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文檔簡介
細(xì)胞培養(yǎng)液的配制
培養(yǎng)基的選擇
依據(jù):經(jīng)驗(yàn)、文獻(xiàn)、嘗試常用:RPMI1640、DMEM
培養(yǎng)基的來源
市售干粉培養(yǎng)基---自己配制液體培養(yǎng)基---直接使用(注意有效期)
培養(yǎng)基的除菌方法
過濾除菌:(1)正壓過濾---效率高
(2)負(fù)壓過濾---效率低高壓蒸氣滅菌:
不含谷氨酰胺,滅菌后另外添加培養(yǎng)基附加成分的添加
按使用說明或?qū)嶒?yàn)要求添加配制時加:碳酸氫鈉、抗生素、血清等臨用前加:生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等
配制步驟
(1)10.4g/包培養(yǎng)粉溶至1L三蒸水中,磁力攪拌20min(2)加2gNaHCO3/L,繼續(xù)攪拌10min(3)加青霉素100U/mL(80萬U溶至4ml三蒸水,取0.5ml)
鏈霉素100U/mL(100萬U溶至5ml三蒸水,取0.5ml))(4)加1NHCl約3mL,調(diào)pH至7.2,繼續(xù)攪拌(5)按要求加血清(血清一般需經(jīng)56℃,30min滅活)例如:10%胎牛血清無血清培養(yǎng)液900ml
滅活胎牛血清100ml(6)正壓過濾除菌(氣壓適當(dāng),防止濾膜破裂)(7)分裝,貯存于4℃,2周內(nèi)用完。(8)無菌試驗(yàn):取樣,37℃放置24-72h,無細(xì)菌、霉菌污染方可使用注意事項(xiàng)
谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,4℃,7d分解50%,放置兩周以上時,根據(jù)需要添加谷氨酰胺。配制100×母液(200mmol/L,即29.22g/L),每100ml加入0.5-2ml母液,終濃度1-4mmol/L抗生素在37℃穩(wěn)定性維持3-4d,可控制輕度污染。防污染重在無菌操作
培養(yǎng)液配制過程
(以RPMI1640為例)(2)培養(yǎng)粉、NaHCO3、1NHCl、青霉素、鏈霉素、血清、新鮮制備的三蒸水取孔徑為0.45μm和0.22μm濾膜各一張,浸入三蒸水中
將裝有濾膜的濾器包裝后高壓蒸氣消毒
3.液體配制①將培養(yǎng)粉倒入容器中②加入新鮮制備的三蒸水磁力攪拌器充分?jǐn)嚢琚郯凑諏?shí)驗(yàn)的具體要求分別加入NaHCO3和青鏈霉素(青霉素100U/mL:80萬U溶至4ml三蒸水,取0.5ml;鏈霉素100U/mL:100萬U溶至5ml三蒸水,取0.5ml)⑤加入1NHCl約3mL,調(diào)整pH至7.2-7.4
磁力攪拌器充
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