基因工程課件

第11章基因工程第1節(jié)基因工程概述第2節(jié)基因的分離第3節(jié)外源基因?qū)胧荏w第4節(jié)轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)與鑒定第5節(jié)基因工程的應(yīng)用第11章基因工程第1節(jié)基因工程概述遺傳工程（geneticengineering），也稱生物工程，利用工程技術(shù)的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或產(chǎn)品，從而改良生物體的一種遺傳學(xué)手段。核心是利用重組DNA技術(shù)，在分子水平上操作修飾改變生物體。細(xì)胞工程（cellengineering）基因工程（geneengineering）酶工程（enzymeengineering）發(fā)酵工程（fermentationengineering）第1節(jié)基因工程概述遺傳工程（geneticengineering），也稱生物基因工程（geneengineering）利用人工的方法把生物的遺傳物質(zhì)在體外進(jìn)行切割、拼接和重組，獲得重組DNA分子，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞或個(gè)體，使受體的遺傳特性得到修飾或改變的過(guò)程?；蚬こ滩僮鞯膶?duì)象是DNA分子，首先把目標(biāo)基因克隆出來(lái)插入到一定的載體中，然后將重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞，并使其保持和遺傳下去。

第1節(jié)基因工程概述基因工程（geneengineering）第1節(jié)基因工目的基因的獲目的基因與載體的連接成重組DNA分子重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞篩選重組克隆基因表達(dá)與產(chǎn)物分離基因工程的內(nèi)容

第1節(jié)基因工程概述目的基因的獲基因工程的內(nèi)容第1節(jié)基因工程概述第11章基因工程課件第11章基因工程課件第2節(jié)

基因的分離一工具酶載體三基因分離方法

第2節(jié)基因的分離一工具酶第2節(jié)

基因的分離一、工具酶（一）限制性內(nèi)切核酸酶

(restrictionenzymes)限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）是細(xì)菌中降解外來(lái)DNA分子的一類酶。細(xì)菌中限制—修飾現(xiàn)象：作用于同一DNA的兩種酶——分解DNA的限制酶和改變DNA堿基結(jié)構(gòu)使其免遭限制酶分解的修飾酶。通過(guò)某些堿基進(jìn)行甲基化修飾，使得限制酶不能進(jìn)行切割。而外來(lái)的DNA在沒有被甲基化，限制酶將其降解。第2節(jié)基因的分離一、工具酶（一）限制性內(nèi)切核酸酶★共同的特性：只切割雙鏈DNA分子，不切單鏈DNA；每種酶有其特定的核苷酸序列識(shí)別特異性；需要鎂離子激活等。（一）限制性內(nèi)切核酸酶★共同的特性：★限制酶可分為3類。Ⅰ型酶：只有EcoB和EcoK兩種，具有催化限制性切割和修飾核苷酸2種功能。Ⅱ型酶：在遺傳工程中應(yīng)用最廣泛。①有特異識(shí)別和切割的序列部位，被切割的DNA分子形成單鏈的斷裂；②斷裂的部位通常不是直接相對(duì)的，結(jié)果所形成的DNA片段常具有堿基互補(bǔ)的單鏈尾巴（粘性末端），使其能夠重新連接；③內(nèi)切酶的切割和修飾功能由兩個(gè)不同的酶催化所完成。Ⅲ型酶具有特異的識(shí)別位點(diǎn)，這種識(shí)別位點(diǎn)是非對(duì)稱的。（一）限制性內(nèi)切核酸酶★限制酶可分為3類。（一）限制性內(nèi)切核酸酶（一）限制性內(nèi)切核酸酶（一）限制性內(nèi)切核酸酶通過(guò)用相同的限制性內(nèi)切核酸酶切割形成一個(gè)重組DNA分子（一）限制性內(nèi)切核酸酶通過(guò)用相同的限制性內(nèi)切核酸酶切割形成一個(gè)重組DNA分子（一第11章基因工程課件（二）DNA連接酶（ligase）在分子克隆中使用的DNA連接酶有兩種：大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶。催化DNA中相鄰的3’–OH和5’–磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段DNA連接起來(lái)。（二）DNA連接酶（ligase）在分子克隆中使用的DNA連（三）反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）★反轉(zhuǎn)錄酶是一類以RNA為模板來(lái)指導(dǎo)DNA合成的DNA聚合酶，所以又稱為依賴于RNA的DNA聚合酶。★反轉(zhuǎn)錄酶在遺傳工程中的主要用途是以mRNA為模板合成cDNA。（三）反轉(zhuǎn)錄酶★反轉(zhuǎn)錄酶是一類以RNA為模板來(lái)指導(dǎo)DNA合成（四）PCR◆聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是體外快速擴(kuò)增DNA的方法?！鬚CR反應(yīng)包括三個(gè)步驟：

●變性：在94-95℃使模板DNA的雙鏈變性成單鏈。

●復(fù)性：兩個(gè)引物分別與單鏈DNA互補(bǔ)復(fù)性，復(fù)性的溫度在50-60℃

●延伸：在引物的引導(dǎo)及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互補(bǔ)鏈

◆

這三個(gè)步驟稱為一個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)常有25-35個(gè)循環(huán)?！鬚CR.EXE（四）PCR◆聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymeras（四）PCR

PCR產(chǎn)物可以通過(guò)電泳檢測(cè)瓊脂糖電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（四）PCRPCR產(chǎn)物可以通過(guò)電泳檢測(cè)瓊脂糖電泳聚丙烯酰二載體

載體（vector）是將外源基因送入受體細(xì)胞的工具。作為載體DNA分子，需要具備：在宿主細(xì)胞中能獨(dú)立復(fù)制，有獨(dú)立的復(fù)制起始位點(diǎn)；載體DNA分子中有一段不影響其復(fù)制的非必需區(qū)域，即有限制酶切位點(diǎn)，允許外源基因插入且插入后隨載體DNA分子一同進(jìn)行復(fù)制或擴(kuò)增；有選擇標(biāo)記，便于選擇含重組DNA分子的寄主細(xì)胞；分子量小，多拷貝，易于操作。除了上述特點(diǎn)外，一般還要求載體載荷外源DNA的幅度要寬，具有安全性等。二載體載體（vector）是將外源基因送入受體細(xì)胞的工（一）質(zhì)粒

◆質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌染色體外存在的一種能夠自我復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，大小1kb～200kb。質(zhì)粒常常帶有一些特殊的基因，如致死基因，抗抗生素的基因等等。一般質(zhì)粒都含有一個(gè)復(fù)制起始區(qū)，可獨(dú)立復(fù)制。質(zhì)粒DNA復(fù)制與宿主之間的關(guān)系，可分為“嚴(yán)謹(jǐn)型”和“松弛型”?！皣?yán)謹(jǐn)型”質(zhì)粒在每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)通常1~3個(gè)，而“松弛型”通常在10個(gè)以上，可高達(dá)200個(gè)拷貝。◆一般質(zhì)粒通過(guò)改造后才能用于遺傳工程。

（一）質(zhì)粒◆質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌染色體外存在的（一）質(zhì)粒

pUC18可以克隆比較大的DNA片段，在細(xì)胞中產(chǎn)生500個(gè)拷貝左右。有一個(gè)多克隆位點(diǎn)，位于大腸桿菌的lacZ基因之內(nèi)，有利于篩選和分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞。（一）質(zhì)粒pUC18可以克隆比較大的DNA片段，在細(xì)胞篩選的原理是：細(xì)菌細(xì)胞含有野生質(zhì)粒，在含有X-gal（5-溴-氯吲哚-半乳糖苷酶）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生蘭色菌斑；插入克隆片段后，lacZ基因失去功能，不能代謝X-gal，從而產(chǎn)生白色菌斑。（一）質(zhì)粒

篩選的原理是：細(xì)菌細(xì)胞含有野生質(zhì)粒，在含有X-gal（5-溴（二）病毒載體◆

λ噬菌體基因組全長(zhǎng)48kb。具有粘性末端(cos位點(diǎn))。中間約1/3的序列為中間基因簇(centralgenecluster)，兩端為DNA左、右臂。λ基因組的中間基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影響噬菌體感染細(xì)菌及形成噬菌斑的能力。λ噬菌體（二）病毒載體◆λ噬菌體基因組全長(zhǎng)48kb。具有粘性末端（二）病毒載體◆λ噬菌體載體可接受15kb-23kb的外源DNA片段，它既可作為克隆載體，也可作為表達(dá)載體，廣泛用于各類基因庫(kù)的構(gòu)建。（二）病毒載體◆λ噬菌體載體可接受15kb-23kb(三)克隆大片段載體粘粒載體、細(xì)菌人工染色體和酵母人工染色體載體等。粘粒載體（cosmid）是一類含有cos位點(diǎn)的質(zhì)粒載體.兼有λ噬菌體的高效感染能力和質(zhì)粒的易于克隆和選擇的優(yōu)點(diǎn)，既能像質(zhì)粒一樣在寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，又能象λDNA一樣被包裝到噬菌體顆粒中去。(三)克隆大片段載體粘粒載體、細(xì)菌人工染色體和酵母人工與噬菌體載體和質(zhì)粒載體相比具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：具有cos位點(diǎn)，能高效地轉(zhuǎn)化大腸桿菌，能在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)自身環(huán)化，并能在大腸桿菌中復(fù)制；有像質(zhì)粒一樣的選擇標(biāo)記；cosmid載體比較小，但能插入較大的外源片段，可克隆外源片段的長(zhǎng)度在15~45kb之間。由于cosmid載體的大片段克隆能力，多用于基因組文庫(kù)的構(gòu)建，而λ噬菌體載體多用于cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。已有多種粘粒載體可用于基因克隆，pJB8是最常用的粘粒載體之一粘粒載體與噬菌體載體和質(zhì)粒載體相比具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：粘粒載體細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome，BAC）

◆

BAC載體是基于細(xì)菌的性因子(F因子)質(zhì)粒的一些特點(diǎn)構(gòu)建的。F因子在細(xì)菌接合時(shí)轉(zhuǎn)移1Mb的細(xì)菌染色體片段。將F因子經(jīng)基因工程改良構(gòu)成的BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段。◆帶有外源片段的BAC載體在細(xì)菌細(xì)胞中通常僅單個(gè)拷貝，這一特點(diǎn)有利于保持DNA大分子，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制而不發(fā)生重組。BAC載體本身分子量小，具有氯霉素抗性選擇基因及多克隆位點(diǎn)。細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialc第11章基因工程課件酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）◆酵母人工染色體具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因?！?/p>

YAC可以接受1-2Mb的外源DNA片段，這一特點(diǎn)使YAC成為人類基因組計(jì)劃及圖位克隆分離基因的重要工具，并促進(jìn)了發(fā)展人類人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。酵母人工染色體（yeastartificialchro第11章基因工程課件三基因分離方法基于基因庫(kù)的分離基因方法T-DNA標(biāo)簽克隆基因基于PCR的基因克隆人工合成基因三基因分離方法基于基因庫(kù)的分離基因方法1構(gòu)建基因文庫(kù)基因文庫(kù)(library)是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因文庫(kù)中分離基因，首先要構(gòu)建基因文庫(kù)。只有利用合乎要求的基因文庫(kù)才有可能篩選出所需要的基因，很多分子遺傳學(xué)工作才能繼續(xù)深入下去。（一）基于基因文庫(kù)的分離基因方法1構(gòu)建基因文庫(kù)（一）基于基因文庫(kù)的分離基因方法核基因文庫(kù)◆核基因文庫(kù)(genomiclibrary或genomicbank)是將某一生物的全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的?！敉ǔ５姆椒ㄊ牵M量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分離選擇具有一定長(zhǎng)度(大于15kb)的DNA片段，與適宜的載體連接構(gòu)成重組DNA分子,選擇相應(yīng)的宿主細(xì)胞用于克隆。載體可以是質(zhì)粒，噬菌體，BAC或YAC等（一）基于基因庫(kù)的分離基因方法核基因文庫(kù)（一）基于基因庫(kù)的分離基因方法◆理想的核基因文庫(kù)應(yīng)當(dāng)能包括全部的基因組序列。如果每一個(gè)克隆包括的DNA片段大，則總克隆數(shù)目少，常選擇能接受較大片段的載體?！魴z測(cè)是否包括一個(gè)完整的基因組序列的公式：

◆例:人類基因組3.0x106kb,以λEMBL作載體，插入片段的平均長(zhǎng)度為17kb，p為99%時(shí),基因庫(kù)應(yīng)有8.1x105個(gè)

重組噬菌體。1.核基因庫(kù)◆理想的核基因文庫(kù)應(yīng)當(dāng)能包括全部的基因組序列。如果每一個(gè)克隆染色體基因庫(kù)

◆將基因組的一部分（如一條染色體）用來(lái)構(gòu)建基因庫(kù)，對(duì)于選擇特異基因及分析染色體結(jié)構(gòu)和組織十分有價(jià)值。果蠅X染色體上的一個(gè)片段，具有50多個(gè)多線染色體帶，利用微切割技術(shù)切割，抽提DNA，構(gòu)建染色體片段基因庫(kù)。在人類基因組項(xiàng)目研究中，利用流動(dòng)細(xì)胞分揀技術(shù)將人類染色體分開，構(gòu)建單個(gè)染色體基因庫(kù)，大大加速了人類基因組作圖和分析。在酵母菌中，利用一種改良的脈沖電泳方法，將酵母菌的16條染色體據(jù)分開，用于構(gòu)建染色體庫(kù)。染色體基因庫(kù)◆將基因組的一部分（如一條染色體）用來(lái)構(gòu)建基因cDNA庫(kù)◆

以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA(cDNA)，構(gòu)建的基因庫(kù)cDNA庫(kù)◆以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA◆

cDNA庫(kù)僅具有用于分離mRNA的細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)的基因的mRNA序列，僅包括基因組的部分基因序列?！魳?gòu)建什么樣的基因庫(kù)取決于研究目的。cDNA庫(kù)對(duì)于研究基因的表達(dá)模式、分離某一特定基因是十分有用的。如分離在某一細(xì)胞或組織高效表達(dá)的某種基因?！敉ǔＪ菍DNA庫(kù)與核基因庫(kù)配合使用，以便既能得到基因的編碼序列，又可得到基因的調(diào)控序列。cDNA庫(kù)

◆cDNA庫(kù)僅具有用于分離mRNA的細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)的基因2篩選基因庫(kù)

◆從基因庫(kù)中篩選、分離基因，可據(jù)對(duì)待選基因相關(guān)信息的了解程度，確定篩選方法和條件?！舫Ｓ梅椒ㄊ抢靡欢魏塑账嵝蛄?DNA，cDNA或寡核苷酸)作探針(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫(kù)。2篩選基因庫(kù)◆從基因庫(kù)中篩選、分離基因，可據(jù)對(duì)待選基因相◆將重組噬菌體(來(lái)自基因庫(kù))感染的宿主細(xì)菌細(xì)胞與少量培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增后形成噬菌斑?！魧⑴囵B(yǎng)皿中的噬菌斑轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，變性，用標(biāo)記的探針與膜上的噬菌體DNA雜交，雜交膜用X-光片放射自顯影，檢測(cè)雜交信號(hào)。◆與探針雜交的噬菌斑即為陽(yáng)性克隆。根據(jù)雜交信號(hào)的位置，找出培養(yǎng)皿中所對(duì)應(yīng)的噬菌斑，培養(yǎng)，制備DNA。菌斑雜交法篩選λ噬菌體核基因庫(kù)◆將重組噬菌體(來(lái)自基因庫(kù))感染的宿主細(xì)菌細(xì)胞與少量培養(yǎng)基混菌落雜交技術(shù)尋找目標(biāo)DNA克隆菌落雜交技術(shù)尋找目標(biāo)DNA克隆從文庫(kù)中篩選獲得目標(biāo)克隆后，只有進(jìn)行測(cè)序才能進(jìn)行生物信息分析和功能預(yù)測(cè)。（三）序列測(cè)定和分析限制性酶圖譜

從文庫(kù)中篩選獲得目標(biāo)克隆后，只有進(jìn)行測(cè)序才能進(jìn)行生物信息分析◆一個(gè)15kbDNA片段的限制性酶圖譜構(gòu)建★實(shí)驗(yàn)過(guò)程：首先將陽(yáng)性克隆DNA分裝在3個(gè)管中，分別用不同的酶及酶的組合酶切DNA。酶切的產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，染色，在紫外燈下可見到DNA帶。各條帶的分子量大小可根據(jù)分子量標(biāo)記估測(cè)。限制性酶圖譜

◆一個(gè)15kbDNA片段的限制性酶圖譜構(gòu)建限制性酶圖譜★結(jié)果分析●從凝膠電泳結(jié)果可見，模式Ⅱ就是這個(gè)15kbDNA片段用上述兩種酶酶切后的限制性酶圖譜。●將不同DNA用限制性酶消化，產(chǎn)生的多態(tài)性，即限制性酶片段長(zhǎng)度的多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，用來(lái)分析DNA水平的變異程度，進(jìn)行基因組圖譜分析。限制性酶圖譜

★結(jié)果分析限制性酶圖譜（二）T-DNA標(biāo)簽克隆基因基本原理：利用T-DNA插入突變創(chuàng)造突變體，獲得各突變體的純合材料；然后分析突變性狀與T-DNA的共分離關(guān)系，存在共分離的材料用適當(dāng)?shù)腜CR克隆技術(shù)獲得T-DNA的側(cè)翼基因組序列；用其作探針篩選基因文庫(kù)，獲取目標(biāo)基因或克隆，再進(jìn)行下一步的分析。（二）T-DNA標(biāo)簽克隆基因基本原理：T-DNA載體構(gòu)建↓

轉(zhuǎn)化植物（T1，T-DNA雜合子)收獲T2種子↓

篩選T2，獲突變子，應(yīng)為3:1分離↓

確定T-DNA與突變型共分離的個(gè)體↓

產(chǎn)生純合后代↓

克隆T-DNA兩側(cè)的植物DNA↓

利用側(cè)翼DNA序列作探針從該植物的cDNA文庫(kù)中釣取基因↓

基因功能的驗(yàn)證T-DNA載體構(gòu)建（三）基于PCR的基因克隆基于PCR的DNA克隆與基于載體的克隆技術(shù)相比具有一定優(yōu)越性。PCR反應(yīng)速度很快，可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，而載體克隆需要幾周時(shí)間。PCR反應(yīng)非常靈敏，可以用來(lái)擴(kuò)增痕量樣品的DNA。對(duì)于部分降解、甚至污染，用載體克隆無(wú)法進(jìn)行的DNA樣品，PCR擴(kuò)增仍可獲得目的基因克隆同源克?。ㄈ┗赑CR的基因克隆基于PCR的DNA克隆與基于載體的（四）人工合成基因

◆根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來(lái)，可以很快地人工合成基因?！衾纾紫然瘜W(xué)合成多個(gè)含有80-100個(gè)核苷酸的寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸之間具有19-24個(gè)核苷酸的重疊序列，再將各個(gè)寡核苷酸等量混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作為引物合成新鏈，使單鏈部分補(bǔ)齊成為雙鏈，再用兩個(gè)PCR引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出DNA片段。若將兩個(gè)DNA片段放在一起，經(jīng)SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)擴(kuò)增出完整的基因片段。（四）人工合成基因◆根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合第11章基因工程課件第3節(jié)外源基因?qū)胧荏w

一、重組DNA導(dǎo)入原核生物（細(xì)菌）二、植物表達(dá)載體三、外源基因?qū)胫参锏?節(jié)外源基因?qū)胧荏w一、重組DNA導(dǎo)入原核生物（細(xì)一、重組DNA導(dǎo)入原核生物（細(xì)菌）CaCl2處理轉(zhuǎn)化。CaCl2處理轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚不清楚，可能是CaCl2處理破壞了細(xì)菌的細(xì)胞壁，使游離的DNA分子被攝入受體細(xì)胞。這種方法的轉(zhuǎn)化頻率大概是千分之一。電激轉(zhuǎn)化（electroporation）。是目前常用的一種轉(zhuǎn)化方式。在電轉(zhuǎn)化儀施加的強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，使受體細(xì)胞細(xì)胞壁具有可逆的電穿孔，DNA分子進(jìn)入細(xì)胞。結(jié)合（conjugation）。結(jié)合是原核生物細(xì)胞與細(xì)胞接觸而進(jìn)行遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的一種自然過(guò)程。一、重組DNA導(dǎo)入原核生物（細(xì)菌）CaCl2處理轉(zhuǎn)化。CaC二、植物表達(dá)載體◆

Ti質(zhì)粒是一種細(xì)菌質(zhì)粒，它自然存在于土壤農(nóng)桿菌細(xì)胞中。土壤農(nóng)桿菌可感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，使之產(chǎn)生冠癭瘤(growngalltumors)?！鬞i質(zhì)粒。Ti質(zhì)粒的一部分DNA叫做轉(zhuǎn)移DNA（T-DNA），當(dāng)T-DNA整合到宿主植物細(xì)胞的染色體后，就誘導(dǎo)出根瘤，并使根瘤細(xì)胞合成冠癭堿(opine),作為土壤農(nóng)桿菌的碳源和氮源。二、植物表達(dá)載體◆Ti質(zhì)粒是一種細(xì)菌質(zhì)粒，它自然存在于土壤（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）

T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上導(dǎo)入植物細(xì)胞的一段DNA。

T-DNA兩端各有一段25bp的重復(fù)序列(LB,RB)。T-DNA攜帶的致瘤基因是一些與激素合成有關(guān)的基因，由于激素合成基因使細(xì)胞處于不停的分裂狀態(tài)，形成冠癭瘤，不能進(jìn)行細(xì)胞分化。Ti質(zhì)粒改造后才能應(yīng)用于植物的基因工程。保留T-DNA兩端的末端序列，然后用外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不具有成瘤能力。（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregi（2）Vir區(qū)（virolenceregion）Vir區(qū)段上的基因與T-DNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的遺傳過(guò)程有關(guān)，區(qū)段上的基因能夠使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。Vir區(qū)段總長(zhǎng)度大約35kb，由7個(gè)互補(bǔ)群組成，分別命名為VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH。（3）Con區(qū)(regionsencodingconjugations)

該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。

（4）Ori區(qū)(originofreplication)

該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。（2）Vir區(qū)（virolenceregion）Ti質(zhì)粒分子受到信號(hào)分子的激活作用之后，virD基因編碼的一種核酸內(nèi)切酶，先在T-DNA的RB序列中的第3和第4堿基之間切開一個(gè)單鏈缺口，隨后在T-DNA同一條鏈的LB序列中切出第二個(gè)單鏈缺口。T-DNA便以單鏈形式釋放出來(lái)，并在RB序列的引導(dǎo)下定向地轉(zhuǎn)移到寄主植物細(xì)胞。在有關(guān)的植物細(xì)胞酶體系的催化作用下，合成互補(bǔ)鏈形成雙鏈形式的T-DNA分子。在一系列酶的參與下整合進(jìn)植物基因組。這種整合是一種非正常重組。T-DNA轉(zhuǎn)移的機(jī)制Ti質(zhì)粒分子受到信號(hào)分子的激活作用之后，virD基因編碼的一（1）雙元載體系統(tǒng)（binaryvector）具有兩個(gè)質(zhì)?！┧筚|(zhì)粒和Ti質(zhì)粒。（2）共整合載體（integratedvector）共整合載體系統(tǒng)包括在T-DNA上的激素合成區(qū)經(jīng)過(guò)突變后的Ti質(zhì)粒和中間載體兩部分。Ti質(zhì)粒的衍生載體（1）雙元載體系統(tǒng)（binaryvector）Ti質(zhì)粒的衍發(fā)根農(nóng)桿菌存在另一種質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒也可完成外源基因向植物的轉(zhuǎn)移工作。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后植物細(xì)胞產(chǎn)生許多不定根，這種不定根生長(zhǎng)迅速，不斷分枝成毛狀，故稱之為毛狀根，也稱為發(fā)狀根，分別簡(jiǎn)稱為毛根或發(fā)根，Ri質(zhì)粒為根誘導(dǎo)質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)很相似，可以分為T區(qū)、vir區(qū)、ori區(qū)和其它區(qū)域等幾個(gè)部分。Ri質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌存在另一種質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒T區(qū)與Ti質(zhì)粒的T-DNA十分相似：①T區(qū)的左右邊界序列。左右邊界上含有25bp的重復(fù)序列。②TL-DNA區(qū)。該區(qū)中含有與毛狀根形成有關(guān)的rolA、B、C、D基因群。③TR-DNA區(qū)。該區(qū)中含有與農(nóng)桿堿合成有關(guān)的基因（ags）和生長(zhǎng)素合成有關(guān)的基因（tms1、

tms2）。ags基因在轉(zhuǎn)化的初期起著重要的作用，是不定根產(chǎn)生的關(guān)鍵Ri質(zhì)粒T區(qū)與Ti質(zhì)粒的T-DNA十分相似：Ri質(zhì)粒高等植物基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法為兩類：非生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是以植物自身的生殖系統(tǒng)種質(zhì)細(xì)胞為受體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化，如花粉浸泡外源DNA、DNA注射受粉后的子房等；直接轉(zhuǎn)化是采用物理或化學(xué)方法直接將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，如基因槍法等。生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。在生物載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因是常用的方法。三、外源基因?qū)胫参锔叩戎参锘蜻z傳轉(zhuǎn)化的方法為兩類：三、外源基因?qū)胫参镄枰邆淙缦聴l件：高效的植株再生體系。選擇容易從體細(xì)胞再生植株的受體基因型是獲得轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。受體植物細(xì)胞對(duì)農(nóng)桿菌要有很高的親和力。一般認(rèn)為受體細(xì)胞應(yīng)處于高度的分裂狀態(tài)，T-DNA才能插入植物基因組；具有有效的選擇系統(tǒng)。必須有一個(gè)理想的選擇方法將轉(zhuǎn)化細(xì)胞從非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選擇出來(lái)；穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因表達(dá)。外源基因轉(zhuǎn)入植物后應(yīng)能傳代并穩(wěn)定表達(dá)。（一）農(nóng)桿菌法需要具備如下條件：（一）農(nóng)桿菌法一般技術(shù)程序農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞、細(xì)菌與植物細(xì)胞共培養(yǎng)、在篩選培養(yǎng)基上篩選、獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化并再生植株。葉圓盤轉(zhuǎn)化法。帶有傷口的植物葉片的圓盤。使用的外植體可以是葉圓盤、下胚軸、胚性愈傷組織等。（一）農(nóng)桿菌法一般技術(shù)程序（一）農(nóng)桿菌法F1.共培養(yǎng)2.在選擇培養(yǎng)基上篩選3.篩選獲得的抗性愈傷5.胚萌發(fā)成苗6.轉(zhuǎn)基因植株移栽大田4.抗性愈傷分化成胚狀體F1.共培養(yǎng)2.在選擇培養(yǎng)基上篩選3.篩選獲得的抗性愈選擇是為了將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在構(gòu)建載體時(shí)，往往在目的基因上連上一個(gè)選擇標(biāo)記基因。通常使用的是抗生素抗性基因，如NPTII基因——新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，能分解卡那霉素等抗生素。其它選擇標(biāo)記基因，如抗除草劑基因，報(bào)告基因（如：GUS基因）等。選擇系統(tǒng)（一）農(nóng)桿菌法選擇是為了將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)基因槍法（genegun）是依賴高速的金屬微粒將外源基因?qū)牖罴?xì)胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。（二）基因槍介法基因槍法（genegun）是依賴高速的金屬微粒將外源基因?qū)?yōu)點(diǎn)：（1）無(wú)宿主限制?？梢詫?duì)任何基因型材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究；(2)靶受體幾乎包括所有具有潛在分化能力的組織或細(xì)胞。（3）易于操作。缺點(diǎn)：如轉(zhuǎn)化頻率低、嵌合體較多、結(jié)果的重復(fù)性差，轉(zhuǎn)化的外源基因以多拷貝居多，易導(dǎo)致基因沉默，實(shí)驗(yàn)成本較高等。還有很多將外源基因引入植物基因組的方法，如電激法、花粉管通道法、超聲波法等，它們都在不同程度上得到應(yīng)用。（二）基因槍法優(yōu)點(diǎn)：（1）無(wú)宿主限制?？梢詫?duì)任何基因型材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究；(第4節(jié)轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)與鑒定一、分子檢測(cè)二、生物學(xué)性狀鑒定第4節(jié)轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)與鑒定一、分子檢測(cè)PCRSouthern雜交Northern雜交Western雜交常用的轉(zhuǎn)基因生物分子檢測(cè)手段有一、分子檢測(cè)PCR常用的轉(zhuǎn)基因生物分子檢測(cè)手段有一、分子檢測(cè)PCR檢測(cè)PCR檢測(cè)外源基因的原理是根據(jù)被轉(zhuǎn)移的外源基因（目的基因或選擇標(biāo)記基因）設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增外源基因的片段。如果擴(kuò)增出的片段與設(shè)計(jì)的一對(duì)引物之間的實(shí)際片段在長(zhǎng)度上相吻合，說(shuō)明基因已轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。在進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)應(yīng)設(shè)兩個(gè)對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照即質(zhì)粒DNA和陰性對(duì)照即非轉(zhuǎn)基因材料的DNA。PCR擴(kuò)增結(jié)果只能初步確定轉(zhuǎn)基因材料的真實(shí)性，并不能完全確信。容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，通常需要進(jìn)一步用Southern雜交才能證實(shí)。PCR檢測(cè)PCR檢測(cè)外源基因的原理是根據(jù)被轉(zhuǎn)移的外源基因（目轉(zhuǎn)基因棉花選擇標(biāo)記基因NPTII編碼區(qū)段的PCR擴(kuò)增結(jié)果（M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，C為非轉(zhuǎn)基因植株，P為質(zhì)粒對(duì)照，1-20為轉(zhuǎn)基因植株）轉(zhuǎn)基因棉花選擇標(biāo)記基因NPTII編碼區(qū)段的PCR擴(kuò)增結(jié)果（MSouthern雜交(Southernblotting)◆將DNA用限制性酶酶切→酶切DNA電泳→變性→轉(zhuǎn)移到膜上→經(jīng)過(guò)標(biāo)記的DNA探針與膜上的DNA片段雜交→洗去膜上非特異性結(jié)合的探針→檢測(cè)雜交信號(hào)?！羧绻D(zhuǎn)移的膜上具有與雜交探針相同或部分同源的序列，就會(huì)檢測(cè)到雜交帶信號(hào)?！鬝OUTHERN.EXESouthern雜交(Southernblotting)◆第11章基因工程課件M123456789kb23.1-9.4-6.6-4.4-2.3-2.0-轉(zhuǎn)基因棉花的Southern雜交檢測(cè)（M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為陽(yáng)性對(duì)照，2為陰性對(duì)照，3-8為轉(zhuǎn)基因植株）M123456789kbNorthern雜交是一種RNA-DNA雜交。將提取的植物總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分離，則不同的RNA分子將按分子量大小依次排布在凝膠上；將它們?cè)晦D(zhuǎn)移到固相膜上；在適宜的離子強(qiáng)度及溫度條件下，用探針與膜雜交；然后通過(guò)探針的標(biāo)記性質(zhì)檢出雜交體。Northern雜交Northern雜交是一種RNA-DNA雜交。Norther從轉(zhuǎn)基因植物中提取總蛋白質(zhì)，經(jīng)純化處理后，進(jìn)行SDS(十二烷基磺酸鈉)聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質(zhì)按分子量大小分離，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，按特定的程序與抗體雜交，對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)便可得知被檢植物組織內(nèi)目的蛋白表達(dá)與否及其表達(dá)量。Western雜交從轉(zhuǎn)基因植物中提取總蛋白質(zhì)，經(jīng)純化處理后，進(jìn)行SDS(十二烷鑒定轉(zhuǎn)移的目的基因、選擇標(biāo)記基因是否表達(dá)。觀察是否發(fā)生外源基因以外的變異。轉(zhuǎn)基因生物還可能因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)或T-DNA的插入而造成其它性狀的突變。最好選出其它性狀均未改變而僅產(chǎn)生目的基因性狀的轉(zhuǎn)基因材料。但是，不應(yīng)忽視轉(zhuǎn)基因過(guò)程中產(chǎn)生的其它變異的應(yīng)用價(jià)值，如轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的研究中就可篩選到既抗蟲纖維品質(zhì)的某方面也改善的品系。二生物學(xué)性狀鑒定鑒定轉(zhuǎn)移的目的基因、選擇標(biāo)記基因是否表達(dá)。二生物學(xué)性狀鑒轉(zhuǎn)基因棉花飼喂棉鈴蟲時(shí)被食用情況（左圖為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，右圖為非轉(zhuǎn)基因棉）轉(zhuǎn)基因棉花飼喂棉鈴蟲時(shí)被食用情況（左圖為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，右圖為第5節(jié)基因工程的應(yīng)用第5節(jié)基因工程的應(yīng)用一些重要的發(fā)現(xiàn)是借助基因工程技術(shù)完成的，如基因結(jié)構(gòu)的重疊現(xiàn)象和不連續(xù)性，mRNA的剪接現(xiàn)象和轉(zhuǎn)座因子等。功能基因研究是生物科學(xué)研究的一大熱點(diǎn)領(lǐng)域，分離和克隆基因并驗(yàn)證其功能，對(duì)于闡明基因的調(diào)控、作用方式等十分重要?；蚬こ淘诩?xì)胞分化、胚胎發(fā)育、細(xì)胞識(shí)別、癌變產(chǎn)生、免疫機(jī)制、生物進(jìn)化、形態(tài)建成、產(chǎn)量和品質(zhì)的形成規(guī)律、生物與環(huán)境的信號(hào)識(shí)別等方面的研究中具有重要用途。1.基因工程是生物科學(xué)基礎(chǔ)研究的重要手段一些重要的發(fā)現(xiàn)是借助基因工程技術(shù)完成的，如基因結(jié)構(gòu)的重疊現(xiàn)象利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物已取得很大進(jìn)展并在生產(chǎn)上應(yīng)用。1996年轉(zhuǎn)基因作物在生產(chǎn)上使用。2003年轉(zhuǎn)基因抗蟲和抗除草劑的作物分別達(dá)到1000萬(wàn)和5000萬(wàn)公頃左右。美國(guó)的轉(zhuǎn)基因棉花達(dá)到總播種面積的80%左右，全球的轉(zhuǎn)基因棉花已達(dá)到50%的面積。目前的轉(zhuǎn)基因作物主要是轉(zhuǎn)基因的大豆、玉米、油菜和棉花。種植區(qū)域主要分布在美洲。作物的抗逆、抗病、品質(zhì)改良、風(fēng)味的改變都將成為作物基因工程研究的重要方向。2.利用基因工程改良植物利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物已取得很大進(jìn)展并在生產(chǎn)上應(yīng)用。2.利第11章基因工程課件轉(zhuǎn)基因動(dòng)物比轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展要緩慢些，這不僅涉及到技術(shù)問(wèn)題，也涉及到倫理和宗教問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通常是將目的基因構(gòu)建到載體上，然后用微量注射法將重組DNA導(dǎo)入受體合子細(xì)胞核中，借助母體環(huán)境實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物遇到的技術(shù)難題是動(dòng)物體細(xì)胞再生并不像植物那么容易，而且動(dòng)物的繁殖數(shù)量十分有限?？寺?dòng)物的成功（1997年克隆羊多利）和轉(zhuǎn)基因魚在生產(chǎn)上的應(yīng)用是動(dòng)物基因工程的典范示例。3.利用基因工程改良動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物比轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展要緩慢些，這不僅涉及到技術(shù)問(wèn)題，◆將人的抗胰蛋白酶α-1基因克隆在羊奶產(chǎn)生相關(guān)基因啟動(dòng)子的下游，這種啟動(dòng)子僅在乳腺細(xì)胞中表達(dá)。將這個(gè)嵌合基因注射到已授精的羊的合子中，再放植到母羊體內(nèi)，產(chǎn)下的轉(zhuǎn)基因羊發(fā)育正常。交配后產(chǎn)生的羊奶中含有大量有功能的人類抗胰蛋白酶(每升35克)，這一結(jié)果說(shuō)明可利用家禽作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)人類大量需要的重要蛋白質(zhì)。3.利用基因工程改良動(dòng)物◆將人的抗胰蛋白酶α-1基因克隆在羊奶產(chǎn)生相關(guān)基因啟動(dòng)子的下第11章基因工程課件第11章基因工程課件生產(chǎn)所需要的蛋白質(zhì)?；ɑ芄I(yè)。改變花卉的花色或外觀。生物采礦、藥物生產(chǎn)、工業(yè)原料生產(chǎn)方面。真正將基因工程工業(yè)在實(shí)際中應(yīng)用，需要解決很多實(shí)際問(wèn)題，如篩選宿主系統(tǒng)。細(xì)菌、真菌、植物、哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)都可以成為合適的宿主系統(tǒng)。另外一個(gè)重要的問(wèn)題就是克隆到所需要的基因和構(gòu)建高效的表達(dá)載體。最后是產(chǎn)品的收集、純化技術(shù)。4.基因工程工業(yè)生產(chǎn)所需要的蛋白質(zhì)。4.基因工程工業(yè)第11章基因工程課件◆在動(dòng)物體內(nèi)胰島素是胰腺細(xì)胞先形成一種前體胰島素，再加工成兩條不同的成熟胰島素原分子，A鏈含21個(gè)氨基酸殘基，B鏈含30個(gè)氨基酸殘基，經(jīng)兩對(duì)二硫鍵連接形成成熟的胰島素。

◆在動(dòng)物體內(nèi)胰島素是胰腺細(xì)胞先形成一種前體胰島素，再加工成兩基因治療（genetherapy）是利用功能基因或正常基因，通過(guò)生物技術(shù)手段，置換缺陷基因，從而達(dá)到矯正遺傳疾病的目的。遺傳矯正途徑：（1）是替代治療，即用功能正常的基因替代缺陷基因；（2）靶標(biāo)基因修復(fù)，即用分子工具修正基因組中的突變基因。用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)疫苗：用酵母生產(chǎn)的人乙型肝炎病毒疫苗是第一個(gè)真核細(xì)胞基因工程的商業(yè)化產(chǎn)品。我國(guó)采用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)和重組痘苗表達(dá)系統(tǒng)也進(jìn)行了乙肝疫苗的研制，其免疫效果均可超過(guò)血源疫苗的效果。5.疾病診斷與基因治療基因治療（genetherapy）是利用功能基因或正?；蚶弥参锷a(chǎn)重組蛋白。包括抗體、疫苗、調(diào)節(jié)蛋白和酶等。1988年第一個(gè)利用煙草生產(chǎn)重組抗體獲得成功。利用植物生產(chǎn)藥物具有如下優(yōu)點(diǎn)：栽培費(fèi)用低、產(chǎn)量高；從基因到蛋白所需用的時(shí)間相對(duì)較短；需要資金少；治療風(fēng)險(xiǎn)小。5.疾病診斷與基因治療。利用植物生產(chǎn)重組蛋白。包括抗體、疫苗、調(diào)節(jié)蛋白和酶等。198遺傳疾病診斷RFLP法遺傳疾病診斷RFLP基因治療

◆最常用的基因轉(zhuǎn)移治療方法是利用減毒的病毒DNA(retrovirusDNA)作載體，構(gòu)建重組DNA分子，用病毒包裝物包裝后形成的重組減毒病毒感染患者的細(xì)胞，將正?；蛘系饺旧w上?；蛑委煛糇畛Ｓ玫幕蜣D(zhuǎn)移治療方法是利用減毒的病毒DNA(生物治療：利用微生物降解環(huán)境中的毒素和危險(xiǎn)化合物。廢物處理：也是利用微生物降解廢物，使之轉(zhuǎn)化為二氧化碳和甲烷，后者可以用作生物能源燃料。制作診斷工具：研制人類、動(dòng)植物主要流行性疾病的早期探測(cè)試劑盒，做到疾病的早期預(yù)防和控制。植物診斷：利用植物消除環(huán)境中的污染或使其轉(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)。比如，利用某些植物吸收土壤中的重金屬，可以緩解土壤中的重金屬污染。6.生物工程與環(huán)境保護(hù)。生物治療：利用微生物降解環(huán)境中的毒素和危險(xiǎn)化合物。6.生物人類對(duì)生物技術(shù)應(yīng)用的安全性關(guān)注的方面包括是否會(huì)破壞環(huán)境，是否對(duì)人類健康有害，食品安全，以及宗教和倫理問(wèn)題。生物工程體的安全性評(píng)價(jià)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括生物工程體對(duì)生物群落的影響，對(duì)土壤動(dòng)物和生物遺傳多樣性的影響，轉(zhuǎn)基因通過(guò)花粉逃逸的問(wèn)題，載體的安全性，食品的安全性等。多個(gè)國(guó)家都對(duì)基因的安全性制定了相應(yīng)的法規(guī)和判斷標(biāo)準(zhǔn)。只有通過(guò)安全性評(píng)價(jià)的基因工程產(chǎn)品才允許投入生產(chǎn)。7.安全性評(píng)價(jià)人類對(duì)生物技術(shù)應(yīng)用的安全性關(guān)注的方面包括是否會(huì)破壞環(huán)境，是否本章重點(diǎn)基因工程的一般步驟限制酶和載體基因分離（PCR）轉(zhuǎn)基因（southern）作業(yè)本章重點(diǎn)第11章基因工程第1節(jié)基因工程概述第2節(jié)基因的分離第3節(jié)外源基因?qū)胧荏w第4節(jié)轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)與鑒定第5節(jié)基因工程的應(yīng)用第11章基因工程第1節(jié)基因工程概述遺傳工程（geneticengineering），也稱生物工程，利用工程技術(shù)的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或產(chǎn)品，從而改良生物體的一種遺傳學(xué)手段。核心是利用重組DNA技術(shù)，在分子水平上操作修飾改變生物體。細(xì)胞工程（cellengineering）基因工程（geneengineering）酶工程（enzymeengineering）發(fā)酵工程（fermentationengineering）第1節(jié)基因工程概述遺傳工程（geneticengineering），也稱生物基因工程（geneengineering）利用人工的方法把生物的遺傳物質(zhì)在體外進(jìn)行切割、拼接和重組，獲得重組DNA分子，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞或個(gè)體，使受體的遺傳特性得到修飾或改變的過(guò)程。基因工程操作的對(duì)象是DNA分子，首先把目標(biāo)基因克隆出來(lái)插入到一定的載體中，然后將重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞，并使其保持和遺傳下去。

第1節(jié)基因工程概述基因工程（geneengineering）第1節(jié)基因工目的基因的獲目的基因與載體的連接成重組DNA分子重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞篩選重組克隆基因表達(dá)與產(chǎn)物分離基因工程的內(nèi)容

第1節(jié)基因工程概述目的基因的獲基因工程的內(nèi)容第1節(jié)基因工程概述第11章基因工程課件第11章基因工程課件第2節(jié)

基因的分離一工具酶載體三基因分離方法

第2節(jié)基因的分離一工具酶第2節(jié)

基因的分離一、工具酶（一）限制性內(nèi)切核酸酶

(restrictionenzymes)限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）是細(xì)菌中降解外來(lái)DNA分子的一類酶。細(xì)菌中限制—修飾現(xiàn)象：作用于同一DNA的兩種酶——分解DNA的限制酶和改變DNA堿基結(jié)構(gòu)使其免遭限制酶分解的修飾酶。通過(guò)某些堿基進(jìn)行甲基化修飾，使得限制酶不能進(jìn)行切割。而外來(lái)的DNA在沒有被甲基化，限制酶將其降解。第2節(jié)基因的分離一、工具酶（一）限制性內(nèi)切核酸酶★共同的特性：只切割雙鏈DNA分子，不切單鏈DNA；每種酶有其特定的核苷酸序列識(shí)別特異性；需要鎂離子激活等。（一）限制性內(nèi)切核酸酶★共同的特性：★限制酶可分為3類。Ⅰ型酶：只有EcoB和EcoK兩種，具有催化限制性切割和修飾核苷酸2種功能。Ⅱ型酶：在遺傳工程中應(yīng)用最廣泛。①有特異識(shí)別和切割的序列部位，被切割的DNA分子形成單鏈的斷裂；②斷裂的部位通常不是直接相對(duì)的，結(jié)果所形成的DNA片段常具有堿基互補(bǔ)的單鏈尾巴（粘性末端），使其能夠重新連接；③內(nèi)切酶的切割和修飾功能由兩個(gè)不同的酶催化所完成。Ⅲ型酶具有特異的識(shí)別位點(diǎn)，這種識(shí)別位點(diǎn)是非對(duì)稱的。（一）限制性內(nèi)切核酸酶★限制酶可分為3類。（一）限制性內(nèi)切核酸酶（一）限制性內(nèi)切核酸酶（一）限制性內(nèi)切核酸酶通過(guò)用相同的限制性內(nèi)切核酸酶切割形成一個(gè)重組DNA分子（一）限制性內(nèi)切核酸酶通過(guò)用相同的限制性內(nèi)切核酸酶切割形成一個(gè)重組DNA分子（一第11章基因工程課件（二）DNA連接酶（ligase）在分子克隆中使用的DNA連接酶有兩種：大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶。催化DNA中相鄰的3’–OH和5’–磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段DNA連接起來(lái)。（二）DNA連接酶（ligase）在分子克隆中使用的DNA連（三）反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）★反轉(zhuǎn)錄酶是一類以RNA為模板來(lái)指導(dǎo)DNA合成的DNA聚合酶，所以又稱為依賴于RNA的DNA聚合酶。★反轉(zhuǎn)錄酶在遺傳工程中的主要用途是以mRNA為模板合成cDNA。（三）反轉(zhuǎn)錄酶★反轉(zhuǎn)錄酶是一類以RNA為模板來(lái)指導(dǎo)DNA合成（四）PCR◆聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是體外快速擴(kuò)增DNA的方法?！鬚CR反應(yīng)包括三個(gè)步驟：

●變性：在94-95℃使模板DNA的雙鏈變性成單鏈。

●復(fù)性：兩個(gè)引物分別與單鏈DNA互補(bǔ)復(fù)性，復(fù)性的溫度在50-60℃

●延伸：在引物的引導(dǎo)及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互補(bǔ)鏈

◆

這三個(gè)步驟稱為一個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)常有25-35個(gè)循環(huán)。◆PCR.EXE（四）PCR◆聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymeras（四）PCR

PCR產(chǎn)物可以通過(guò)電泳檢測(cè)瓊脂糖電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（四）PCRPCR產(chǎn)物可以通過(guò)電泳檢測(cè)瓊脂糖電泳聚丙烯酰二載體

載體（vector）是將外源基因送入受體細(xì)胞的工具。作為載體DNA分子，需要具備：在宿主細(xì)胞中能獨(dú)立復(fù)制，有獨(dú)立的復(fù)制起始位點(diǎn)；載體DNA分子中有一段不影響其復(fù)制的非必需區(qū)域，即有限制酶切位點(diǎn)，允許外源基因插入且插入后隨載體DNA分子一同進(jìn)行復(fù)制或擴(kuò)增；有選擇標(biāo)記，便于選擇含重組DNA分子的寄主細(xì)胞；分子量小，多拷貝，易于操作。除了上述特點(diǎn)外，一般還要求載體載荷外源DNA的幅度要寬，具有安全性等。二載體載體（vector）是將外源基因送入受體細(xì)胞的工（一）質(zhì)粒

◆質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌染色體外存在的一種能夠自我復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，大小1kb～200kb。質(zhì)粒常常帶有一些特殊的基因，如致死基因，抗抗生素的基因等等。一般質(zhì)粒都含有一個(gè)復(fù)制起始區(qū)，可獨(dú)立復(fù)制。質(zhì)粒DNA復(fù)制與宿主之間的關(guān)系，可分為“嚴(yán)謹(jǐn)型”和“松弛型”?！皣?yán)謹(jǐn)型”質(zhì)粒在每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)通常1~3個(gè)，而“松弛型”通常在10個(gè)以上，可高達(dá)200個(gè)拷貝?！粢话阗|(zhì)粒通過(guò)改造后才能用于遺傳工程。

（一）質(zhì)?！糍|(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌染色體外存在的（一）質(zhì)粒

pUC18可以克隆比較大的DNA片段，在細(xì)胞中產(chǎn)生500個(gè)拷貝左右。有一個(gè)多克隆位點(diǎn)，位于大腸桿菌的lacZ基因之內(nèi)，有利于篩選和分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞。（一）質(zhì)粒pUC18可以克隆比較大的DNA片段，在細(xì)胞篩選的原理是：細(xì)菌細(xì)胞含有野生質(zhì)粒，在含有X-gal（5-溴-氯吲哚-半乳糖苷酶）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生蘭色菌斑；插入克隆片段后，lacZ基因失去功能，不能代謝X-gal，從而產(chǎn)生白色菌斑。（一）質(zhì)粒

篩選的原理是：細(xì)菌細(xì)胞含有野生質(zhì)粒，在含有X-gal（5-溴（二）病毒載體◆

λ噬菌體基因組全長(zhǎng)48kb。具有粘性末端(cos位點(diǎn))。中間約1/3的序列為中間基因簇(centralgenecluster)，兩端為DNA左、右臂。λ基因組的中間基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影響噬菌體感染細(xì)菌及形成噬菌斑的能力。λ噬菌體（二）病毒載體◆λ噬菌體基因組全長(zhǎng)48kb。具有粘性末端（二）病毒載體◆λ噬菌體載體可接受15kb-23kb的外源DNA片段，它既可作為克隆載體，也可作為表達(dá)載體，廣泛用于各類基因庫(kù)的構(gòu)建。（二）病毒載體◆λ噬菌體載體可接受15kb-23kb(三)克隆大片段載體粘粒載體、細(xì)菌人工染色體和酵母人工染色體載體等。粘粒載體（cosmid）是一類含有cos位點(diǎn)的質(zhì)粒載體.兼有λ噬菌體的高效感染能力和質(zhì)粒的易于克隆和選擇的優(yōu)點(diǎn)，既能像質(zhì)粒一樣在寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，又能象λDNA一樣被包裝到噬菌體顆粒中去。(三)克隆大片段載體粘粒載體、細(xì)菌人工染色體和酵母人工與噬菌體載體和質(zhì)粒載體相比具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：具有cos位點(diǎn)，能高效地轉(zhuǎn)化大腸桿菌，能在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)自身環(huán)化，并能在大腸桿菌中復(fù)制；有像質(zhì)粒一樣的選擇標(biāo)記；cosmid載體比較小，但能插入較大的外源片段，可克隆外源片段的長(zhǎng)度在15~45kb之間。由于cosmid載體的大片段克隆能力，多用于基因組文庫(kù)的構(gòu)建，而λ噬菌體載體多用于cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。已有多種粘粒載體可用于基因克隆，pJB8是最常用的粘粒載體之一粘粒載體與噬菌體載體和質(zhì)粒載體相比具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：粘粒載體細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome，BAC）

◆

BAC載體是基于細(xì)菌的性因子(F因子)質(zhì)粒的一些特點(diǎn)構(gòu)建的。F因子在細(xì)菌接合時(shí)轉(zhuǎn)移1Mb的細(xì)菌染色體片段。將F因子經(jīng)基因工程改良構(gòu)成的BAC載體，可用于克隆100kb以上的DNA片段?！魩в型庠雌蔚腂AC載體在細(xì)菌細(xì)胞中通常僅單個(gè)拷貝，這一特點(diǎn)有利于保持DNA大分子，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制而不發(fā)生重組。BAC載體本身分子量小，具有氯霉素抗性選擇基因及多克隆位點(diǎn)。細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialc第11章基因工程課件酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）◆酵母人工染色體具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。◆

YAC可以接受1-2Mb的外源DNA片段，這一特點(diǎn)使YAC成為人類基因組計(jì)劃及圖位克隆分離基因的重要工具，并促進(jìn)了發(fā)展人類人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。酵母人工染色體（yeastartificialchro第11章基因工程課件三基因分離方法基于基因庫(kù)的分離基因方法T-DNA標(biāo)簽克隆基因基于PCR的基因克隆人工合成基因三基因分離方法基于基因庫(kù)的分離基因方法1構(gòu)建基因文庫(kù)基因文庫(kù)(library)是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因文庫(kù)中分離基因，首先要構(gòu)建基因文庫(kù)。只有利用合乎要求的基因文庫(kù)才有可能篩選出所需要的基因，很多分子遺傳學(xué)工作才能繼續(xù)深入下去。（一）基于基因文庫(kù)的分離基因方法1構(gòu)建基因文庫(kù)（一）基于基因文庫(kù)的分離基因方法核基因文庫(kù)◆核基因文庫(kù)(genomiclibrary或genomicbank)是將某一生物的全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的?！敉ǔ５姆椒ㄊ牵M量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分離選擇具有一定長(zhǎng)度(大于15kb)的DNA片段，與適宜的載體連接構(gòu)成重組DNA分子,選擇相應(yīng)的宿主細(xì)胞用于克隆。載體可以是質(zhì)粒，噬菌體，BAC或YAC等（一）基于基因庫(kù)的分離基因方法核基因文庫(kù)（一）基于基因庫(kù)的分離基因方法◆理想的核基因文庫(kù)應(yīng)當(dāng)能包括全部的基因組序列。如果每一個(gè)克隆包括的DNA片段大，則總克隆數(shù)目少，常選擇能接受較大片段的載體?！魴z測(cè)是否包括一個(gè)完整的基因組序列的公式：

◆例:人類基因組3.0x106kb,以λEMBL作載體，插入片段的平均長(zhǎng)度為17kb，p為99%時(shí),基因庫(kù)應(yīng)有8.1x105個(gè)

重組噬菌體。1.核基因庫(kù)◆理想的核基因文庫(kù)應(yīng)當(dāng)能包括全部的基因組序列。如果每一個(gè)克隆染色體基因庫(kù)

◆將基因組的一部分（如一條染色體）用來(lái)構(gòu)建基因庫(kù)，對(duì)于選擇特異基因及分析染色體結(jié)構(gòu)和組織十分有價(jià)值。果蠅X染色體上的一個(gè)片段，具有50多個(gè)多線染色體帶，利用微切割技術(shù)切割，抽提DNA，構(gòu)建染色體片段基因庫(kù)。在人類基因組項(xiàng)目研究中，利用流動(dòng)細(xì)胞分揀技術(shù)將人類染色體分開，構(gòu)建單個(gè)染色體基因庫(kù)，大大加速了人類基因組作圖和分析。在酵母菌中，利用一種改良的脈沖電泳方法，將酵母菌的16條染色體據(jù)分開，用于構(gòu)建染色體庫(kù)。染色體基因庫(kù)◆將基因組的一部分（如一條染色體）用來(lái)構(gòu)建基因cDNA庫(kù)◆

以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA(cDNA)，構(gòu)建的基因庫(kù)cDNA庫(kù)◆以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA◆

cDNA庫(kù)僅具有用于分離mRNA的細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)的基因的mRNA序列，僅包括基因組的部分基因序列?！魳?gòu)建什么樣的基因庫(kù)取決于研究目的。cDNA庫(kù)對(duì)于研究基因的表達(dá)模式、分離某一特定基因是十分有用的。如分離在某一細(xì)胞或組織高效表達(dá)的某種基因?！敉ǔＪ菍DNA庫(kù)與核基因庫(kù)配合使用，以便既能得到基因的編碼序列，又可得到基因的調(diào)控序列。cDNA庫(kù)

◆cDNA庫(kù)僅具有用于分離mRNA的細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)的基因2篩選基因庫(kù)

◆從基因庫(kù)中篩選、分離基因，可據(jù)對(duì)待選基因相關(guān)信息的了解程度，確定篩選方法和條件。◆常用方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探針(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫(kù)。2篩選基因庫(kù)◆從基因庫(kù)中篩選、分離基因，可據(jù)對(duì)待選基因相◆將重組噬菌體(來(lái)自基因庫(kù))感染的宿主細(xì)菌細(xì)胞與少量培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增后形成噬菌斑?！魧⑴囵B(yǎng)皿中的噬菌斑轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，變性，用標(biāo)記的探針與膜上的噬菌體DNA雜交，雜交膜用X-光片放射自顯影，檢測(cè)雜交信號(hào)?！襞c探針雜交的噬菌斑即為陽(yáng)性克隆。根據(jù)雜交信號(hào)的位置，找出培養(yǎng)皿中所對(duì)應(yīng)的噬菌斑，培養(yǎng)，制備DNA。菌斑雜交法篩選λ噬菌體核基因庫(kù)◆將重組噬菌體(來(lái)自基因庫(kù))感染的宿主細(xì)菌細(xì)胞與少量培養(yǎng)基混菌落雜交技術(shù)尋找目標(biāo)DNA克隆菌落雜交技術(shù)尋找目標(biāo)DNA克隆從文庫(kù)中篩選獲得目標(biāo)克隆后，只有進(jìn)行測(cè)序才能進(jìn)行生物信息分析和功能預(yù)測(cè)。（三）序列測(cè)定和分析限制性酶圖譜

從文庫(kù)中篩選獲得目標(biāo)克隆后，只有進(jìn)行測(cè)序才能進(jìn)行生物信息分析◆一個(gè)15kbDNA片段的限制性酶圖譜構(gòu)建★實(shí)驗(yàn)過(guò)程：首先將陽(yáng)性克隆DNA分裝在3個(gè)管中，分別用不同的酶及酶的組合酶切DNA。酶切的產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳，染色，在紫外燈下可見到DNA帶。各條帶的分子量大小可根據(jù)分子量標(biāo)記估測(cè)。限制性酶圖譜

◆一個(gè)15kbDNA片段的限制性酶圖譜構(gòu)建限制性酶圖譜★結(jié)果分析●從凝膠電泳結(jié)果可見，模式Ⅱ就是這個(gè)15kbDNA片段用上述兩種酶酶切后的限制性酶圖譜?！駥⒉煌珼NA用限制性酶消化，產(chǎn)生的多態(tài)性，即限制性酶片段長(zhǎng)度的多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，用來(lái)分析DNA水平的變異程度，進(jìn)行基因組圖譜分析。限制性酶圖譜

★結(jié)果分析限制性酶圖譜（二）T-DNA標(biāo)簽克隆基因基本原理：利用T-DNA插入突變創(chuàng)造突變體，獲得各突變體的純合材料；然后分析突變性狀與T-DNA的共分離關(guān)系，存在共分離的材料用適當(dāng)?shù)腜CR克隆技術(shù)獲得T-DNA的側(cè)翼基因組序列；用其作探針篩選基因文庫(kù)，獲取目標(biāo)基因或克隆，再進(jìn)行下一步的分析。（二）T-DNA標(biāo)簽克隆基因基本原理：T-DNA載體構(gòu)建↓

轉(zhuǎn)化植物（T1，T-DNA雜合子)收獲T2種子↓

篩選T2，獲突變子，應(yīng)為3:1分離↓

確定T-DNA與突變型共分離的個(gè)體↓

產(chǎn)生純合后代↓

克隆T-DNA兩側(cè)的植物DNA↓

利用側(cè)翼DNA序列作探針從該植物的cDNA文庫(kù)中釣取基因↓

基因功能的驗(yàn)證T-DNA載體構(gòu)建（三）基于PCR的基因克隆基于PCR的DNA克隆與基于載體的克隆技術(shù)相比具有一定優(yōu)越性。PCR反應(yīng)速度很快，可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，而載體克隆需要幾周時(shí)間。PCR反應(yīng)非常靈敏，可以用來(lái)擴(kuò)增痕量樣品的DNA。對(duì)于部分降解、甚至污染，用載體克隆無(wú)法進(jìn)行的DNA樣品，PCR擴(kuò)增仍可獲得目的基因克隆同源克隆（三）基于PCR的基因克隆基于PCR的DNA克隆與基于載體的（四）人工合成基因

◆根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來(lái)，可以很快地人工合成基因?！衾?，首先化學(xué)合成多個(gè)含有80-100個(gè)核苷酸的寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸之間具有19-24個(gè)核苷酸的重疊序列，再將各個(gè)寡核苷酸等量混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作為引物合成新鏈，使單鏈部分補(bǔ)齊成為雙鏈，再用兩個(gè)PCR引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出DNA片段。若將兩個(gè)DNA片段放在一起，經(jīng)SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)擴(kuò)增出完整的基因片段。（四）人工合成基因◆根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合第11章基因工程課件第3節(jié)外源基因?qū)胧荏w

一、重組DNA導(dǎo)入原核生物（細(xì)菌）二、植物表達(dá)載體三、外源基因?qū)胫参锏?節(jié)外源基因?qū)胧荏w一、重組DNA導(dǎo)入原核生物（細(xì)一、重組DNA導(dǎo)入原核生物（細(xì)菌）CaCl2處理轉(zhuǎn)化。CaCl2處理轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚不清楚，可能是CaCl2處理破壞了細(xì)菌的細(xì)胞壁，使游離的DNA分子被攝入受體細(xì)胞。這種方法的轉(zhuǎn)化頻率大概是千分之一。電激轉(zhuǎn)化（electroporation）。是目前常用的一種轉(zhuǎn)化方式。在電轉(zhuǎn)化儀施加的強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，使受體細(xì)胞細(xì)胞壁具有可逆的電穿孔，DNA分子進(jìn)入細(xì)胞。結(jié)合（conjugation）。結(jié)合是原核生物細(xì)胞與細(xì)胞接觸而進(jìn)行遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的一種自然過(guò)程。一、重組DNA導(dǎo)入原核生物（細(xì)菌）CaCl2處理轉(zhuǎn)化。CaC二、植物表達(dá)載體◆

Ti質(zhì)粒是一種細(xì)菌質(zhì)粒，它自然存在于土壤農(nóng)桿菌細(xì)胞中。土壤農(nóng)桿菌可感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，使之產(chǎn)生冠癭瘤(growngalltumors)?！鬞i質(zhì)粒。Ti質(zhì)粒的一部分DNA叫做轉(zhuǎn)移DNA（T-DNA），當(dāng)T-DNA整合到宿主植物細(xì)胞的染色體后，就誘導(dǎo)出根瘤，并使根瘤細(xì)胞合成冠癭堿(opine),作為土壤農(nóng)桿菌的碳源和氮源。二、植物表達(dá)載體◆Ti質(zhì)粒是一種細(xì)菌質(zhì)粒，它自然存在于土壤（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）

T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上導(dǎo)入植物細(xì)胞的一段DNA。

T-DNA兩端各有一段25bp的重復(fù)序列(LB,RB)。T-DNA攜帶的致瘤基因是一些與激素合成有關(guān)的基因，由于激素合成基因使細(xì)胞處于不停的分裂狀態(tài)，形成冠癭瘤，不能進(jìn)行細(xì)胞分化。Ti質(zhì)粒改造后才能應(yīng)用于植物的基因工程。保留T-DNA兩端的末端序列，然后用外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不具有成瘤能力。（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregi（2）Vir區(qū)（virolenceregion）Vir區(qū)段上的基因與T-DNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的遺傳過(guò)程有關(guān)，區(qū)段上的基因能夠使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。Vir區(qū)段總長(zhǎng)度大約35kb，由7個(gè)互補(bǔ)群組成，分別命名為VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH。（3）Con區(qū)(regionsencodingconjugations)

該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。

（4）Ori區(qū)(originofreplication)

該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。（2）Vir區(qū)（virolenceregion）Ti質(zhì)粒分子受到信號(hào)分子的激活作用之后，virD基因編碼的一種核酸內(nèi)切酶，先在T-DNA的RB序列中的第3和第4堿基之間切開一個(gè)單鏈缺口，隨后在T-DNA同一條鏈的LB序列中切出第二個(gè)單鏈缺口。T-DNA便以單鏈形式釋放出來(lái)，并在RB序列的引導(dǎo)下定向地轉(zhuǎn)移到寄主植物細(xì)胞。在有關(guān)的植物細(xì)胞酶體系的催化作用下，合成互補(bǔ)鏈形成雙鏈形式的T-DNA分子。在一系列酶的參與下整合進(jìn)植物基因組。這種整合是一種非正常重組。T-DNA轉(zhuǎn)移的機(jī)制Ti質(zhì)粒分子受到信號(hào)分子的激活作用之后，virD基因編碼的一（1）雙元載體系統(tǒng)（binaryvector）具有兩個(gè)質(zhì)?！┧筚|(zhì)粒和Ti質(zhì)粒。（2）共整合載體（integratedvector）共整合載體系統(tǒng)包括在T-DNA上的激素合成區(qū)經(jīng)過(guò)突變后的Ti質(zhì)粒和中間載體兩部分。Ti質(zhì)粒的衍生載體（1）雙元載體系統(tǒng)（binaryvector）Ti質(zhì)粒的衍發(fā)根農(nóng)桿菌存在另一種質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒也可完成外源基因向植物的轉(zhuǎn)移工作。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后植物細(xì)胞產(chǎn)生許多不定根，這種不定根生長(zhǎng)迅速，不斷分枝成毛狀，故稱之為毛狀根，也稱為發(fā)狀根，分別簡(jiǎn)稱為毛根或發(fā)根，Ri質(zhì)粒為根誘導(dǎo)質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)很相似，可以分為T區(qū)、vir區(qū)、ori區(qū)和其它區(qū)域等幾個(gè)部分。Ri質(zhì)粒發(fā)根農(nóng)桿菌存在另一種質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒。Ri質(zhì)粒T區(qū)與Ti質(zhì)粒的T-DNA十分相似：①T區(qū)的左右邊界序列。左右邊界上含有25bp的重復(fù)序列。②TL-DNA區(qū)。該區(qū)中含有與毛狀根形成有關(guān)的rolA、B、C、D基因群。③TR-DNA區(qū)。該區(qū)中含有與農(nóng)桿堿合成有關(guān)的基因（ags）和生長(zhǎng)素合成有關(guān)的基因（tms1、

tms2）。ags基因在轉(zhuǎn)化的初期起著重要的作用，是不定根產(chǎn)生的關(guān)鍵Ri質(zhì)粒T區(qū)與Ti質(zhì)粒的T-DNA十分相似：Ri質(zhì)粒高等植物基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法為兩類：非生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是以植物自身的生殖系統(tǒng)種質(zhì)細(xì)胞為受體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化，如花粉浸泡外源DNA、DNA注射受粉后的子房等；直接轉(zhuǎn)化是采用物理或化學(xué)方法直接將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，如基因槍法等。生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。在生物載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因是常用的方法。三、外源基因?qū)胫参锔叩戎参锘蜻z傳轉(zhuǎn)化的方法為兩類：三、外源基因?qū)胫参镄枰邆淙缦聴l件：高效的植株再生體系。選擇容易從體細(xì)胞再生植株的受體基因型是獲得轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。受體植物細(xì)胞對(duì)農(nóng)桿菌要有很高的親和力。一般認(rèn)為受體細(xì)胞應(yīng)處于高度的分裂狀態(tài)，T-DNA才能插入植物基因組；具有有效的選擇系統(tǒng)。必須有一個(gè)理想的選擇方法將轉(zhuǎn)化細(xì)胞從非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選擇出來(lái)；穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因表達(dá)。外源基因轉(zhuǎn)入植物后應(yīng)能傳代并穩(wěn)定表達(dá)。（一）農(nóng)桿菌法需要具備如下條件：（一）農(nóng)桿菌法一般技術(shù)程序農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞、細(xì)菌與植物細(xì)胞共培養(yǎng)、在篩選培養(yǎng)基上篩選、獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化并再生植株。葉圓盤轉(zhuǎn)化法。帶有傷口的植物葉片的圓盤。使用的外植體可以是葉圓盤、下胚軸、胚性愈傷組織等。（一）農(nóng)桿菌法一般技術(shù)程序（一）農(nóng)桿菌法F1.共培養(yǎng)2.在選擇培養(yǎng)基上篩選3.篩選獲得的抗性愈傷5.胚萌發(fā)成苗6.轉(zhuǎn)基因植株移栽大田4.抗性愈傷分化成胚狀體F1.共培養(yǎng)2.在選擇培養(yǎng)基上篩選3.篩選獲得的抗性愈選擇是為了將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。在構(gòu)建載體時(shí)，往往在目的基因上連上一個(gè)選擇標(biāo)記基因。通常使用的是抗生素抗性基因，如NPTII基因——新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，能分解卡那霉素等抗生素。其它選擇標(biāo)記基因，如抗除草劑基因，報(bào)告基因（如：GUS基因）等。選擇系統(tǒng)（一）農(nóng)桿菌法選擇是為了將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞區(qū)分開，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有生長(zhǎng)優(yōu)基因槍法（genegun）是依賴高速的金屬微粒將外源基因?qū)牖罴?xì)胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。（二）基因槍介法基因槍法（genegun）是依賴高速的金屬微粒將外源基因?qū)?yōu)點(diǎn)：（1）無(wú)宿主限制?？梢詫?duì)任何基因型材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究；(2)靶受體幾乎包括所有具有潛在分化能力的組織或細(xì)胞。（3）易于操作。缺點(diǎn)：如轉(zhuǎn)化頻率低、嵌合體較多、結(jié)果的重復(fù)性差，轉(zhuǎn)化的外源基因以多拷貝居多，易導(dǎo)致基因沉默，實(shí)驗(yàn)成本較高等。還有很多將外源基因引入植物基因組的方法，如電激法、花粉管通道法、超聲波法等，它們都在不同程度上得到應(yīng)用。（二）基因槍法優(yōu)點(diǎn)：（1）無(wú)宿主限制。可以對(duì)任何基因型材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究；(第4節(jié)轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)與鑒定一、分子檢測(cè)二、生物學(xué)性狀鑒定第4節(jié)轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)與鑒定一、分子檢測(cè)PCRSouthern雜交Northern雜交Western雜交常用的轉(zhuǎn)基因生物分子檢測(cè)手段有一、分子檢測(cè)PCR常用的轉(zhuǎn)基因生物分子檢測(cè)手段有一、分子檢測(cè)PCR檢測(cè)PCR檢測(cè)外源基因的原理是根據(jù)被轉(zhuǎn)移的外源基因（目的基因或選擇標(biāo)記基因）設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增外源基因的片段。如果擴(kuò)增出的片段與設(shè)計(jì)的一對(duì)引物之間的實(shí)際片段在長(zhǎng)度上相吻合，說(shuō)明基因已轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。在進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)應(yīng)設(shè)兩個(gè)對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照即質(zhì)粒DNA和陰性對(duì)照即非轉(zhuǎn)基因材料的DNA。PCR擴(kuò)增結(jié)果只能初步確定轉(zhuǎn)基因材料的真實(shí)性，并不能完全確信。容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，通常需要進(jìn)一步用Southern雜交才能證實(shí)。PCR檢測(cè)PCR檢測(cè)外源基因的原理是根據(jù)被轉(zhuǎn)移的外源基因（目轉(zhuǎn)基因棉花選擇標(biāo)記基因NPTII編碼區(qū)段的PCR擴(kuò)增結(jié)果（M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，C為非轉(zhuǎn)基因植株，P為質(zhì)粒對(duì)照，1-20為轉(zhuǎn)基因植株）轉(zhuǎn)基因棉花選擇標(biāo)記基因NPTII編碼區(qū)段的PCR擴(kuò)增結(jié)果（MSouthern雜交(Southernblotting)◆將DNA用限制性酶酶切→酶切DNA電泳→變性→轉(zhuǎn)移到膜上→經(jīng)過(guò)標(biāo)記的DNA探針與膜上的DNA片段雜交→洗去膜上非特異性結(jié)合的探針→檢測(cè)雜交信號(hào)。◆如果轉(zhuǎn)移的膜上具有與雜交探針相同或部分同源的序列，就會(huì)檢測(cè)到雜交帶信號(hào)?！鬝OUTHERN.EXESouthern雜交(Southernblotting)◆第11章基因工程課件M123456789kb23.1-9.4-6.6-4.4-2.3-2.0-轉(zhuǎn)基因棉花的Southern雜交檢測(cè)（M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為陽(yáng)性對(duì)照，2為陰性對(duì)照，3-8為轉(zhuǎn)基因植株）M123456789kbNorthern雜交是一種RNA-DNA雜交。將提取的植物總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分離，則不同的RNA分子將按分子量大小依次排布在凝膠上；將它們?cè)晦D(zhuǎn)移到固相膜上；在適宜的離子強(qiáng)度及溫度條件下，用探針與膜雜交；然后通過(guò)探針的標(biāo)記性質(zhì)檢出雜交體。Northe