘙癢感以及對(duì)皮膚的刺痛感，但tDCS卻可以與藥物治療相結(jié)合，這可能會(huì)比其他神經(jīng)刺激試驗(yàn)技術(shù)如經(jīng)顱磁刺激的功效更好。然而對(duì)于臨床適應(yīng)性，tDCS還需要更穩(wěn)定、更強(qiáng)、更多的刺激。即使現(xiàn)在仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段，但是隨著tDCS在動(dòng)物身上的實(shí)驗(yàn)進(jìn)度加快、研究進(jìn)一步的加深，未來tDCS必定造福于人類。（感謝田學(xué)隆導(dǎo)師對(duì)本文的悉心指導(dǎo)，感謝李一言師兄的幫助，感謝錢龍、俞雪鴻等同學(xué)的合作，感謝中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)溫惠中對(duì)實(shí)驗(yàn)的支持。）4參考文獻(xiàn)[1]HummelFC,CohenLG.Non-invasivebrainstimulation:anewstrategytoimpro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