第三章微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)課件

第一節(jié)菌種選育生物制藥工藝學

第三章微生物制藥技術(shù)工藝基礎(chǔ)生物制藥工藝學第三章微生物制藥技術(shù)工藝基礎(chǔ)1一、微生物的遺傳和變異

遺傳—保持物種的相對穩(wěn)定性變異—促使新性狀的產(chǎn)生、獲得新的優(yōu)良品種遺傳型變異：在遺傳物質(zhì)水平上發(fā)生了改變，從而引起某些相應性狀發(fā)生改變的特性

變異性表型變異：微生物在生活條件發(fā)生改變時，發(fā)生暫時的形態(tài)、生理等特性的改變，但隨著環(huán)境條件的復原，它們又恢復了原有的特性一、微生物的遺傳和變異遺傳—保持物種的相對穩(wěn)定性2（一）基因突變基因突變是指遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）中的核苷酸順序發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的變化，主要包括點突變和染色體畸變兩大類。1、點突變是由于DNA鏈上的一對或少數(shù)幾對堿基發(fā)生改變引起的。2、染色體畸變是指DNA大段變化（損傷）的現(xiàn)象，主要包括染色體結(jié)構(gòu)上的變化和染色體數(shù)目的變化。（二）基因重組

指兩個或多個不同性狀個體的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一個體細胞內(nèi)，經(jīng)重新組合后，造成菌種變異，形成新的遺傳型個體。

（一）基因突變3二、菌種選育的經(jīng)典方法

1、自然選育是一種純種選育的方法。它利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過分離，篩選排除衰變型菌落，從中選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株。特點：（1）能純化、復壯菌種，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高平均生產(chǎn)水平。（2）難以選育高產(chǎn)突變菌株，不能使生產(chǎn)水平大幅度提高。二、菌種選育的經(jīng)典方法1、自然選育42、誘變育種誘變育種是指人工有意識地將生物體暴露于物理的、化學的或生物的一種或多種誘變因子中，促使生物體發(fā)生突變，進而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程。特點：與自然選育比較，由于引進了誘變劑處理，因而加速了菌種突變的頻率，擴大了變異的幅度，從而提高了獲得優(yōu)良特性的突變株的幾率。2、誘變育種5

物理誘變劑：紫外線、x射線、Y射線、快中子、β射線、超聲波、激光誘變劑化學誘變劑：氮芥、乙烯亞胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亞硝基胍、亞硝基甲基脲、亞硝酸生物誘變劑：噬菌體物理誘變劑：紫外線、x6三、現(xiàn)代菌種選育技術(shù)1、雜交育種：

指兩個基因型不同的菌株通過接合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離，篩選出具有新性狀的菌株。優(yōu)點：能集中位于不同品種中的優(yōu)良性狀。缺點：只能利用已有的基因組，并不能產(chǎn)生新的基因。雜交進程緩慢，過程繁瑣。三、現(xiàn)代菌種選育技術(shù)1、雜交育種：

指兩個基因型不同的菌株72、原生質(zhì)體融合

用脫壁酶處理將微生物細胞壁除去，制成原生質(zhì)體，再用融合劑（如聚乙二醇）促進原生質(zhì)體發(fā)生融合，從而獲得融合子，這一技術(shù)叫原生質(zhì)體融合。

細胞（A+B—）

細胞（A—B+）

脫壁處理

脫壁處理

原生質(zhì)體（A+B—）

原生質(zhì)體（A—B+）

混合

加融合劑

原生質(zhì)體融合

涂平板（原生質(zhì)體再生）

形成菌落

檢出重組子菌落（A+B+）

2、原生質(zhì)體融合

用脫壁酶處理將微生物細胞壁除去，制成原生83、基因工程（基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)）是指按照人的意志，將某一生物體(供體)的遺傳信息在體外經(jīng)人工與載體相接(重組)，構(gòu)成重組DNA分子，然后轉(zhuǎn)入另一生物體(受體)細胞中，使被引進的外源DNA片段在后者內(nèi)部得以表達和遺傳。研究和開發(fā)的趨勢有：1.基因克隆產(chǎn)生雜合抗生素。（一旦取得了抗生素的結(jié)構(gòu)基因，將基因片段送入特定性質(zhì)的另一種抗生素產(chǎn)生菌中，即可能產(chǎn)生完全符合人們設(shè)計的新抗生素。）

2.基因重組獲得新抗生素。

（通過兩種基因型不同的菌株結(jié)合，使遺傳物質(zhì)重新組合，從中篩選具有新性狀的菌株，其中可能有原抗生素高產(chǎn)株，也可能有產(chǎn)生新抗生素的子株。）3、基因工程（基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)）9第二節(jié)菌種保藏

定義：將有用的微生物以特定培養(yǎng)形態(tài)在特定的環(huán)境條件下存放，以保持種的存活、純粹和遺傳性狀的穩(wěn)定。條件及原理：1.

低營養(yǎng)2.

干燥3.隔氧4.低溫降低代謝速率或使細胞處于休眠狀態(tài)第二節(jié)菌種保藏定義：降低代謝速率或使細胞處于休眠狀態(tài)10一、定期移植保藏法

（斜面低溫保藏法）1．原理制造低溫環(huán)境，降低菌種的新陳代謝活動能力。2、方法將菌種接種于所要求的培養(yǎng)基上、置最適溫度下培養(yǎng)，待得到健壯的菌體后，放在4℃左右，濕度小于70％的條件下保藏．每間隔一定時間重新移植培養(yǎng)1次。一、定期移植保藏法（斜面低溫保藏法）1．原理113、特點（1）此法廣泛適用于各大類微生物菌種的短期保藏，一般可保存1～6個月左右。（2）優(yōu)點：簡便易行，容易推廣，存活率高；缺點：菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。3、特點12二、石蠟油封藏法1、原理用液體石蠟防止或減少培養(yǎng)基內(nèi)水分蒸發(fā)，隔絕培養(yǎng)物與氧的接觸，降低微生物的代謝活動，推遲細胞老化，延長保存時間。2、方法在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，石蠟油層高出斜面頂端1cm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。二、石蠟油封藏法1、原理133、特點（1）此法廣泛適用于各大類微生物菌種的中期保藏，一般可保存1～2年左右。石蠟油管的轉(zhuǎn)接和搬運不方便。（2）不適用于保藏某些能分解烴類的菌種。3、特點14三、砂土管保藏法1、原理低溫、干燥、隔氧和無營養(yǎng)物2、方法將砂與土分別洗凈、烘干、過篩，按一定比例分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，121℃蒸汽滅菌1～1.5h，間歇滅菌3次。50℃烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。將待保藏的菌株制成菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約2～4h，用火焰熔封管口（或用石蠟封口），置于干燥器中，在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。三、砂土管保藏法1、原理153、特點（1）適用于產(chǎn)孢子的微生物及形成芽孢的細菌，對于一些對干燥敏感的細菌及酵母則不適用。（2）保藏期較長，約1～10年。效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟簡便。3、特點16四、麩皮保藏法1、原理以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存。2、方法將麩皮與水以一定的比例拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經(jīng)冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子長成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。四、麩皮保藏法1、原理173、特點（1）此法適用于產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。（2）操作簡單、經(jīng)濟實惠，工廠較多采用。3、特點18五、冷凍真空干燥保藏法（凍干法）1、原理在較低的溫度下（一15℃以下），快速地將細胞凍結(jié)，并且保持細胞完整，然后在真空中使水分升華。經(jīng)過冷凍干燥的微生物的生長和代謝活動處于極低水平，不易發(fā)生變異或死亡，因此菌種可以保存很長時間。2、方法將準備保存的新鮮斜面菌種，在無菌條件下，裝入滅菌的保護劑（常用脫脂牛奶和血清），制成菌懸液，再用無菌帶橡皮頭的滴管將菌懸液分裝到準備好的安瓿管中，-35℃下預凍15min一2h，然后進行真空于燥，最后將安瓿管真空熔封，低溫避光保存。五、冷凍真空干燥保藏法（凍干法）1、原理193、特點（1）此法適用于各大類微生物。（2）此法的主要保藏措施是低溫、干燥、缺氧、有保護劑，保藏期一般長達5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。（3）該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機等設(shè)備。3、特點20六、液氮超低溫保藏法1、原理微生物在－130℃的低溫下，所有的代謝活動暫時停止而生命延續(xù)，微生物菌種得以長期保存?？赏ㄟ^加入保護劑來降低細胞內(nèi)溶液的冰點，減少冰晶對細胞的傷害。

2、方法取合適的培養(yǎng)物，以5～10％的甘油或二甲亞砜制成孢子懸液或菌懸液。將此懸液注入無菌的安瓿管或聚丙烯小管內(nèi)，密封，在液氮超低溫（－196℃）下保藏。六、液氮超低溫保藏法1、原理213、特點（1）適用于各種微生物菌種的保藏。（2）保藏期一般可達到15年以上，是目前公認的最有效的菌種長期保藏技術(shù)之一。（3）優(yōu)點：操作簡便、高效，且可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進行保藏。缺點：需購置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費用較高。3、特點22第三節(jié)

培養(yǎng)基第三節(jié)

培養(yǎng)基23一、培養(yǎng)基組成與成分人工配制的適合于不同微生物生長、繁殖和積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。碳源、氮源、無機鹽、微量元素、水、生長因素、前體、誘導劑或刺激劑、抑制劑例：高氏培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌）：

可溶性淀粉2克，硝酸鉀0.1克，磷酸氫二鉀0.05克，氯化鈉0.05克，硫酸鎂0.05克，硫酸亞鐵0.001克，瓊脂2克，水100毫升。一、培養(yǎng)基組成與成分24（一）碳源：提供微生物生長繁殖所需的能源，構(gòu)成細胞和抗生素的碳骨架。1．碳水化合物：單糖，多糖，多聚糖（蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等）2．脂肪：油（脂肪）水解脂肪酶

甘油（脂肪酸）溶解氧C02+H20

（一）碳源：提供微生物生長繁殖所需的能源，構(gòu)成細胞和抗生素的253．有機酸有機酸或它們的鹽也能作為微生物的碳源。注意！有機酸的利用常會使pH上升。CH3COONa+O2→2CO2+H2O+NaOH3．有機酸26（二）氮源：主要用于構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等和含氮的目的產(chǎn)物如青霉素、鏈霉素等抗生素。1、無機氮源（快速利用N源）：銨鹽（如氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨），硝酸鹽（如硝酸鈉、硝酸鉀）和氨水等。特點：（1）分解快，能被微生物迅速利用；（2）引起pH變化。(NH4)2S04→2NH3+H2S04生理酸性物質(zhì)NaNO3+4H2→NH3+2H20+NaOH生理堿性物質(zhì)（二）氮源：主要用于構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核272、有機氮源（慢速利用氮源）：花生餅粉，黃豆餅粉，玉米漿，玉米蛋白粉，蛋白胨，酵母膏。在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌體吸收后再進一步分解代謝．最終用于合成菌體細胞物質(zhì)和含氮的目的產(chǎn)物。2、有機氮源（慢速利用氮源）：花生餅粉，黃豆餅粉，玉米漿，28（三）無機鹽、微量元素：

微生物在生長繁殖和合成目的產(chǎn)物的過程中，需要某些無機鹽和微量元素作為其生理活性物質(zhì)的組成或代謝的調(diào)節(jié)物。P、S（可構(gòu)成細胞物質(zhì)）Mg、Fe（可作為酶的組成成分或維持酶活性）K、Na（調(diào)節(jié)細胞滲透壓）Cu、Zn、Mn（作為酶的輔基和激活劑）（三）無機鹽、微量元素：微生物在生長繁殖和合成目的產(chǎn)物的29（四）水：

（1）構(gòu)成生物體的成分；（2）培養(yǎng)基的組成部分；（3）參與代謝反應；（4）作為代謝反應介質(zhì)；（5）作為物質(zhì)傳遞介質(zhì)；（6）良好的熱導體。（四）水：（1）構(gòu)成生物體的成分；30（五）生長因素：生長因素：有些微生物即使在具有合適的水分、碳源、氮源、無機鹽等的條件下，還不能生長或生長不好，但如果加入少量微生物生長所必需的有機物質(zhì)，則生長良好。通常把這些特殊的營養(yǎng)物質(zhì)稱為生長因素。

1．維生素：是輔酶的組成成分；2．氨基酸：有些生物不能合成某種氨基酸；3．嘌呤和嘧啶：構(gòu)成核酸和輔酶。（五）生長因素：生長因素：有些微生物即使在具有合適的水分31（六）前體

在微生物合成抗生素過程中，有些化合物能被微生物直接利用來構(gòu)成抗生素分子結(jié)構(gòu)的一部分，而化合物本身的結(jié)構(gòu)設(shè)沒有大的變化，這些物質(zhì)稱為抗生素的前體。（六）前體在微生物合成抗生素過程中，有些化合物能被微生物32（七）誘導物或刺激劑：

所謂誘導物是指一些具有調(diào)節(jié)抗生素生物合成能力的小分子物質(zhì)。如：β－吲哚乙酸是金霉素生物合成的刺激物；甲硫氨酸和亮氨酸是頭孢菌素的刺激劑。（七）誘導物或刺激劑：所謂誘導物是指一些具有調(diào)節(jié)抗生素生33（八）抑制劑：在次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)過程中，往往抑制某一代謝途徑，就會使另一代謝途徑活躍。如加入二乙基巴比妥鹽可抑制利福霉素B以外其他利福霉素的生成，從而增加利福霉素B的含量和產(chǎn)量。（八）抑制劑：在次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)過程中，往往抑制某一34二、培養(yǎng)基的種類

（一）按來源分類：1、合成培養(yǎng)基（1）所用原料的化學成分明確、穩(wěn)定；（2）實驗重現(xiàn)性好、低泡；（3）適用于研究菌種基本代謝和過程的物質(zhì)變化；（4）營養(yǎng)單一，價格昂貴，不適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。二、培養(yǎng)基的種類（一）按來源分類：352、天然培養(yǎng)基（天然的動植物產(chǎn)品）（1）營養(yǎng)豐富，適合于微生物的生長繁殖和目的產(chǎn)物的合成。（2）組成培養(yǎng)基的原料來源豐富，價格低廉，適用于工業(yè)生產(chǎn)。（3）組分復雜，不易重復，若對原料質(zhì)量等方面不加控制會嚴重影響生產(chǎn)的穩(wěn)定性。2、天然培養(yǎng)基（天然的動植物產(chǎn)品）36（二）按狀態(tài)分類：

固體培養(yǎng)基：適用于菌種的分離和保存；半固體培養(yǎng)基：（瓊脂用量為0.5～0.8％）主要用于鑒定菌種、觀察細菌運動特征及噬菌體的效價測定等；液體培養(yǎng)基：（水80％～90％），是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基，它有利于氧和物質(zhì)的傳遞。

（二）按狀態(tài)分類：固體培養(yǎng)基：適37（三）按用途分類：

1．孢子培養(yǎng)基供菌種繁殖孢子的固體培養(yǎng)基。能使菌體迅速生長，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)孢子并不易引起菌種發(fā)生變異。例如：高氏培養(yǎng)基（三）按用途分類：1．孢子培養(yǎng)基382．種子培養(yǎng)基指一、二級種子罐的培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)基。主要含有容易被利用的碳源、氮源、無機鹽等，使孢子很快發(fā)芽、生長以及大量繁殖菌絲體，并使菌體長得粗壯和使各種有關(guān)的初級代謝酶的活力提高。赤霉素產(chǎn)生菌種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.5%,糊精1.0%,花生粉1.5%,MgSO4·7H2O0.1%,KH2PO40.1%,消泡劑0.2%2．種子培養(yǎng)基393．發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基可供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進劑等。玉米淀粉7.0％，飴糖2.5％，豆餅粉0.3％，花生粉1.0％，MgSO4·7H2O0.07％，KH2PO40.14％，消沫劑0.05％，α-淀粉酶0.05％3．發(fā)酵培養(yǎng)基40三、影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素

（一）原材料質(zhì)量的影響：玉米漿、黃豆粉、花生餅粉、蛋白胨、淀粉、糊精品種、產(chǎn)地、加工方法、儲藏條件

三、影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素（一）原材料質(zhì)量的影響：41（二）水質(zhì)的影響地質(zhì)（地區(qū)）（地貌）、季節(jié)、處理方法（漂白粉、沉淀劑、消毒劑）和環(huán)境水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。

（二）水質(zhì)的影響42（三）滅菌操作滅菌操作不當不僅會減少培養(yǎng)基中有效的營養(yǎng)成分，還會產(chǎn)生一些有毒物質(zhì)，給發(fā)酵帶來不利的影響。蛋白質(zhì)在高溫下變性，維生素在高溫下失活葡萄糖與含氨基的物質(zhì)反應形成5-羥甲基糖醛和棕色的類黑精（焦化），對微生物有一定的毒性（三）滅菌操作43（四）培養(yǎng)基粘度的影響粘度是培養(yǎng)基物性的重要指標之一，它直接影響氧的傳遞、營養(yǎng)成分、無機鹽、生長因子等的擴散，從而影響細胞的呼吸、營養(yǎng)成分的吸收，最終導致影響目標產(chǎn)物的形成?！跋∨浞健保海?）中間補料；（2）精料發(fā)酵、基礎(chǔ)原料液體化；（3）補加無菌水（四）培養(yǎng)基粘度的影響粘度是培養(yǎng)基物性的重要指標之一，它直44第四節(jié)

滅菌及染菌防治

染菌對抗生素生產(chǎn)過程的危害：（1）消耗培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分；（2）使培養(yǎng)條件如溶氧、粘度發(fā)生變化；（3）有的雜菌會分泌一些對抗生素產(chǎn)生菌有毒或能使抗生素降解失活的物質(zhì)，從而造成抗生素產(chǎn)量大幅度下降；（4）影響后道工序的正常生產(chǎn)、影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量；（5）如果污染了噬菌體，不僅引起產(chǎn)生菌自溶，而且還會迅速大面積蔓延，嚴重威脅抗生素的生產(chǎn)。第四節(jié)

滅菌及染菌防治染菌對抗生素生產(chǎn)過程的危害：45一、滅菌的理論和技術(shù)滅菌是指用化學或物理的方法殺滅或去除物料及設(shè)備中所有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝過程。（一）物理滅菌射線滅菌熱滅菌（濕熱和干熱）過濾除菌一、滅菌的理論和技術(shù)滅菌是指用化學或物理的方法殺滅或去除物46射線滅菌1、方法：通常用紫外線、高能量的電磁波或粒子輻射滅菌。其中以紫外線最常用。2、原理：紫外線的作用光譜與細菌體內(nèi)核酸的吸收光譜相一致，DNA鏈上核苷酸的堿基因此具有強烈的吸收紫外線的能力，引起DNA結(jié)構(gòu)形式的變化而導致死亡。3、特點：紫外線對芽孢和營養(yǎng)細胞都能起作用，但其穿透力極低，只能用于表面滅菌。對真菌孢子的殺滅能力不大。主要用來進行一定空間內(nèi)空氣的滅菌（如無菌室等）。射線滅菌47干熱滅菌

1、方法：包括火焰滅菌和熱空氣滅菌，常用的干熱空氣滅菌是利用電熱或者紅外線在一定設(shè)備內(nèi)對各種用具物品進行殺菌。生產(chǎn)上常用的干熱滅菌的條件是160℃，時間1－2h。2、原理：高溫時微生物各種與溫度有關(guān)的氧化過程速率增快。3、特點：時間長、耗熱量大，應用不廣。一般用于滅菌后要求保持干燥狀態(tài)的物料。干熱滅菌48濕熱滅菌1、方法：直接用加壓濕蒸汽進行物料或設(shè)備容器的滅菌。用蒸汽將物料升溫到115－140℃保持一定時間，可殺死各種微生物。常用的滅菌條件是120℃，20－30min。2、原理：在高溫及有水分存在的條件下，微生物細胞中的蛋白質(zhì)極易凝固而引起微生物的死亡。3、特點：經(jīng)濟，快速，適用于大量培養(yǎng)基及發(fā)酵設(shè)備的滅菌。濕熱滅菌49介質(zhì)過濾除菌對培養(yǎng)液中某此不耐熱的成分可采用過濾除菌法。發(fā)酵過程中所用的大量無菌空氣也是用過濾除菌法。介質(zhì)過濾除菌50（二）化學滅菌

1、定義：化學藥劑滅菌是通過藥劑與微生物細胞接觸而發(fā)生諸如蛋白質(zhì)變性等作用而達到殺滅微生物的目的。2、滅菌用化學藥劑必須具備以下四個條件：（1）殺菌譜廣。有效濃度低且殺滅微生物的速度快。（2）性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于水且可在常溫下使用。（3）基本上不受有機物、酸、堿和其他物理化學因素的影響。（4）無腐蝕性，無毒或低毒，使用安全。（二）化學滅菌

1、定義：化學藥劑滅菌是通過藥劑與微生物細胞513、常用的化學藥劑：乙醇、甲醛、苯扎溴銨（新潔爾滅）、戊二醛、環(huán)氧乙烷、漂白粉和苯酚（石炭酸）等。4、用途：化學滅菌主要用來進行皮膚表面、器具及無菌區(qū)域的滅菌，很少用于培養(yǎng)基的滅菌。3、常用的化學藥劑：乙醇、甲醛、苯扎溴銨（新潔爾滅）、戊二醛52二、培養(yǎng)基及有關(guān)設(shè)備的滅菌

（一）實罐滅菌（分批滅菌）

分批滅菌是將配制好的培養(yǎng)基投入發(fā)酵罐中，經(jīng)過間接蒸汽預熱后，直接通入飽和蒸汽使培養(yǎng)基和設(shè)備一起滅菌。流程：培養(yǎng)基預熱培養(yǎng)基滅菌冷卻二、培養(yǎng)基及有關(guān)設(shè)備的滅菌（一）實罐滅菌（分批滅菌）53第三章微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)課件54注意事項：1．培養(yǎng)基預熱：80～90℃。避免產(chǎn)生冷凝水造成培養(yǎng)基稀釋。2．培養(yǎng)基滅菌：120～130℃，保溫30min。各路蒸汽進口要暢通，防止逆流，罐內(nèi)液體翻動要劇烈，以使罐內(nèi)物料達到均一的滅菌溫度。排汽量不宜過大，以節(jié)約蒸汽用量。3．冷卻：滅菌將要結(jié)束時，應立即引入無菌空氣以保持罐壓，然后開夾套或蛇管冷卻水冷卻，避免罐壓迅速下降，產(chǎn)生負壓而抽吸外界空氣。注意事項：55（二）空罐滅菌空罐滅菌即發(fā)酵罐罐體的滅菌?？展逌缇话憔S持罐壓1.5×105～2.0×105Pa，罐溫125～130℃，30～45min，直接蒸汽法。滅菌后為避免罐壓急速下降造成負壓，要等到經(jīng)過滅菌的無菌培養(yǎng)基輸入罐內(nèi)后，才可以開冷卻水冷卻。（二）空罐滅菌空罐滅菌即發(fā)酵罐罐體的滅菌。56（三）連續(xù)滅菌培養(yǎng)基通過連續(xù)滅菌裝置，進行快速這續(xù)加熱滅菌，并快速冷卻，再立即輸入預先經(jīng)過空罐滅菌后的發(fā)酵罐中。流程：培養(yǎng)基預熱連續(xù)滅菌維持滅菌溫度冷卻（三）連續(xù)滅菌培養(yǎng)基通過連續(xù)滅菌裝置，進行快速這續(xù)加熱滅菌57第三章微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)課件58注意事項：1．培養(yǎng)基預熱：60一75℃，避免連續(xù)滅菌時由于料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲。2．連續(xù)滅菌：連續(xù)滅菌的溫度一般以126一132℃為宜。3．維持滅菌溫度：利用維持罐使料液在滅菌溫度下保持5—7min，以達到滅菌的目的。4．冷卻：采用冷水噴淋時，噴淋前冷卻管內(nèi)應充滿填料。注意事項：59特點：（1）連續(xù)滅菌的時間短、溫度較高。培養(yǎng)基受到的破壞較少，故質(zhì)量較好。連續(xù)滅菌時蒸汽負荷均衡一致。（2）不足之處是所需設(shè)備較多，操作較麻煩，染菌的機會也相應增多。特點：60（四）發(fā)酵附屬設(shè)備及管路的滅菌

發(fā)酵附屬設(shè)備有總空氣過濾器、管道、計量罐、補料罐等。（四）發(fā)酵附屬設(shè)備及管路的滅菌

發(fā)酵附屬設(shè)備有總空氣過濾器、61三、空氣過濾除菌（一）介質(zhì)除菌的機制

1．沉降作用2．截留作用3．慣性碰撞4．擴散現(xiàn)象5．靜電吸附三、空氣過濾除菌（一）介質(zhì)除菌的機制62（二）空氣過濾介質(zhì)1、要求：能耐高溫、高壓，不易被油水污染。且成本低、易更換。2、常用的空氣過濾介質(zhì)：棉花、活性炭、玻璃棉、超細玻璃纖維紙、石棉濾板等。3、新型過濾介質(zhì)：膜過濾器。（二）空氣過濾介質(zhì)1、要求：能耐高溫、高壓，不易被油水污染。63（三）空氣過濾除菌的工藝過程

主要目的：1、提高壓縮前空氣的質(zhì)量去除壓縮空氣中所帶的油和水3、獲得無菌空氣（三）空氣過濾除菌的工藝過程

主要目的：64第三章微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)課件65第五節(jié)

發(fā)酵過程控制一、發(fā)酵過程的主要控制參數(shù)與代謝變化物理參數(shù)：1．溫度（℃）發(fā)酵整個過程或不同階段中所維持的溫度。酶反應速率、氧在培養(yǎng)液中的溶解度與傳遞速率、菌體生長速率和產(chǎn)物合成速率2．壓力（Pa）發(fā)酵過程中發(fā)酵罐維持的壓力,一般維持在0.2×105~0.5×105Pa。保證純種的培養(yǎng),間接影響菌體代謝。第五節(jié)

發(fā)酵過程控制一、發(fā)酵過程的主要控制參數(shù)與代謝變化663．攪拌轉(zhuǎn)速（r／min）攪拌轉(zhuǎn)速是指攪拌器在發(fā)酵過程中的轉(zhuǎn)動速度，通常以每1min的轉(zhuǎn)數(shù)來表示。它的大小與氧在發(fā)酵液中的傳遞速率與發(fā)酵液的均勻性有關(guān)。4．攪拌功率（kw）指攪拌器攪拌時所消耗的功率，常指每1m3發(fā)酵液所消耗的功率（kw／m3）。它的大小與氧容量傳遞系數(shù)有關(guān)。3．攪拌轉(zhuǎn)速（r／min）675．空氣流量［V／（V·min），簡稱VVM］每1min內(nèi)每單性體積發(fā)酵液通入空氣的體積，也是需氧發(fā)酵的控制參數(shù)。與氧的傳遞和其他控制參數(shù)有關(guān)。一般控制在0.5～1.0V／（V·min）范圍內(nèi)。6．粘度（Pa·s）粘度大小可以作為細胞生長或細胞形態(tài)的一項標志，也能反映發(fā)酵罐中菌絲分裂過程的情況。通常用表觀粘度表示之：它的大小可改變氧傳遞的阻力，又可表示相對菌體濃度。5．空氣流量［V／（V·min），簡稱VVM］687．濁度（％）濁度是能及時反映單細胞生長狀況的參數(shù)，對某些產(chǎn)品的生產(chǎn)是極其重要的參數(shù)。8.料液流量（L／min）這是控制流體進料的參數(shù)。7．濁度（％）69化學參數(shù)：1．pH（酸堿度）發(fā)酵液的pH是發(fā)酵過程中各種產(chǎn)酸和產(chǎn)堿的生化反應的綜合結(jié)果。它是發(fā)酵工藝控制的重要參數(shù)之一。它的高低與菌體生長和產(chǎn)物合成有著重要的關(guān)系?；瘜W參數(shù)：1．pH（酸堿度）702．基質(zhì)濃度（g或mg％）這是發(fā)酵液中糖、氮、磷等重要營養(yǎng)物質(zhì)的濃度。它們的變化對產(chǎn)生菌的生長和產(chǎn)物的合成有著重要的影響，也是提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的重要控制手段。在發(fā)酵過程中，必須定時測定糖（還原糖和總糖）、氮（氨基氮或氨氮）等基質(zhì)的濃度。2．基質(zhì)濃度（g或mg％）713．溶解氧濃度［10-6（ppm）或飽和度（％）］溶解氧是需氧菌發(fā)酵的必備條件。利用溶氧濃度的變化，可了解產(chǎn)生菌對氧利用的規(guī)律，反映發(fā)酵的異常情況，也可作為發(fā)醉中間控制的參數(shù)及設(shè)備供氧能力的指標。溶氧濃度一般用絕對含量（10-6）來表示、有時也用在相同條件下，氧在培養(yǎng)液中飽和濃度表示。3．溶解氧濃度［10-6（ppm）或飽和度（％）］724．產(chǎn)物的濃度[μg（u）／ml]這是發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量高低或合成代謝正常與否的重要參數(shù)，也是決定發(fā)酵周期長短的根據(jù)。5．廢氣中的氧濃度（Pa）廢氣中的氧含量與產(chǎn)生菌的攝氧率和供氧系數(shù)有關(guān)。從廢氣中的O2的含量可以算出產(chǎn)生菌的攝氧率和發(fā)酵罐的供氧能力。4．產(chǎn)物的濃度[μg（u）／ml]736．廢氣中的CO2濃度（％）廢氣中的CO2就是產(chǎn)生菌呼吸放出的CO2。測定它可以算出產(chǎn)生菌的呼吸熵，從而了解產(chǎn)生菌的呼吸代謝規(guī)律。其他化學參數(shù)：DNA、RNA、生物合成的關(guān)鍵酶等。6．廢氣中的CO2濃度（％）74生物參數(shù)：1．菌絲形態(tài)絲狀菌發(fā)酵過程中菌絲形態(tài)的改變是生化代謝變化的反映。一般都以菌絲形態(tài)作為衡量種子質(zhì)量、區(qū)分發(fā)酵階段、控制發(fā)酵過程的代謝變化和決定發(fā)酵周期的依據(jù)之一。生物參數(shù)：1．菌絲形態(tài)752．菌體濃度菌體濃度簡稱菌濃，是控制微生物發(fā)酵的重要參數(shù)之一。大小和變化速度對菌體的生化反應都有影響（表觀粘度、溶氧濃度）。在生產(chǎn)上，常常根據(jù)菌體濃度來決定適合的補料量和供氧量，以保證生產(chǎn)達到頂期的水平。2．菌體濃度76（發(fā)酵液的菌體量和單位時間的菌濃、溶氧濃度、糖濃度、氮濃度和產(chǎn)物濃度等的變化值）計算

（菌體的比生長速率、氧比消耗速率、糖比消耗速率、氮比消耗速率和產(chǎn)物比生產(chǎn)速率）（控制產(chǎn)生菌的代謝、決定補料和供氧工藝條件）

研究發(fā)酵動力學（發(fā)酵液的菌體量和單位時間的菌濃、溶氧濃度、糖濃度、氮濃度和77發(fā)酵過程中的代謝變化1．菌體生長階段（菌體生長期或發(fā)酵前期）碳源、氮源進行分解代謝：碳源、氮源和磷酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，濃度明顯減少。菌體進行合成代謝：菌濃明顯增加、攝氧率不斷增大，溶氧濃度不斷下降。發(fā)酵過程中的代謝變化1．菌體生長階段（菌體生長期或發(fā)酵前期782．產(chǎn)物合成階段（產(chǎn)物分泌期或發(fā)酵中期）這個階段主要是合成抗生素。以碳源和氮源的分解代謝和產(chǎn)物的合成代謝為主，尚有合成菌體細胞物質(zhì)的代謝存在，但不是主要的。由于存在抗生素合成和菌體合成兩條代謝途徑，外界環(huán)境的變化很容易影響這個階段的代謝，破源、氮源和磷酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)的濃度必須控制在一定的范圍內(nèi)，發(fā)酵條件也要嚴格控制，才能促使產(chǎn)物不斷地被合成。2．產(chǎn)物合成階段（產(chǎn)物分泌期或發(fā)酵中期）793．菌體自溶階段（菌體自溶期或發(fā)酵后期）

菌體衰老，細胞開始自溶，氨氮含量增加，pH上升，產(chǎn)物合成能力衰退，生產(chǎn)速率下降。發(fā)酵到此期必須結(jié)束。3．菌體自溶階段（菌體自溶期或發(fā)酵后期）80二、溫度的影響與控制（一）溫度對發(fā)酵的影響：1、影響各種酶反應的速率和蛋白質(zhì)的性質(zhì)。（1）在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶反應速率也增加，但有一個最適溫度，超過這個溫度，酶的催化活力就下降。溫度對菌體生長的酶反應和代謝產(chǎn)物合成的酶反應的影響不同。如產(chǎn)黃青霉菌體的最適生長溫度為30℃，青霉素合成的最適溫度為24.7℃。二、溫度的影響與控制（一）溫度對發(fā)酵的影響：81（2）溫度還能改變菌種代謝產(chǎn)物的合成方向，影響多組分次級代謝產(chǎn)物的組分比例。如在高濃度Cl-和低濃度Cl-的培養(yǎng)基中利用金霉素鏈霉菌NRRLB-1287進行四環(huán)素發(fā)酵，30℃以下時合成的金霉素增多，達35℃時就只產(chǎn)四環(huán)素，而金霉素合成幾乎停止。

如黃曲霉產(chǎn)生的多組分黃曲霉毒素，在20℃、25℃和30℃發(fā)酵所產(chǎn)生的黃曲霉毒素G1與B1比例分別為3：1、1：2和1：1。（2）溫度還能改變菌種代謝產(chǎn)物的合成方向，影響多組分次級代謝822、影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。發(fā)酵液的粘度、基質(zhì)和氧在發(fā)酵液中的溶解度和傳遞速率、某些基質(zhì)的分解和吸收速率等。2、影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。83（二）影響發(fā)酵溫度變化的因素：產(chǎn)熱的因素：生物熱（Q生物）和攪拌熱（Q攪拌）；散熱的因素：蒸發(fā)熱（Q蒸發(fā)）、輻射熱（Q輻射）和顯熱（Q顯）。發(fā)酵熱：Q發(fā)酵[kJ／（m3．h）]Q發(fā)酵＝Q生物＋Q攪拌－Q蒸發(fā)－Q輻射－Q顯。（二）影響發(fā)酵溫度變化的因素：產(chǎn)熱的因素：生物熱（Q生物）和841．生物熱（Q生物）：產(chǎn)生菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的熱能。生物熱的大小，隨菌種和培養(yǎng)基成分不同而變化。生物熱的大小還隨培養(yǎng)時間不同而不同。1．生物熱（Q生物）：產(chǎn)生菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的熱能。852．攪拌熱（Q攪拌）：攪拌器轉(zhuǎn)動引起的液體之間和液體與設(shè)備之間的摩擦所產(chǎn)生的熱量。3．蒸發(fā)熱（Q蒸發(fā)）：空氣進入發(fā)酵罐與發(fā)酵液廣泛接觸后，引起水分蒸發(fā)所需的熱能。4．輻射熱（Q輻射）：由于罐外壁和大氣間的溫度差異而使發(fā)酵液中的部分熱能通過罐體向大氣輻射的熱量。

2．攪拌熱（Q攪拌）：攪拌器轉(zhuǎn)動引起的液體之間和液體與設(shè)備之86（三）溫度的控制：1．最適溫度的選擇最適發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長、又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。最適生長溫度與最適生產(chǎn)溫度往往是不一致的。最適發(fā)酵溫度還隨菌種、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和菌體生長階段而改變。理論上，整個發(fā)醉過程中不應只選一個培養(yǎng)溫度，而應該根據(jù)發(fā)酵的不同階段，選擇不同的培養(yǎng)溫度。（三）溫度的控制：1．最適溫度的選擇87

2.溫度的控制夾套冷卻蛇管2.溫度的控制88三、pH的影響與控制

（一）發(fā)酵pH的影響在發(fā)酵過程中，pH變化決定于所用菌種的特性、培養(yǎng)基配比和發(fā)酵條件。pH的變化會引起各種酶活力的改變，影響菌對基質(zhì)的代謝速度，甚至改變菌的代謝途徑及細胞結(jié)構(gòu)。三、pH的影響與控制（一）發(fā)酵pH的影響89（二）發(fā)酵過程pH的控制

（二）發(fā)酵過程pH的控制

901、根據(jù)菌種特性和培養(yǎng)基性質(zhì)，選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基成分和配比，有些成分可在中間補料時補充調(diào)節(jié)。例如，在青霉素發(fā)酵中，根據(jù)產(chǎn)生菌的代謝需要用改變加糖率來控制pH，比固定加糖率而以酸或堿來調(diào)節(jié)pH可增產(chǎn)青霉素25％。1、根據(jù)菌種特性和培養(yǎng)基性質(zhì)，選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基成分和配比，有912、加入適量的緩沖劑，以控制培養(yǎng)基pH的變化。常用的緩沖劑有碳酸鈣、磷酸鹽等。其中碳酸鈣使用最普遍。其中和反應為：2、加入適量的緩沖劑，以控制培養(yǎng)基pH的變化。923、在發(fā)酵過程出現(xiàn)pH過高或過低的情況時，可以直接加入酸或堿類物質(zhì)加以調(diào)節(jié)。無機酸堿調(diào)節(jié)pH最方便、省事，但也是最無奈的辦法。生理酸堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH最困難，不易把握，但只要對癥，效果最佳。3、在發(fā)酵過程出現(xiàn)pH過高或過低的情況時，可以直接加入酸或堿93四、溶氧濃度的變化和控制

（一）發(fā)酵過程中溶氧濃度變化規(guī)律四、溶氧濃度的變化和控制（一）發(fā)酵過程中溶氧濃度變化規(guī)律94（二）發(fā)酵異常時溶氧變化造成異常變化的原因：耗氧或供氧出現(xiàn)了異常因素或發(fā)生了障礙。

（1）污染好氣性雜菌。（2）染噬菌體。（3）呼吸減弱，菌絲自溶。（4）菌體代謝發(fā)生異?，F(xiàn)象。（5）某些設(shè)備或工藝控制發(fā)生故障或變化。（二）發(fā)酵異常時溶氧變化95（三）溶氧濃度的控制供氧方面，主要是設(shè)法提高氧傳遞的推動力和設(shè)備的通氣效率，如調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速或通氣速率來控制供氧。需氧方面，控制補料速度（最適菌濃）。調(diào)節(jié)溫度、液化培養(yǎng)基、中間補水、添加表面活性劑（三）溶氧濃度的控制供氧方面，主要是設(shè)法提高氧傳遞的推動力和96五、泡沫的影響與控制（一）泡沫的性質(zhì)及對發(fā)酵的影響泡沫的性質(zhì)：發(fā)酵液液面上的泡沫，氣相所占的比例特別大，與液體有較明顯的界限，如發(fā)酵前期的泡沫；發(fā)酵液中的泡沫，又稱流態(tài)泡沫，分散在發(fā)酵液中，比較穩(wěn)定，與液體之間無明顯的界限。五、泡沫的影響與控制（一）泡沫的性質(zhì)及對發(fā)酵的影響97泡沫對發(fā)酵的影響：起泡：發(fā)酵罐的裝料系數(shù)減小，氧傳遞系數(shù)減小等。泡沫過多：造成大量逃液，發(fā)酵液從排氣管路或軸封逃出而增加染菌機會等。嚴重時：通氣攪拌也無法進行，菌體呼吸受到阻礙，導致代謝異?；蚓w自溶。泡沫對發(fā)酵的影響：98（二）影響泡沫消長的因素1、與通氣攪拌的劇烈程度，特別是高速的攪拌及大空氣流量有關(guān)2、與培養(yǎng)基配比及原材料組成有關(guān)3、與菌種、種子質(zhì)量、菌絲階段和接種量有關(guān)（二）影響泡沫消長的因素1、與通氣攪拌的劇烈程度，特別是高速99（三）泡沫的消除機械消沫靠機械引起的強烈振動或壓力的變化促使氣泡破裂。

罐內(nèi)消沫法：在攪拌軸上方裝消沫槳，通過消沫槳轉(zhuǎn)動打碎泡沫。罐外消沫法：將泡沫引出罐外，通過噴嘴的加速作用或利用離心力來消除泡沫。優(yōu)點：不需加入外界物料，可節(jié)省原料，減少污染雜菌的機會。缺點：消沫效果不理想，僅可作為輔助的消沫方法。（三）泡沫的消除機械消沫100消沫劑消沫（化學消沫）消沫機理：（1）當泡沫的表層存在著極性的表面活性物質(zhì)而形成雙電層時，加入另一種具有相反電荷的表面活性劑，以降低其機械強度，進而促使泡沫破裂。（2）當泡沫的液膜具有較大的表面粘度時，可加入某些分子內(nèi)聚力較小的物質(zhì)，以降低液膜的表面粘度，從而促使液膜的液體流失而使泡沫破裂。消沫劑消沫（化學消沫）101理想的消沫劑，應具備下列條件：（1）必須是表面活性物質(zhì)，且具有較低的表面張力。（2）在氣—液界面上具有足夠大的鋪展系數(shù)，才能迅速發(fā)揮消泡作用。（一定的親水性）（3）在水中溶解度極小，以保持其具有持久的消泡或抑泡性能。（4）無毒、能耐高溫滅菌、對設(shè)備無腐蝕性、不干擾其他參數(shù)的測定、不妨礙氧的傳遞、對發(fā)酵、提煉及抗生素的質(zhì)量和產(chǎn)量無影響。（5）成本低、來源廣。理想的消沫劑，應具備下列條件：102常用的消沫劑，主要有天然油脂類，高碳醇、脂肪酸和酯類，聚醚類，硅酮類4大類。（1）天然油脂類：玉米油、米糠油、豆油、松子油、菜子油、魚油、豬油等。優(yōu)點：來源比較豐富，價格比較低廉，在發(fā)酵中不僅用于消沫，還可以作為供產(chǎn)生菌利用的碳源和中間控制的手段。缺點：分子中無親水基，在發(fā)泡介質(zhì)中難鋪展，消泡活性差。并且油的成本和折糧單耗都比較高且用量大，已逐漸被合成消沫劑取代。常用的消沫劑，主要有天然油脂類，高碳醇、脂肪酸和酯類，聚醚類103（2）高碳醇和酯類：十八醇、聚乙二醇、苯乙酸酯類（苯乙酸乙酯、苯乙酸丁酯、苯乙酸月桂醇酯）、苯乙醇、苯乙醇油酸酯等。多適用于絲狀真菌發(fā)酵。（2）高碳醇和酯類：十八醇、聚乙二醇、苯乙酸酯類（苯乙酸乙酯104（3）聚醚類。

優(yōu)點：性能穩(wěn)定、使用簡便、易控制、用量少、成本低。（3）聚醚類。105聚氧丙烯甘油：親水性差，在發(fā)沫介質(zhì)中溶解度小。抑泡性能優(yōu)于消泡性能。適用于稀薄發(fā)酵液，添加于培養(yǎng)基中。聚氧乙烯氧丙烯甘油：親水性好，在發(fā)沫介質(zhì)中易鋪展，消沫能力強。相應的溶解度大，消沫活性持續(xù)時間短。適用于粘稠發(fā)酵液的消沫。聚氧丙烯甘油：親水性差，在發(fā)沫介質(zhì)中溶解度小。抑泡性能優(yōu)于消106（4）硅酮類：聚二甲基硅氧烷及其衍生物。適用于微堿性細菌發(fā)酵。（4）硅酮類：聚二甲基硅氧烷及其衍生物。107消沫劑消沫優(yōu)缺點：優(yōu)點：效果好，較機械消沫作用迅速，尤其是化學合成消沫劑用量少。缺點：消沫劑使用不當時對菌的生長代謝有干擾；發(fā)酵過程中經(jīng)常添加消沫劑增加原材料單耗；設(shè)備不嚴密時增加染菌機會；殘留的消沫劑可能造成提煉上的麻煩。消沫劑消沫優(yōu)缺點：108消沫劑的增效：（1）加載體增效，即用情性載體（如礦物油、植物油等）將消沫劑溶解分散，達到增效的目的。（2）消沫劑的并用增效，取各個消沫劑的優(yōu)點進行互補，達到增效。（3）乳化消沫劑增效。消沫劑的增效：109（四）泡沫控制

1、減少泡沫形成的機會。調(diào)整培養(yǎng)基中的成分；改變某些物理化學參數(shù)；改變發(fā)酵工藝。2、消除已形成的泡沫。機械消沫；消沫劑消沫。（四）泡沫控制

1、減少泡沫形成的機會。110第一節(jié)菌種選育生物制藥工藝學

第三章微生物制藥技術(shù)工藝基礎(chǔ)生物制藥工藝學第三章微生物制藥技術(shù)工藝基礎(chǔ)111一、微生物的遺傳和變異

遺傳—保持物種的相對穩(wěn)定性變異—促使新性狀的產(chǎn)生、獲得新的優(yōu)良品種遺傳型變異：在遺傳物質(zhì)水平上發(fā)生了改變，從而引起某些相應性狀發(fā)生改變的特性

變異性表型變異：微生物在生活條件發(fā)生改變時，發(fā)生暫時的形態(tài)、生理等特性的改變，但隨著環(huán)境條件的復原，它們又恢復了原有的特性一、微生物的遺傳和變異遺傳—保持物種的相對穩(wěn)定性112（一）基因突變基因突變是指遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）中的核苷酸順序發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的變化，主要包括點突變和染色體畸變兩大類。1、點突變是由于DNA鏈上的一對或少數(shù)幾對堿基發(fā)生改變引起的。2、染色體畸變是指DNA大段變化（損傷）的現(xiàn)象，主要包括染色體結(jié)構(gòu)上的變化和染色體數(shù)目的變化。（二）基因重組

指兩個或多個不同性狀個體的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一個體細胞內(nèi)，經(jīng)重新組合后，造成菌種變異，形成新的遺傳型個體。

（一）基因突變113二、菌種選育的經(jīng)典方法

1、自然選育是一種純種選育的方法。它利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過分離，篩選排除衰變型菌落，從中選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株。特點：（1）能純化、復壯菌種，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高平均生產(chǎn)水平。（2）難以選育高產(chǎn)突變菌株，不能使生產(chǎn)水平大幅度提高。二、菌種選育的經(jīng)典方法1、自然選育1142、誘變育種誘變育種是指人工有意識地將生物體暴露于物理的、化學的或生物的一種或多種誘變因子中，促使生物體發(fā)生突變，進而從突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程。特點：與自然選育比較，由于引進了誘變劑處理，因而加速了菌種突變的頻率，擴大了變異的幅度，從而提高了獲得優(yōu)良特性的突變株的幾率。2、誘變育種115

物理誘變劑：紫外線、x射線、Y射線、快中子、β射線、超聲波、激光誘變劑化學誘變劑：氮芥、乙烯亞胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亞硝基胍、亞硝基甲基脲、亞硝酸生物誘變劑：噬菌體物理誘變劑：紫外線、x116三、現(xiàn)代菌種選育技術(shù)1、雜交育種：

指兩個基因型不同的菌株通過接合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離，篩選出具有新性狀的菌株。優(yōu)點：能集中位于不同品種中的優(yōu)良性狀。缺點：只能利用已有的基因組，并不能產(chǎn)生新的基因。雜交進程緩慢，過程繁瑣。三、現(xiàn)代菌種選育技術(shù)1、雜交育種：

指兩個基因型不同的菌株1172、原生質(zhì)體融合

用脫壁酶處理將微生物細胞壁除去，制成原生質(zhì)體，再用融合劑（如聚乙二醇）促進原生質(zhì)體發(fā)生融合，從而獲得融合子，這一技術(shù)叫原生質(zhì)體融合。

細胞（A+B—）

細胞（A—B+）

脫壁處理

脫壁處理

原生質(zhì)體（A+B—）

原生質(zhì)體（A—B+）

混合

加融合劑

原生質(zhì)體融合

涂平板（原生質(zhì)體再生）

形成菌落

檢出重組子菌落（A+B+）

2、原生質(zhì)體融合

用脫壁酶處理將微生物細胞壁除去，制成原生1183、基因工程（基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)）是指按照人的意志，將某一生物體(供體)的遺傳信息在體外經(jīng)人工與載體相接(重組)，構(gòu)成重組DNA分子，然后轉(zhuǎn)入另一生物體(受體)細胞中，使被引進的外源DNA片段在后者內(nèi)部得以表達和遺傳。研究和開發(fā)的趨勢有：1.基因克隆產(chǎn)生雜合抗生素。（一旦取得了抗生素的結(jié)構(gòu)基因，將基因片段送入特定性質(zhì)的另一種抗生素產(chǎn)生菌中，即可能產(chǎn)生完全符合人們設(shè)計的新抗生素。）

2.基因重組獲得新抗生素。

（通過兩種基因型不同的菌株結(jié)合，使遺傳物質(zhì)重新組合，從中篩選具有新性狀的菌株，其中可能有原抗生素高產(chǎn)株，也可能有產(chǎn)生新抗生素的子株。）3、基因工程（基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)）119第二節(jié)菌種保藏

定義：將有用的微生物以特定培養(yǎng)形態(tài)在特定的環(huán)境條件下存放，以保持種的存活、純粹和遺傳性狀的穩(wěn)定。條件及原理：1.

低營養(yǎng)2.

干燥3.隔氧4.低溫降低代謝速率或使細胞處于休眠狀態(tài)第二節(jié)菌種保藏定義：降低代謝速率或使細胞處于休眠狀態(tài)120一、定期移植保藏法

（斜面低溫保藏法）1．原理制造低溫環(huán)境，降低菌種的新陳代謝活動能力。2、方法將菌種接種于所要求的培養(yǎng)基上、置最適溫度下培養(yǎng)，待得到健壯的菌體后，放在4℃左右，濕度小于70％的條件下保藏．每間隔一定時間重新移植培養(yǎng)1次。一、定期移植保藏法（斜面低溫保藏法）1．原理1213、特點（1）此法廣泛適用于各大類微生物菌種的短期保藏，一般可保存1～6個月左右。（2）優(yōu)點：簡便易行，容易推廣，存活率高；缺點：菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。3、特點122二、石蠟油封藏法1、原理用液體石蠟防止或減少培養(yǎng)基內(nèi)水分蒸發(fā)，隔絕培養(yǎng)物與氧的接觸，降低微生物的代謝活動，推遲細胞老化，延長保存時間。2、方法在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，石蠟油層高出斜面頂端1cm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。二、石蠟油封藏法1、原理1233、特點（1）此法廣泛適用于各大類微生物菌種的中期保藏，一般可保存1～2年左右。石蠟油管的轉(zhuǎn)接和搬運不方便。（2）不適用于保藏某些能分解烴類的菌種。3、特點124三、砂土管保藏法1、原理低溫、干燥、隔氧和無營養(yǎng)物2、方法將砂與土分別洗凈、烘干、過篩，按一定比例分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，121℃蒸汽滅菌1～1.5h，間歇滅菌3次。50℃烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。將待保藏的菌株制成菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約2～4h，用火焰熔封管口（或用石蠟封口），置于干燥器中，在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。三、砂土管保藏法1、原理1253、特點（1）適用于產(chǎn)孢子的微生物及形成芽孢的細菌，對于一些對干燥敏感的細菌及酵母則不適用。（2）保藏期較長，約1～10年。效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟簡便。3、特點126四、麩皮保藏法1、原理以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存。2、方法將麩皮與水以一定的比例拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經(jīng)冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子長成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。四、麩皮保藏法1、原理1273、特點（1）此法適用于產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。（2）操作簡單、經(jīng)濟實惠，工廠較多采用。3、特點128五、冷凍真空干燥保藏法（凍干法）1、原理在較低的溫度下（一15℃以下），快速地將細胞凍結(jié)，并且保持細胞完整，然后在真空中使水分升華。經(jīng)過冷凍干燥的微生物的生長和代謝活動處于極低水平，不易發(fā)生變異或死亡，因此菌種可以保存很長時間。2、方法將準備保存的新鮮斜面菌種，在無菌條件下，裝入滅菌的保護劑（常用脫脂牛奶和血清），制成菌懸液，再用無菌帶橡皮頭的滴管將菌懸液分裝到準備好的安瓿管中，-35℃下預凍15min一2h，然后進行真空于燥，最后將安瓿管真空熔封，低溫避光保存。五、冷凍真空干燥保藏法（凍干法）1、原理1293、特點（1）此法適用于各大類微生物。（2）此法的主要保藏措施是低溫、干燥、缺氧、有保護劑，保藏期一般長達5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。（3）該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機等設(shè)備。3、特點130六、液氮超低溫保藏法1、原理微生物在－130℃的低溫下，所有的代謝活動暫時停止而生命延續(xù)，微生物菌種得以長期保存?？赏ㄟ^加入保護劑來降低細胞內(nèi)溶液的冰點，減少冰晶對細胞的傷害。

2、方法取合適的培養(yǎng)物，以5～10％的甘油或二甲亞砜制成孢子懸液或菌懸液。將此懸液注入無菌的安瓿管或聚丙烯小管內(nèi)，密封，在液氮超低溫（－196℃）下保藏。六、液氮超低溫保藏法1、原理1313、特點（1）適用于各種微生物菌種的保藏。（2）保藏期一般可達到15年以上，是目前公認的最有效的菌種長期保藏技術(shù)之一。（3）優(yōu)點：操作簡便、高效，且可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進行保藏。缺點：需購置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費用較高。3、特點132第三節(jié)

培養(yǎng)基第三節(jié)

培養(yǎng)基133一、培養(yǎng)基組成與成分人工配制的適合于不同微生物生長、繁殖和積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。碳源、氮源、無機鹽、微量元素、水、生長因素、前體、誘導劑或刺激劑、抑制劑例：高氏培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌）：

可溶性淀粉2克，硝酸鉀0.1克，磷酸氫二鉀0.05克，氯化鈉0.05克，硫酸鎂0.05克，硫酸亞鐵0.001克，瓊脂2克，水100毫升。一、培養(yǎng)基組成與成分134（一）碳源：提供微生物生長繁殖所需的能源，構(gòu)成細胞和抗生素的碳骨架。1．碳水化合物：單糖，多糖，多聚糖（蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等）2．脂肪：油（脂肪）水解脂肪酶

甘油（脂肪酸）溶解氧C02+H20

（一）碳源：提供微生物生長繁殖所需的能源，構(gòu)成細胞和抗生素的1353．有機酸有機酸或它們的鹽也能作為微生物的碳源。注意！有機酸的利用常會使pH上升。CH3COONa+O2→2CO2+H2O+NaOH3．有機酸136（二）氮源：主要用于構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等和含氮的目的產(chǎn)物如青霉素、鏈霉素等抗生素。1、無機氮源（快速利用N源）：銨鹽（如氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨），硝酸鹽（如硝酸鈉、硝酸鉀）和氨水等。特點：（1）分解快，能被微生物迅速利用；（2）引起pH變化。(NH4)2S04→2NH3+H2S04生理酸性物質(zhì)NaNO3+4H2→NH3+2H20+NaOH生理堿性物質(zhì)（二）氮源：主要用于構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核1372、有機氮源（慢速利用氮源）：花生餅粉，黃豆餅粉，玉米漿，玉米蛋白粉，蛋白胨，酵母膏。在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌體吸收后再進一步分解代謝．最終用于合成菌體細胞物質(zhì)和含氮的目的產(chǎn)物。2、有機氮源（慢速利用氮源）：花生餅粉，黃豆餅粉，玉米漿，138（三）無機鹽、微量元素：

微生物在生長繁殖和合成目的產(chǎn)物的過程中，需要某些無機鹽和微量元素作為其生理活性物質(zhì)的組成或代謝的調(diào)節(jié)物。P、S（可構(gòu)成細胞物質(zhì)）Mg、Fe（可作為酶的組成成分或維持酶活性）K、Na（調(diào)節(jié)細胞滲透壓）Cu、Zn、Mn（作為酶的輔基和激活劑）（三）無機鹽、微量元素：微生物在生長繁殖和合成目的產(chǎn)物的139（四）水：

（1）構(gòu)成生物體的成分；（2）培養(yǎng)基的組成部分；（3）參與代謝反應；（4）作為代謝反應介質(zhì)；（5）作為物質(zhì)傳遞介質(zhì)；（6）良好的熱導體。（四）水：（1）構(gòu)成生物體的成分；140（五）生長因素：生長因素：有些微生物即使在具有合適的水分、碳源、氮源、無機鹽等的條件下，還不能生長或生長不好，但如果加入少量微生物生長所必需的有機物質(zhì)，則生長良好。通常把這些特殊的營養(yǎng)物質(zhì)稱為生長因素。

1．維生素：是輔酶的組成成分；2．氨基酸：有些生物不能合成某種氨基酸；3．嘌呤和嘧啶：構(gòu)成核酸和輔酶。（五）生長因素：生長因素：有些微生物即使在具有合適的水分141（六）前體

在微生物合成抗生素過程中，有些化合物能被微生物直接利用來構(gòu)成抗生素分子結(jié)構(gòu)的一部分，而化合物本身的結(jié)構(gòu)設(shè)沒有大的變化，這些物質(zhì)稱為抗生素的前體。（六）前體在微生物合成抗生素過程中，有些化合物能被微生物142（七）誘導物或刺激劑：

所謂誘導物是指一些具有調(diào)節(jié)抗生素生物合成能力的小分子物質(zhì)。如：β－吲哚乙酸是金霉素生物合成的刺激物；甲硫氨酸和亮氨酸是頭孢菌素的刺激劑。（七）誘導物或刺激劑：所謂誘導物是指一些具有調(diào)節(jié)抗生素生143（八）抑制劑：在次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)過程中，往往抑制某一代謝途徑，就會使另一代謝途徑活躍。如加入二乙基巴比妥鹽可抑制利福霉素B以外其他利福霉素的生成，從而增加利福霉素B的含量和產(chǎn)量。（八）抑制劑：在次級代謝產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)過程中，往往抑制某一144二、培養(yǎng)基的種類

（一）按來源分類：1、合成培養(yǎng)基（1）所用原料的化學成分明確、穩(wěn)定；（2）實驗重現(xiàn)性好、低泡；（3）適用于研究菌種基本代謝和過程的物質(zhì)變化；（4）營養(yǎng)單一，價格昂貴，不適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。二、培養(yǎng)基的種類（一）按來源分類：1452、天然培養(yǎng)基（天然的動植物產(chǎn)品）（1）營養(yǎng)豐富，適合于微生物的生長繁殖和目的產(chǎn)物的合成。（2）組成培養(yǎng)基的原料來源豐富，價格低廉，適用于工業(yè)生產(chǎn)。（3）組分復雜，不易重復，若對原料質(zhì)量等方面不加控制會嚴重影響生產(chǎn)的穩(wěn)定性。2、天然培養(yǎng)基（天然的動植物產(chǎn)品）146（二）按狀態(tài)分類：

固體培養(yǎng)基：適用于菌種的分離和保存；半固體培養(yǎng)基：（瓊脂用量為0.5～0.8％）主要用于鑒定菌種、觀察細菌運動特征及噬菌體的效價測定等；液體培養(yǎng)基：（水80％～90％），是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基，它有利于氧和物質(zhì)的傳遞。

（二）按狀態(tài)分類：固體培養(yǎng)基：適147（三）按用途分類：

1．孢子培養(yǎng)基供菌種繁殖孢子的固體培養(yǎng)基。能使菌體迅速生長，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)孢子并不易引起菌種發(fā)生變異。例如：高氏培養(yǎng)基（三）按用途分類：1．孢子培養(yǎng)基1482．種子培養(yǎng)基指一、二級種子罐的培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)基。主要含有容易被利用的碳源、氮源、無機鹽等，使孢子很快發(fā)芽、生長以及大量繁殖菌絲體，并使菌體長得粗壯和使各種有關(guān)的初級代謝酶的活力提高。赤霉素產(chǎn)生菌種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.5%,糊精1.0%,花生粉1.5%,MgSO4·7H2O0.1%,KH2PO40.1%,消泡劑0.2%2．種子培養(yǎng)基1493．發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基可供菌種生長、繁殖和合成產(chǎn)物。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進劑等。玉米淀粉7.0％，飴糖2.5％，豆餅粉0.3％，花生粉1.0％，MgSO4·7H2O0.07％，KH2PO40.14％，消沫劑0.05％，α-淀粉酶0.05％3．發(fā)酵培養(yǎng)基150三、影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素

（一）原材料質(zhì)量的影響：玉米漿、黃豆粉、花生餅粉、蛋白胨、淀粉、糊精品種、產(chǎn)地、加工方法、儲藏條件

三、影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素（一）原材料質(zhì)量的影響：151（二）水質(zhì)的影響地質(zhì)（地區(qū)）（地貌）、季節(jié)、處理方法（漂白粉、沉淀劑、消毒劑）和環(huán)境水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。

（二）水質(zhì)的影響152（三）滅菌操作滅菌操作不當不僅會減少培養(yǎng)基中有效的營養(yǎng)成分，還會產(chǎn)生一些有毒物質(zhì)，給發(fā)酵帶來不利的影響。蛋白質(zhì)在高溫下變性，維生素在高溫下失活葡萄糖與含氨基的物質(zhì)反應形成5-羥甲基糖醛和棕色的類黑精（焦化），對微生物有一定的毒性（三）滅菌操作153（四）培養(yǎng)基粘度的影響粘度是培養(yǎng)基物性的重要指標之一，它直接影響氧的傳遞、營養(yǎng)成分、無機鹽、生長因子等的擴散，從而影響細胞的呼吸、營養(yǎng)成分的吸收，最終導致影響目標產(chǎn)物的形成?！跋∨浞健保海?）中間補料；（2）精料發(fā)酵、基礎(chǔ)原料液體化；（3）補加無菌水（四）培養(yǎng)基粘度的影響粘度是培養(yǎng)基物性的重要指標之一，它直154第四節(jié)

滅菌及染菌防治

染菌對抗生素生產(chǎn)過程的危害：（1）消耗培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分；（2）使培養(yǎng)條件如溶氧、粘度發(fā)生變化；（3）有的雜菌會分泌一些對抗生素產(chǎn)生菌有毒或能使抗生素降解失活的物質(zhì)，從而造成抗生素產(chǎn)量大幅度下降；（4）影響后道工序的正常生產(chǎn)、影響產(chǎn)品外觀及內(nèi)在質(zhì)量；（5）如果污染了噬菌體，不僅引起產(chǎn)生菌自溶，而且還會迅速大面積蔓延，嚴重威脅抗生素的生產(chǎn)。第四節(jié)

滅菌及染菌防治染菌對抗生素生產(chǎn)過程的危害：155一、滅菌的理論和技術(shù)滅菌是指用化學或物理的方法殺滅或去除物料及設(shè)備中所有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝過程。（一）物理滅菌射線滅菌熱滅菌（濕熱和干熱）過濾除菌一、滅菌的理論和技術(shù)滅菌是指用化學或物理的方法殺滅或去除物156射線滅菌1、方法：通常用紫外線、高能量的電磁波或粒子輻射滅菌。其中以紫外線最常用。2、原理：紫外線的作用光譜與細菌體內(nèi)核酸的吸收光譜相一致，DNA鏈上核苷酸的堿基因此具有強烈的吸收紫外線的能力，引起DNA結(jié)構(gòu)形式的變化而導致死亡。3、特點：紫外線對芽孢和營養(yǎng)細胞都能起作用，但其穿透力極低，只能用于表面滅菌。對真菌孢子的殺滅能力不大。主要用來進行一定空間內(nèi)空氣的滅菌（如無菌室等）。射線滅菌157干熱滅菌

1、方法：包括火焰滅菌和熱空氣滅菌，常用的干熱空氣滅菌是利用電熱或者紅外線在一定設(shè)備內(nèi)對各種用具物品進行殺菌。生產(chǎn)上常用的干熱滅菌的條件是160℃，時間1－2h。2、原理：高溫時微生物各種與溫度有關(guān)的氧化過程速率增快。3、特點：時間長、耗熱量大，應用不廣。一般用于滅菌后要求保持干燥狀態(tài)的物料。干熱滅菌158濕熱滅菌1、方法：直接用加壓濕蒸汽進行物料或設(shè)備容器的滅菌。用蒸汽將物料升溫到115－140℃保持一定時間，可殺死各種微生物。常用的滅菌條件是120℃，20－30min。2、原理：在高溫及有水分存在的條件下，微生物細胞中的蛋白質(zhì)極易凝固而引起微生物的死亡。3、特點：經(jīng)濟，快速，適用于大量培養(yǎng)基及發(fā)酵設(shè)備的滅菌。濕熱滅菌159介質(zhì)過濾除菌對培養(yǎng)液中某此不耐熱的成分可采用過濾除菌法。發(fā)酵過程中所用的大量無菌空氣也是用過濾除菌法。介質(zhì)過濾除菌160（二）化學滅菌

1、定義：化學藥劑滅菌是通過藥劑與微生物細胞接觸而發(fā)生諸如蛋白質(zhì)變性等作用而達到殺滅微生物的目的。2、滅菌用化學藥劑必須具備以下四個條件：（1）殺菌譜廣。有效濃度低且殺滅微生物的速度快。（2）性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于水且可在常溫下使用。（3）基本上不受有機物、酸、堿和其他物理化學因素的影響。（4）無腐蝕性，無毒或低毒，使用安全。（二）化學滅菌

1、定義：化學藥劑滅菌是通過藥劑與微生物細胞1613、常用的化學藥劑：乙醇、甲醛、苯扎溴銨（新潔爾滅）、戊二醛、環(huán)氧乙烷、漂白粉和苯酚（石炭酸）等。4、用途：化學滅菌主要用來進行皮膚表面、器具及無菌區(qū)域的滅菌，很少用于培養(yǎng)基的滅菌。3、常用的化學藥劑：乙醇、甲醛、苯扎溴銨（新潔爾滅）、戊二醛162二、培養(yǎng)基及有關(guān)設(shè)備的滅菌

（一）實罐滅菌（分批滅菌）

分批滅菌是將配制好的培養(yǎng)基投入發(fā)酵罐中，經(jīng)過間接蒸汽預熱后，直接通入飽和蒸汽使培養(yǎng)基和設(shè)備一起滅菌。流程：培養(yǎng)基預熱培養(yǎng)基滅菌冷卻二、培養(yǎng)基及有關(guān)設(shè)備的滅菌（一）實罐滅菌（分批滅菌）163第三章微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)課件164注意事項：1．培養(yǎng)基預熱：80～90℃。避免產(chǎn)生冷凝水造成培養(yǎng)基稀釋。2．培養(yǎng)基滅菌：120～130℃，保溫30min。各路蒸汽進口要暢通，防止逆流，罐內(nèi)液體翻動要劇烈，以使罐內(nèi)物料達到均一的滅菌溫度。排汽量不宜過大，以節(jié)約蒸汽用量。3．冷卻：滅菌將要結(jié)束時，應立即引入無菌空氣以保持罐壓，然后開夾套或蛇管冷卻水冷卻，避免罐壓迅速下降，產(chǎn)生負壓而抽吸外界空氣。注意事項：165（二）空罐滅菌空罐滅菌即發(fā)酵罐罐體的滅菌?？展逌缇话憔S持罐壓1.5×105～2.0×105Pa，罐溫125～130℃，30～45min，直接蒸汽法。滅菌后為避免罐壓急速下降造成負壓，要等到經(jīng)過滅菌的無菌培養(yǎng)基輸入罐內(nèi)后，才可以開冷卻水冷卻。（二）空罐滅菌空罐滅菌即發(fā)酵罐罐體的滅菌。166（三）連續(xù)滅菌培養(yǎng)基通過連續(xù)滅菌裝置，進行快速這續(xù)加熱滅菌，并快速冷卻，再立即輸入預先經(jīng)過空罐滅菌后的發(fā)酵罐中。流程：培養(yǎng)基預熱連續(xù)滅菌維持滅菌溫度冷卻（三）連續(xù)滅菌培養(yǎng)基通過連續(xù)滅菌裝置，進行快速這續(xù)加熱滅菌167第三章微生物制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)課件168注意事項：1．培養(yǎng)基預熱：60一75℃，避免連續(xù)滅菌時由于料液與蒸汽溫度相差過大而產(chǎn)生水汽撞擊聲。2．連續(xù)滅菌：連續(xù)滅菌的溫度一般以126一132℃為宜。3．維持滅菌溫度：利用維持罐使料液在滅菌溫度下保持5—7min，以達到滅菌的目的。4．冷卻：采用冷水噴淋時，噴淋前冷卻管內(nèi)應充滿填料。注意事項：169特點：（1）連續(xù)滅菌的時間短、溫度較高。培養(yǎng)基受到的破壞較少，故質(zhì)量較好。連續(xù)滅菌時蒸汽負荷均衡一致。（2）不足之處是所需設(shè)備較多，操作較麻煩，染菌的機會也相應增多。特點：170（四）發(fā)酵附屬設(shè)備及管路的滅菌

發(fā)酵附屬設(shè)備有總空氣過濾器、管道、計量罐、補料罐等。（四）發(fā)酵附屬設(shè)備及管路的滅菌

發(fā)