腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)

1122腫瘤個體化治療檢測技術指南（試行）前言腫瘤的個體化治療基因檢測已在臨床廣泛應用，實現(xiàn)腫瘤個體化用藥基因檢;醫(yī)學實驗室為患者或臨床醫(yī)護本指南是參考現(xiàn)行相關的法規(guī)和標準以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及腫瘤個體化治療靶點基因的不斷發(fā)現(xiàn),本技術規(guī)范相關內容也將進行適時調整。本指南起草單位：中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學國家重點實驗室、蘇專家修訂。本指南起草人：詹啟敏、曾益新、王玨、姬云、錢海利、李曉燕、孫石磊目錄1.本指南使用范圍 12。簡介 1標準術語和基因突變命名 1標準術語 13。2基因突變命名 2參考序列 2各類變異 24。分析前質量保證 5樣本類型及獲取 5采樣質量的評價 64。3樣本采集中的防污染 64。4樣本運送和保存 65。分析中質量保證 75.1實驗室設計要求 75。2檢測方法 75.3DNA提取方法與質量控制 135。4RNA提取方法與質量控制 14試劑的選擇、儲存及使用注意事項 14核酸擴增質量控制 14設備維護和校準 155。8人員培訓 155.9方法的性能驗證 156。分析后質量保證 176。1檢測結果的記錄 176.2失控結果的記錄與分析 176。3報告及解釋 17記錄保留 18檢測后基因咨詢 18樣本（及核酸）保留與處理 186。7檢測與臨床數(shù)據(jù)收集與分析 187。腫瘤個體化醫(yī)學檢測的質量保證 197.1標準操作程序 197。2質控品 19室內質量控制 20室間質量評價 207。5PCR污染控制 20附錄A：常見的檢測項目 22A。1基因突變檢測項目 22A.2基因表達檢測項目 30A。3融合基因檢測項目 33A。4基因甲基化檢測項目 34參考文獻： 371.本指南使用范圍測的醫(yī)療機構臨床分子檢測實驗室。2。簡介腫瘤個體化治療以疾病靶點基因診斷信息為基礎,以循證醫(yī)學研究結果為依據(jù),為患者提供接受正確治療方案的依據(jù)，已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)展的趨勢。臨床SNP,指導臨床個體化治療，能夠提高療效,減輕不良反應，促進醫(yī)療資源的合理利用.3。標準術語和基因突變命名標準術語1）基因（Gene：DNA。突變（Mutation）:DNA3)（新的基因的過程。融合基因的表達產(chǎn)物為融合蛋白。新的基因的過程。融合基因的表達產(chǎn)物為融合蛋白?；虮磉_(GeneExpression):DNADNAmRNA開始，一直到對于蛋白質進行翻譯后修飾為止?；驍U增（geneamplification):為一特異蛋白質編碼的基因的拷貝數(shù)選擇性地增加而其他基因并未按比例增加的過程。增加而其他基因并未按比例增加的過程。DNA甲基化(DNAMethylation）:DNA化學修飾的一種形式，將甲基添加DNADNA分子上,5碳上.DNADNA序列的DNA甲基化狀態(tài)遺傳至下一代細胞或個體。聚合酶鏈反應PCRDNA片段的技術。利用DNA在體外攝氏高溫時變性會變成單鏈,低溫時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結體外攝氏高溫時變性會變成單鏈,低溫時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結DNADNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖的方向合成互補鏈。8)8),這種物質通常與其他雜質混在一起，專門用于質量控制目的的樣本或溶液。這種物質通常與其他雜質混在一起，專門用于質量控制目的的樣本或溶液?；蛲蛔兠祟惢蚪M突變學會（HGVS)已建立系統(tǒng)的基因突變命名方法。具體基因突變命名方法可查閱網(wǎng)站/mutnomen/index.html.HGVS基因突變命名指南根據(jù)需求不斷更新.本文以2011年8月更新版本為準..例如“g?！北硎净蚪M序列，“c."表示cDNA序列，“m.”表示線粒體DNA序列,“r。”表示RNA序列列出，當兩種突變在反式（intrans）中檢測到，則用方括號表示。例如，CF變?yōu)殡s合性突變（5081303)，則在DNA水平規(guī)范描述方式為c。[1521_1523delCTT]+［3909C〉G］.3。3參考序列美國國立生物技術信息中心(NCBI）收錄的參考序列編碼具有權威性及唯一性。其中前綴“NM_”表示為mRNA序列,“NP_”表示多肽序列,“NG_”表示.5以及3'當使用某段編碼DNA參考序列描述突變時,應選擇合適的轉錄體，且轉錄體的起,數(shù)據(jù)庫里注釋最全面的版本.3。4各類變異3。4.1DNA序列變異術語規(guī)范DNAA（腺嘌呤)、C（胞嘧啶、G（鳥嘌呤)T（腺嘧啶）DNADNA>變方式時，數(shù)字、字母、箭頭、上標以及下標之間不應出現(xiàn)空格.PAGEPAGE33。4。2RNA序列變異術語規(guī)范RNA腺嘌呤c(胞嘧啶)鳥嘌呤尿嘧啶）行描述.RNADNAHGVS網(wǎng)站（http：///mutnomen/index.html）.3.4。3蛋白質序列變異術語規(guī)范蛋白質序列改變通常以單個字母或三個字母（第一個字母大寫）管單個字母描述氨基酸明確無誤,但是由于三聯(lián)密碼子相對于其編碼的氨基酸存在冗余性,具體給出發(fā)生突變的三聯(lián)體密碼子可以更清楚地描述氨基酸改變方A（丙氨酸、C（半胱氨酸)、G（甘氨酸)T（蘇氨酸)A（腺嘌呤、C（胞嘧啶、G（鳥嘌呤）T（胸腺嘧啶）相混淆.3.4.4錯義突變及無義變異術語規(guī)范DNADNA水平對某一突變位點的描述方式包括堿基位點，正常堿基551（甘氨酸）（天冬氨酸DNA水c.1652G>A。在氨基酸水平,由于錯義突變的產(chǎn)物以氨基酸殘基位點以及表示氨基酸的單字母或三聯(lián)體密碼子來描述。表示方法是野生型的氨基酸、位點、突變氨基酸，三者之間不要有空格。例如,p.Gly551Asp551號甘氨酸殘基（G)被天冬氨酸殘基（D)所代替。無義突變表示方法與之相類似.542位點的甘氨酸殘基被終止密碼子所代替.3。4。5缺失和插入術語規(guī)范del”和“ins”來表示，并注明突變位點以及堿基.例如，c.441delADNA441A堿基缺失.c241_243delATCDNA241243ATC三個堿基。p。Ile24del24號的indels”則表示該段序列缺失的同時有片段插入.DNA234239號位點缺失AATTCG六個堿基，同時該段位點被新插入的TA堿基所替代.3。4。6移碼突變術語規(guī)范符號來表示His62Profs*21表示該蛋白發(fā)生移碼突變,62號氨基酸由組氨酸突變?yōu)楦彼?221p.His62fs62號密碼子發(fā)生移碼突變。3.4。7堿基重復序列HGVS推薦，核苷酸重復序列基因多態(tài)性描述時通常以一個重復序列為單元[]CG［55。當重復序列的次數(shù)在一個范圍之內（,如某個人HTT1215CAG:+[15］，蛋白水平則表示為:p。Gln18［12]+［15］。HTT則描述為：c。52CAG（27_35)或p.Gln18（27_35）。3。4.8遺傳藥理學基因型術語規(guī)范最廣泛使用的命名法描述遺傳藥理學基因型不同于其他遺傳學基因檢測，例如代謝相關基因細胞色素p450家族，人類細胞色素P450（CYP）等位基因命名委員會（http：//www.cypalleles。ki.se）推薦用“*”命名，見圖1。在該系統(tǒng)中，最常見的等位基因被指定為“＊1”.圖1.細胞色素P4502D6等位基因命名規(guī)范3.4。9其他對于更復雜的突變，可參考HGVS（/mutnomen）建議的命名規(guī)則，解決其他復雜的變異的命名。4PAGEPAGE37PAGEPAGE364。分析前質量保證樣本類型及獲取新鮮組織(包括手術和活檢組織）腫瘤新鮮冷凍材料可提取出最高品質的DNA、RNA,以免產(chǎn)生假陰性結果。切割后取其中一半，并利用另一半切面制作組織標本,然后進行確認?！姹?，這一過程應在手術樣本離體后30需先進行病理學分析,在分析完成后應盡早將組織樣本置于穩(wěn)定劑中,避免核酸降解。。2石蠟包埋組織（formalin-fixedparaffin-embedded，F(xiàn)FPE）10%中性福爾馬林固定手術切除樣本,按病理學操作規(guī)范進行取材。5片連續(xù)切片,1HE的含量。在高靈敏度檢測方法中，可考慮使用活檢標本。DNA容易受固定的影響，長時間（1周以上）浸泡在福爾馬林中的樣本的DNA會被片段化,246～24小時為佳。胸腹水等細胞學樣本/冷凍保存，也可在含有細胞成（AL公司)等室,血漿樣本DNA(circulatingfreeDNADNA的比例在不同腫瘤及病例中相差懸殊（0。01～93%，從而限制了外周血在腫瘤分子檢測時的應用。目前已有多篇文獻證實可DNA檢出突變,ARMS法。DNA6~10ml全血，冷藏運輸，6小時內分離血漿，提取游離DNA，保存到—80℃冰箱中,并避免反復凍融。如外周血需長時間運輸，建議用DNA樣本保存管，在常溫條件下，cfDNA7天。采樣質量的評價腫瘤細胞是否存在,是開展腫瘤個體化治療基因檢測的重要前提.如果要確認腫瘤細胞存在,與病理診斷醫(yī)生密切合作是非常必要的.運輸。評價方法包括肉眼觀察、顯微鏡下觀察和濃度分析等。腫瘤組織切片等應經(jīng)病理醫(yī)師審閱，取一張切片HE染色后顯微鏡下觀察,確保腫瘤細胞存在，并記錄腫瘤組織含量，標注腫瘤細胞密集區(qū)域.4。3樣本采集中的防污染樣本采集最好采用一次性材料，不用處理便可直接使用;的殘留；采集中要特別注意防止污染，防止混入操作者的毛發(fā)、表皮細胞、痰液等；如使用玻璃器皿,必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的DNase失活；如提取RNA樣品，必須采用RNase抑制劑措施和無RNase材料.4。4樣本運送和保存原則上按照《個體化醫(yī)學檢測質量保證指南》要求進行。實驗室應建立詳細的樣本運送標準操作規(guī)程(SOP需要轉送的樣本:RNA后，放在干冰中運送。經(jīng)過適當穩(wěn)定化處理的樣本可在常溫下運送，如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血樣本及用于RNA擴增檢測的經(jīng)穩(wěn)定化處理的樣本。5。分析中質量保證實驗室設計要求原則上按照《個體化醫(yī)學檢測質量保證指南》要求進行.在符合國家衛(wèi)生計生委要求的個體化醫(yī)學檢測實驗室和通過審核驗收的臨床基因擴增檢驗實驗室完成。5。2檢測方法5。2。1Sanger5。2。1.1技術原理Sanger（ChainTerminationMethodDNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物.直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。3—OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在GATC處終止.終止點由反應中相應的雙脫氧而定.dNTPsddNTPs的相對濃度可以調整,使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上,可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測.5.2。1。2技術特點DNADNA的序列,因此被認為是基因分型的金標準。形式及突變的確切類型,如點突變、片段缺失.20%細胞的含量和比例要求較高，一般要求腫瘤細胞含量不低于50％，如果腫瘤細胞比例低于50％，則假陰性出現(xiàn)的概率會顯著增加；不適用于活檢或細胞學樣本.5.2.2焦磷酸測序法（Pyrosequencing）5。2.2。1技術原理4DNADNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和4dNTP聚合時（PPi)與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來,通過檢測熒光的釋放和DNA序列和定量分析序列變化的目的.5。2.2.2技術特點焦磷酸測序技術是一種新型的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術，其重復性和精確性可與Sanger測序相媲美,序分析.主要優(yōu)點：檢測靈敏度為10％，相對Sanger測序法高,對體細胞突變和甲基化等可實現(xiàn)定量檢測;分型準確可靠,通量較高，實驗設計靈活，可發(fā)現(xiàn)新的突變或遺傳變異。局限性：測序長度較短，不能對長片段進行分析。檢測靈敏度中等，難以檢出低于10%的突變.不適用于活檢或細胞學樣本.5。2。3新一代測序（nextgenerationsequencing,NGS）。3.1技術原理NGS又稱大規(guī)模平行測序MPS，包含多種可以一次性產(chǎn)生大量數(shù)字化基因序列的測序技術,Sanger測序的革命性進步,DNA分子進行測序，實現(xiàn)了大規(guī)模、高通量測序的目標。不同廠家的產(chǎn)品測序原理不同,主要分為邊合成邊測序（SequencingbysynthesiSBS、基于A簇和可逆性末端終結（ReversibleTerminato）大45。2。。2技術特點高通量測序技術不僅可以進行大規(guī)?；蚪M測序,還可用于基因表達分析、RNADNA主要優(yōu)點：高通量測序技術有三大優(yōu)點是傳統(tǒng)Sanger測序法所不具備的。第序技術有定量功能,DNADNA的豐度。第三、利用傳統(tǒng)Sanger27在利用高通量測序技術進行人類基因組測序,1千美金。,10%;NGS化和質量控制尚未形成共識。5.2。4擴增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS)—PCR法5。2.4。1技術原理（amplificationrefractorymutationsystemARMSPCR(allele—specificPCR,AS—PCR）5`DNA互補,端引物PCR,DNAPCRPCR不能延伸。。2技術特點ARMS-PCR是目前實驗室常用的基因突變檢測方法。主要優(yōu)點：ARMS-PCR法檢測靈敏度高，可檢測腫瘤細胞中突變比例為1%甚至更低的突變基因。局限性:只能檢測已知的突變類型，不能發(fā)現(xiàn)一些新的、未知的突變；如果應增加;DNA樣本量的需求增加。高分辨率熔解曲線（HRM)法5。2。5。1技術原理高分辨率熔解曲線（high-resolutionmelting，HRM)PCR新型技HRMDNA雙鏈體的熔解溫度差異反應了基因的變異。雙鏈DNA片段在其特定的溫度熔解，熔解的溫度由片段的CG含量、序列組成、長度以及一個和多個雜合堿基決定.DNA嵌合的染料可PCR擴增片段，擴增后的產(chǎn)物通過一個快速的可控的加熱處理開始熔解.熒光水平在升溫的過程中實時監(jiān)測，染料隨著雙鏈DNA的熔解，熒光信號逐漸減少。5。2.5.2技術特點HRM型、序列匹配、DNA甲基化等方面的研究。主要優(yōu)點：檢測靈敏度1%，特異性高，重復性好；封閉體系，減少污染的可能性;擴增和檢測同時進行，無需PCR后進行處理。需要有測序等補充。PCR（DigitalPCR）技術原理PCR是一種核酸分子絕對定量技術。相較于qPCR,PCR能夠直接DNA萬份,(模板)PCR擴增，擴增結束后對各個反應單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析。數(shù)字PCRLIFE、FluidigmRainDancePCR產(chǎn)品。5.2。6.2技術特點數(shù)字PCR目前的應用包括：稀有等位基因檢測、基因表達絕對定量、核酸標準品絕對定量、二代測序文庫絕對定量等。主要優(yōu)點：靈敏度可達0.001～0.0001％，高特異性，可檢測復雜背景下的靶標序列；可高度耐受PCR反應抑制劑；不必依賴對照品或標準品,可對目標拷貝數(shù)直接進行精確的鑒定，分析微小的濃度差異;實驗數(shù)據(jù)分析便捷，每個微滴的檢測結果以陰性、陽性判讀，數(shù)據(jù)分析自動化；可統(tǒng)計突變率，通過統(tǒng)計分析可得出靶點的突變率.PCR儀通量較低,FAMHEX2PCRDNA合泊松分布;PCR,qPCR，也不能代替其他金標準而作為首選方法。QX200PCR.55。2。7熒光原位雜交（FISH)。1技術原理熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）是通過熒光標記的DNADNADNA纖維DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復性,即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體.將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛,可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化DNA5.2。7.2技術特點FISH主要可對基因缺失、基因融合、基因擴增進行檢測。主要優(yōu)點:DNA空間定位精確；靈敏、特異性好,可同時分析分裂期和間期的多個細胞，并進行定量；可以檢測隱匿或微小的染色體畸變及復雜核型。局限性:FISH檢測對操作和判讀技術要求較高，診斷醫(yī)師必須經(jīng)過嚴格的FISHFISH可靠性;FISH檢測的成本昂貴、通量低。5.2。8免疫組化（IHC）5。2。8.1技術原理其達到對組織或細胞中的相應抗原進行定性、定位或定量的研究。5。2。8.2技術特點IHCFISH,IHC結果的因素主要包括抗體的選擇、檢測前組織的固定，觀察者解釋方面的差別等。5.2。95.2.9。1技術原理PCR（reversetranscriptionPCR）PCR(reversetranscription-PCR，R—PCR，是聚合酶鏈式反應PCR)RNADNA（cDNA）稱作“逆轉錄”,DNA聚合酶(逆轉錄酶）來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引DNADNAPCRRNARNA酶HDNA.技術特點熒光定量PCR是檢測拷貝數(shù)變化的一種快速且經(jīng)濟的技術方法,RNA要不足是對腫瘤組織提取RNA的質量要求較高,在檢測基因表達量時判讀標準尚未統(tǒng)一。FISH、IHCQ-RT-PCRALK1。表1：FISH、IHC和Q—RT-PCR檢測ALK基因重排的優(yōu)缺點比較IHCFISHQ-RT-PCR檢測對象蛋白DNARNA特異性++++++發(fā)現(xiàn)的融合類型已知、未知已知、未知已知通量+++++++費用++++++++5.2.3檢測方法選擇策略綜合選擇合適的方法。由于腫瘤組織的異質性，檢測的組織樣本中混有大量正常組織、石蠟樣本提由于腫瘤組織的異質性，檢測的組織樣本中混有大量正常組織、石蠟樣本提取的DNA取的DNA質量和數(shù)量有限，就檢測靈敏度而言，目前ARMS—PCR>焦磷酸測序〉Sanger測序.在檢測腫瘤基因突變時，不能一味追求檢測方法的靈敏度,靈敏度高的檢測方法對整個實驗過程中的質控要求更為嚴格，需防止因污染而產(chǎn)生假陽性。在腫瘤靶基因表達檢測時，由于腫瘤樣本的不可再生性，需謹慎選擇使用的方法，如選用熒光定量PCR要求提取的總RNA量達1μg以上,如果腫瘤組織過小提取的RNA量可能達不到檢測要求，此時應考慮選用對樣本量要求低的檢測方法。5。2。4檢測項目本指南根據(jù)檢測靶分子（DNARNA）類型及基因表達調控機制類型的不同，將腫瘤個體化治療檢測項目分為基因突變、基因表達、融合基因、基因甲基1,5。3DNA提取方法與質量控制DNA（HE染色（5025%，對于ARMS等敏感性較高的方法，腫瘤細胞的含量和比例可以低一些。具體視所采用的DNA提取方法和突變檢測方法的敏感度等而定。對于新鮮和凍存的手術組織樣本,DNADNA的試劑盒。對于商品化核純化的靶核酸的完整性可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與核酸標準品比較測定。核酸提取的產(chǎn)率:可在A260讀數(shù)測定，DNA可溶于TE溶液中，建議濃度控制在50~100ng/ul,總量20~40μg或以上。核酸純度可通過提取物260/280比率判定,DNA1.8RNA20。若DNA1.8，說明制劑中RNARNADNA溶液中含有酚和蛋白質將導致比值降低。5。4RNA提取方法與質量控制RNA提取常比較困難，尤其是保存年限較長的腫瘤組織，RNARNA降解的原因有兩個方面:RNA23位置帶有羥基,RNARNA溫后仍然能夠正確折疊恢復活性。因此從樣本的儲存、RNARNaseRNA的降解作用。RNA提取的經(jīng)典方法是胍鹽提取結合酚-RNARNARNA類型來選擇。RNase100ng/ul以上，總量達30μg以上。RNAOD260/OD280比值,RNA：1.7＜OD260/OD280＜20(＜17時表明可能有異硫氰酸殘存DNARNA的完整程度.5。5試劑的選擇、儲存及使用注意事項CFDACFDA批準的試劑,或具有嚴格標準操作規(guī)程(SOP)的自配試劑（LD。IFCCWHO等推薦的方法性能。所用標準品或標準參考物符合國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心推薦的標準和要求。5。6核酸擴增質量控制PCR.臨床樣本擴增時，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性和假陰性，導致檢測結果得出錯誤結論，有時可造成嚴重后果.1DNADNA擴增的有效性,1DNAcDNADNARNA.陰性對照樣品檢測為陰性品檢測結果成立的前提下,才能對檢測樣品擴增結果進行判定。5.7設備維護和校準與維護關系到儀器的適用率、數(shù)據(jù)的準確率。術人員共同完成,驗收內容按采購合同中技術需求部分以服務協(xié)議書的要求逐項進行，并且建立儀器設備檔案.儀器設備應定期開展校準計量,未經(jīng)計量檢定、計量檢定不合格或未驗收的對測試有重要影響的儀器設備不得投入使用.實驗室日常工作中，應重視儀器設備的清潔及維護，做到日維護、周維護、月維護，并及時記錄.5。8人員培訓檢測人員應該有相關的教育背景、相應的工作經(jīng)驗，接受過專業(yè)培訓。培維護及校準、質量控制等,檢測人員應該有相關的教育背景、相應的工作經(jīng)驗，接受過專業(yè)培訓。培維護及校準、質量控制等,外部培訓包括國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心和國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學檢測培訓基地等機構組織開展的各種技術培訓。5.9方法的性能驗證方法學引進初期需對檢測系統(tǒng)測定項目各參數(shù)的實驗或評估性驗證，包括精所有項目的方法驗證應形成詳細的資料備存,資料需詳細描述方法驗證的目的、過程、檢測結果、分析判斷及驗證結論.驗證的結果及結論須經(jīng)實驗室負責人簽字后才能用于臨床檢測。根據(jù)項目的特性,一些方法驗證指標不需進行或未進行時，需在報告中書面解釋原因。推薦用打印的文稿并在專用文件夾保存.具體的性能驗證方法,CFDA上相應的性能指標部分進行驗證,看是否能在其實驗室內復現(xiàn)說明書所顯示的上LDT立上述性能指標.以下方法可供參考。【準確度】參加國家衛(wèi)生計生委臨檢中心組織的室間質評,從室間質評統(tǒng)計結果評價實驗室檢測結果的偏倚或符合情況，從而評價和驗證實驗室檢測結果的準確性。2）20用兩種方法同時測定同樣的樣品.如結果有不符合時，應采用第三種方法或試劑進行確認。樣本稀釋成不同濃度再檢測，以評估其準確度?！眷`敏度】分析靈敏度:就是確定檢測方法的檢測下限：將一份已知定值的標準品，用野3管，3管全部檢出且其線性∣r∣≥0.98的最低稀釋濃度即為該方法的檢測下限.(10倍以下的稀釋2)臨床靈敏度：主要是驗證方法的假陰性率。從三甲醫(yī)院或專業(yè)權威檢測機構收20～50例樣本,進行檢測分析，其靈敏度應滿足臨床檢測要求，靈敏度=[TB/TB+FN］10（TB=truepositiveFN=falsenegativeCFDA試劑,20例陽性樣本進行驗證;CFDA批文的檢測試劑或自己實驗室研LDT50例陽性樣本進行驗證，并應進行室間比對?！咎禺愋浴?）特異性的驗證主要是確認該方法的假陽性率，特異性=［TN/（TN+FP)]×100(TN=truenegative、FN=falsepositive）.20～50例陰性樣本,特異性應滿足臨床檢測要求。有CFDA20CFDA批文的檢測項目或自己研發(fā)的項目,50驗證。6。分析后質量保證6。1檢測結果的記錄1）檢測結果的報告應準確、清晰、明確、客觀和及時，杜絕虛假報告。儀器原始數(shù)據(jù)要仔細分析,PCR擴增的有效性，只有當質控品的擴增結果符合項目SOP有關條件時，才可發(fā)出報告，否則應重新測定。3）報告內容至少應包括：實驗室失控結果的記錄與分析如發(fā)現(xiàn)質控數(shù)據(jù)違背了控制規(guī)則，操作員應填寫失控記錄或失控報告單，上質控品測定合格后再簽字發(fā)出.報告及解釋1),需提供紙質版檢測,送檢醫(yī)生通過登陸網(wǎng)站進行檢測結果的查詢。2）檢驗報告單的應具有患者基本信息、樣本情況（采集、送檢及檢測時間、樣本性質及狀態(tài)等、檢測項目、檢測方法、結果、結果的意義、用藥建議、檢測核者對檢驗報告的質量負責。核者對檢驗報告的質量負責。3）結果解釋的責任屬于臨床實驗室，應根據(jù)所檢測的人群解釋結果。臨床解釋.綜合.綜合義，為個體化用藥提出建議。記錄保留患者和樣本信息:接收樣本后,,11年以上.《檢測過程實驗記錄》保存于擴增區(qū)的專用文件6。5檢測后基因咨詢單上提供咨詢服務的方式和途徑，如客戶服務專線,配置專業(yè)的咨詢服務人員；方便臨床醫(yī)生和患者隨時反饋意見和提出咨詢。6。6樣本（及核酸）保留與處理并按規(guī)定存放，保存好樣本的原始標碼,建立配套的樣本存放信息管理系統(tǒng)。醫(yī)療廢物管理辦法》及國家、地區(qū)的相關要求。6。7檢測與臨床數(shù)據(jù)收集與分析節(jié)。臨床的檢測結果應定期統(tǒng)計分析,如基因突變的陽性率，如果發(fā)現(xiàn)陽性率高于資料報道值,,如果陽性率偏低,測方法的局限性考慮假陰性的可能,并進行針對性的改進。腫瘤個體化治療檢測的質量保證標準操作程序原則上按照《個體化醫(yī)學檢測質量保證指南》的要求進行。腫瘤個體化治SOP測方法、結果分析和報告、儀器操作、實驗室安全措施等臨床檢驗的所有環(huán)節(jié)。SOPSOP中的步驟要求進行操作,應每年定期根據(jù)實驗室的運行狀況進行SOP且規(guī)范進行，并防止無效或作廢版本文件使用。7。2質控品樣本等，都應合理設置質控品。7。2.1質控品類型陽性對照：以含有目的片段的DNA(或質粒)作為模板進行擴增，證明PCR試劑是否有效、擴增過程是否正確.但陽性樣品擴增效率高,應嚴格控制其濃度和存放位置，避免其成為潛在的污染源。例如，檢測基因突變時，應根據(jù)選用的檢測方法，選擇該方法最低檢測限的陽性樣本.陰性對照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進行擴增,用于證明擴增過程中無假陽性現(xiàn)象?？瞻讓φ?以純水作為模板進行擴增，用于證明擴增過程中無假陽性現(xiàn)象.PCR抑制物對照：在與陽性對照相同的反應體系中,DNADNAPCR抑制物。,DNA提取試劑或過程中可能受到污染。陽性提取對照:陽性提取對照擴增結果為陰性，說明提取過程可能有誤。如DNA陽性對照擴增結果為陰性,DNA性,PCR.基因檢測單核苷酸多態(tài)性（SNP)時，需要設置多個陽性對照用于檢測野生.本，如基質或采樣方法與待測樣本相同.7。3室內質量控制則設定室內質量控制：如果只檢測1個基因突變，定性測定有一份接近倍的弱陽性和一份陰性質控樣本即可.質控品的設置數(shù)量隨檢測樣本數(shù)的增加而按50~60,可以根據(jù)實驗室自身的條件，可只設立能23如果每次質控品的檢測結果均成立，說明結果可信,報告可以發(fā)出;的基因突變和其相應的對照重新檢測。"7。4室間質量評價臨床檢測實驗室應參加室間質評EQA過程，根據(jù)反饋結果了解本實驗室的能力、自查存在的問題,及時尋求改進方法解決問題，完善實驗室質量控制體系。7.5PCR污染控制PCRPCRPCRPCR和質粒分子很容易造成實驗室的污染,導致假陽性現(xiàn)象發(fā)生.通過規(guī)范實驗室設計、規(guī)范試劑耗材管理、規(guī)范實驗室操作和技術處理來控制污染.PCRPCRPCR氣溶膠污染和實驗室中克隆質粒的污染.PCR擴增實驗中使用dUTPdTTP。AA。1基因突變檢測項目A。1。1EGFR基因突變檢測【基因簡介】EGFR是原癌基因c-erbB1的表達產(chǎn)物,【基因簡介】EGFR是原癌基因c-erbB1的表達產(chǎn)物,HEREGFR/HER1/erbB1HER2/neu/erbB2HER3/erbB3HER4/erbB4要的調節(jié)作用?！境Ｒ娡蛔儭縀GFR的突變主要發(fā)生在胞內酪氨酸激酶(TK)區(qū)域的前四個外顯子上(18~21），TK30多種.缺失突變主要發(fā)生在外顯子19delE746-A75021上的L858R2020上的替代突變T790M為耐藥突變,L858Q、D761Y、T854A等耐藥突變.EGFR—KTI的有效性也因突變類型而【EGFREGFR—KTI的有效性也因突變類型而不同,19不同,1981%，L858R71％，G719X的56%.50%患19L858R790位密碼子蘇氨酸向蛋氨酸的突變（T790M)1～3TKIT790MTKI治療難以有效。10%10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的非小細胞肺癌腫瘤組織?？??！緳z測方法】推薦ARMSSangerEGFR一代測序技術同時進行肺癌驅動基因的檢測。（1)預測藥物療效:EGFRHER/ErbB家族信號通路的首要分子，吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI進入細胞內，直接作用于EGFR胞內的激酶區(qū)，干擾吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI進入細胞內，直接作用于EGFR胞內的激酶區(qū)，干擾ATP合成，抑制酪氨酸激酶的活性，阻斷激酶的自身磷酸化及底物的信號通路的激活，阻滯細胞在G1期，促進凋亡，抑制新生血管形成、侵襲和轉TKIEGFRTKI療效預測因子。(2(2）EGFR-TKI對肺癌切除后患者進行預后分析，EGFRTKIEGFRTKI基因突變與女性、非吸煙者等這些傳統(tǒng)的預后良好因子有交叉，只分析基因突變進行預后評價幾乎是不可能的.【用藥建議（1EGFR191921外顯子突變18外顯子突變（G719X）TKI可獲益。1~3%TKINSCLC20T790MTKI治療后超過50%TKI治療后超過50%后耐藥的患者出現(xiàn)T790M突變陽性，導致TKI治療失敗.L747SD76IYT854A突變陽性時，患者也會對吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制劑耐藥?！揪窒扌浴颗R床實踐表明，并不是所有攜有EGFRNSCLC患者都對酪氨酸激酶抑制劑有效,EGFR—TKI的有效性因突變類型而不同，如對外顯子19酸激酶抑制劑有效,EGFR—TKI的有效性因突變類型而不同，如對外顯子19缺81%，L858R71％,G719X的有效率為5620TKI10％的EGFRNSCLC患者對酪氨酸激酶抑制劑有效，但其機制尚不明確。A。1。2KRAS基因突變檢測RASK-RASN-RASRASK-RASN-RAS90%的氨基酸同源序列，分子RASp21G苷（GDP）結合為非活性狀態(tài)，與三磷酸尿苷(GTP）結合為活性狀態(tài)，RASp21GTPase活性，位于細胞膜內側參與跨膜信號傳遞作用.KRAS基RAS124個編碼外15’189RAS蛋白.KRAS是表皮生長因子受體功能信號的下游分子，屬膜結合型GTP／GDP結合蛋白,通過GTP和GDP的相互轉化作用有節(jié)制的調節(jié)KRAS傳遞細胞生長分化信號?！綤RAS基因的常見突變】KRAS基因突變發(fā)生在腫瘤惡變的早中期，并且原發(fā)灶和轉移灶的KRAS基因狀態(tài)基本保持一致.目前研究發(fā)現(xiàn)，KRAS基因在膀胱、乳腺、直腸、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、胃,還有造血系統(tǒng)等均在一定頻率的突變，其中以結直腸癌、胰腺癌和肺癌的發(fā)生率比較高,灶和轉移灶的KRAS基因狀態(tài)基本保持一致.目前研究發(fā)現(xiàn)，KRAS基因在膀胱、乳腺、直腸、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、胃,還有造血系統(tǒng)等均在一定頻率的突變，其中以結直腸癌、胰腺癌和肺癌的發(fā)生率比較高,在胰腺癌組織高達90%以上，在肺癌中則以肺腺癌為主，突變率為20～30%,結直腸癌患者突變率為27~43KRAS基因催化活性區(qū)突變時,RASRASEGFRRAS信號通路的異?；罨?影響細胞的生長、增殖和分化，促進細胞的惡性轉化，導致細胞增殖失控而癌變.KRAS基因最常見的突變方式為點突變，90%KRAS2號外12131～4%61146密碼子突變.其中結直12密碼子(82%)是最常見的突變位點。一般中國人群樣本檢測數(shù)據(jù)G12AG12S/C，西方人群相反.經(jīng)10經(jīng)10％中性福爾馬林固定石蠟包埋的結腸癌/肺癌腫瘤組織,或者與原發(fā)灶具有同樣病理形態(tài)的轉移組織。或者與原發(fā)灶具有同樣病理形態(tài)的轉移組織?！緳z測方法】可以采用Sanger測序法，也可采用靈敏度高的ARMS—PCR等。EGFREGFR從而發(fā)揮抗腫瘤的KRAS狀態(tài)的影響,KRAS無需接受上游EGFR信號KRASKRAS狀態(tài)的影響,KRAS無需接受上游EGFR信號KRAS基因野生型的患EGFR的治療中獲益,而突變型的患者則不能。【用藥建議】KRAS野生型患者使用西妥昔單克隆抗體和帕尼單克隆抗體治療效果確切，可顯著提高患者的生存率和改善生活狀態(tài),KRAS2號12號密碼子和（或號密碼子或其他密碼子任意突變型患者使用西靶向藥物治療時,應詢問所有結腸癌患者的家族史，如果懷疑患者有遺傳性非息肉病性結直腸癌（HNPCC）、家族性腺瘤性息肉?。‵AP)和輕表型家族性腺瘤性息肉病（AFAP），除非是進行臨床試驗，否則不應使用貝伐珠單克隆抗體、西妥昔單克隆抗體、帕尼單克隆抗體或伊立替康?！揪窒扌浴颗R床實踐表明,只有50％的野生型KRAS患者對抗EGFR治療有效，EGFREGFRKRASEGFR靶向藥物的治療效果.A.1。3BRAF基因突變檢測【基因簡介】BRAF1988Ikawa等首先在人類尤因肉瘤中發(fā)現(xiàn)并克NIH3T3DNA序列。BRAFARAFCRAFRAFB1，位于人7q34,NIH3T3DNA序列。BRAFARAFCRAFRAFB1，位于人7q34,783CR1、CR2CR3.BRAFRas—Raf-MEK-ERK信號轉導通路重要2510對堿基組成，主要通過有絲蛋白激酶通路中的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶來發(fā)揮作用,該酶將細胞表面的受體和RAS蛋白通MEKERK與核內的轉錄因子相連接，啟動多種因子參與調控細胞內多種生物學事件,.,如惡性,BRAF突變?！境Ｒ娡蛔儭緽RAF突變主要有兩種類型:1.11%exon11上的甘氨酸環(huán)，如G463、G465、G468的點突變；2。89exon15,其中921799導致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代(V600EV599E)1％BRAFRAS突變,1突變幾乎均為非V600EBRAFNIH3T3細胞轉化能力提高，但以后者更為重要。V600ET598S601兩個位點的磷酸化作用,BRAF蛋白激活.BRAF突變與維羅非尼(vemurafeni】2011FDA批準維羅非尼用于治療晚（轉移性（轉移性)BRAFV600E該藥的安全性和療效評估基于一項國際單中心研究。該研究納入675例BRAFV600E8個月的患者生存）。該藥最常見副作用為關節(jié)痛、皮疹、脫發(fā)、疲乏、惡心和皮膚光敏感.中國黑色素瘤患者中BREF關節(jié)痛、皮疹、脫發(fā)、疲乏、惡心和皮膚光敏感.中國黑色素瘤患者中BREFV600E變異率接近26％，雖然不如白種人（約1/4黑色素瘤患者,因此該藥物對于黑色素瘤患者的治療有著十分重要的意義?！緳z測樣本類型】經(jīng)10％中性福爾馬林固定石蠟包埋的結腸癌腫瘤組織和黑色素瘤組織。素瘤組織。BRAFSangerARMS-PCRARMS-PCR等方法進行檢測。【臨床意義】（1）BRAFKRAS下游級聯(lián)信號通路上的一個重要蛋白，BRAFEGFRBRAFEGFR抑制劑西妥昔單克隆抗體和帕尼單克隆抗體等療效減弱或無效。V600E突變患者呈現(xiàn)預后更差的趨勢。(3）BREFV600E基因突變的黑色素瘤患者對維羅非尼治療有效。KRASBRAFKRASBRAFV600E突變的患者,EGFR單克隆抗體靶向藥物治療可能無效。(2）回顧性亞組分析顯示，BRAF患者,EGFR單克隆抗體靶向藥物治療可能無效。(2）回顧性亞組分析顯示，BRAFV600E是否存在突變,EGFR單克隆抗體聯(lián)合有,一線治療后病情進展的患者,BRAFV600EEGFR（3)50％以上表達BRAFV600突變的晚期黑色素瘤患者在維羅非尼治療中可獲得臨床應答?！揪窒扌浴?1）BRAF基因突變的檢測用于預測結直腸癌抗EGFR單克隆抗體靶向藥物的治療效果和預后,NRASKRASPI3KCA等基因的突變的檢測BRAFV600BRAFL597K601BRAF步開展研究來證實這些發(fā)現(xiàn)。A.1。4C-KIT基因突變檢測【基因簡介】C—KIT基因位于人染色體4q11-21,屬于原癌基因，其cDNA全長5230bp,21145KD的跨膜酪氨酸激酶受體(tyrosinekinasereceptor，RTK)CD1171號外顯子編碼起始密碼子和信號2—910號外顯子編碼疏水跨膜結構域,11-2011號外顯子編碼近膜區(qū)段。5230bp,21145KD的跨膜酪氨酸激酶受體(tyrosinekinasereceptor，RTK)CD1171號外顯子編碼起始密碼子和信號2—910號外顯子編碼疏水跨膜結構域,11-2011號外顯子編碼近膜區(qū)段。C-KIT受IIIRTK家族，分布于細胞表面，可以用CD117單克隆抗體檢測,與血小板衍生生長因子受體(platelet-derivedgrowthfactor有很強的同源性?！境Ｒ娡蛔儭慷鄶?shù)胃腸道間質瘤(GIST）發(fā)生源于C—KIT基因突變,C-KIT突變131417也可以發(fā)生突變.8～50GIST中可觀察到典型的突變,35%GIST中，C—KIT基因突變型式并不完11號外顯子突變，導致其編碼的近膜結構域的空間結構改變，消弱或喪失對激酶結構域的抑制功能.【C-KIT基因突變與伊馬替尼療效】甲磺酸伊馬替尼商品ablv—abl、PDGFRC-KIT蛋白等。伊馬替2001511月在歐洲上市,20024月在中國上市.最初被應用于費城染色體陽性的（Ph+）慢性粒細胞白血病(CML）的治療，GIST治療進入了分子靶向時代.一般認為C—KIT/PDGFRA突變類型可以預測伊馬替尼的療效，其中C-KIT11PDGFRAD842V突變可能對伊馬替尼與舒尼替尼GISTC-KIT9C—KIT野生型者C-KIT11C-KIT1314突變患者療效C-KIT17、18突變者.CSCO胃腸間質瘤專家委員會推薦存在以下情況時,應該進行基因學分析：GIST-C-KITPDGFRA突變分析，以明確GIST的診斷；④鑒別NF1GIST、完全性或不CarnesCarnesGISTGIS；⑤鑒別同時性和異時性多GIST。C—KIT91317號外顯PDGFRA1218號外顯子。由于大多數(shù)C-KIT119號外顯子，對于經(jīng)濟承受能力有限的,C—KIT13、14、1718外顯子.【檢測樣本類型】經(jīng)10%中性福爾馬林固定石蠟包埋的GIST腫瘤組織。推薦檢測的樣本類型為治療前的原發(fā)癌腫瘤組織或轉移的腫瘤組織.【檢測方法】C-KITSanger測序法、ARMS-PCR等方法檢測特定的突變位點.(1）KIT受體功能，從而抑制腫瘤的形成。已有研究證實，C-KITC—KITGIST診斷，也可以進一步CD117GISTGIST，指導化療,預測化療的效果.（2)C-KIT11外顯子發(fā)生突變后，患者預C—KITPDGFRA基因突變的患者或者未檢測到C—KITPDGFRA基因突變的患者預后更差.來源于小腸或結腸的CIST如C—KIT9C-KIT11外顯子突變者更具有侵襲性.C—KIT9、、1217C-TKI靶向藥物治療中獲益。當13、14、17、18外顯子的繼發(fā)性突變時，則使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑出現(xiàn)耐藥。【局限性】由于存在腫瘤異質性,或腫瘤組織中混有大量正常組織,或壞死組織過多等，均有可能導致假陰性結果的產(chǎn)生.同時還有部分患者無法提供檢測所需的C-KIT基因狀態(tài)的變化，均可導致治療的失敗.此外，C-KIT基因的突變CYP4503A4C-KITA。1。5PDGFRA基因【基因簡介】PDGFR是分子量為180kD的單鏈膜糖蛋白，細胞外配體結合區(qū)含5,激酶區(qū)斷裂處，為親水氨基酸插入序列。受體分子由α,β兩種亞基組成5,激酶區(qū)斷裂處，為親水氨基酸插入序列。受體分子由α,β兩種亞基組成,成熟后PDGFR以二聚體穩(wěn)態(tài)形式PDGF(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)相應異構體(PDGF—AA，AB,BB)結合。結直腸癌組織中PDGFRαPDGFRβ均有表達分布，PDGFRα分布于結直腸正常組織、息肉組織及腫瘤組織上;PDGFRβ表達于腫瘤細胞、腫瘤間質細胞和微血管細胞（包括微血管周細胞）上?！綪DGFRAPDGFRAGIST、膠質母細胞瘤、惡性GISTPDGFRA5~10％左右，突變主PDGFRA（12)和激酶區(qū)(14和外顯子0.8%39％,18突變?yōu)橹?PDGFRA常見突變類型見。PDGFRA基因突變后則通過活化AKTMAPK及STAT蛋白中STAT3A—RafPLCG1PDCFR依賴途徑的信號轉導,PI3KPDCFR非依賴的信號轉導?！緳z測樣本類型】經(jīng)10％中性福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織。推薦檢測的樣本類型治療前的原發(fā)癌腫瘤組織或轉移的腫瘤組織.【檢測方法】PDGFRA基因突變的檢測方法可以采用Sanger測序法、ARMS—PCR等方法檢測特定的突變位點?！九R床意義】(1）輔助診斷和預測療效:伊馬替尼是一種酪氨酸蛋白酶抑制劑,能阻斷酪氨酸蛋白激酶KIT受體功能,從而抑制腫瘤的形成。已有研究證實，PDGFRA基因突變的位置能影響腫瘤患者對伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑的反應。研究表明，PDGFRA1218大部分基因位點突變后使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑治療時GIST18D842V、RD841—842KID1842—843IM突變使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑治療時GIST（2）PDGFRAKIT因突變的患者侵襲性低。PDGFRA12Tyr555CysAsp56lVal18Asp846Tyr18外顯子中的D842VRD841—842KI和DI842—843IM突變時，使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑則出現(xiàn)耐藥。,或壞死組織過多等,無法避免假陰性結果的產(chǎn)生。同時還有部分患者無法提供檢測所需的組PDGFRA基因狀態(tài)的變化，均可導致治療的失敗。此外，PDGFRA基CYP4503A4狀態(tài)PDGFRA基因的突變，使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑不一定能達到預期臨床療效，需要考慮其他因素的干擾.基因表達檢測項目HER2基因表達HER2HER2HER2HER2neu基因或基因。編碼分子量185kD的跨膜蛋白,p185HER2，是具HER2受體介導的信號通路是一個復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng),包括輸入細胞層(配體或生長因子）、信息加工層(受體,SH2蛋白,轉錄因子)和輸出層(細胞生長，分化和轉移）。配體介導受體的二聚體是關鍵，使HER2在整個信號網(wǎng)絡:RasRaf-Mek-MAPKPBKAkt激酶、激酶、cAMP（蛋白激酶A）、磷脂酶C-r和src等。HER2通過這些信號轉導通路使細胞增殖周期變短，惡性表現(xiàn)增強和抗凋亡路使細胞增殖周期變短，惡性表現(xiàn)增強和抗凋亡.【HER2基因過表達與乳腺癌等】HER2基因在乳腺癌、膀胱癌、結直腸癌、胃癌和非小細胞肺癌等中均存在表達上調。許多研究資料表明，在20～30％的乳HER2基因明顯擴增或過表達,HER2基因過表達的乳腺癌患HER2基因位于細胞表面，易被抗體接HER2基因可作為抗腫瘤治療的一個靶點?！緳z測樣本類型】經(jīng)10％中性福爾馬林固定石蠟包埋的乳腺癌腫瘤組織。治療前的原發(fā)腫瘤組織或轉移的腫瘤組織。HER2FISHIHCPCR法用于檢測HER2基因的表達尚未得到認可。一般來說，實驗室首先采用HER22+，則進行原位雜交方法進HER2基因檢測確認.【結果判讀】【結果判讀】免疫組織化學（IHC）檢測：1）免疫組織化學（IHC）檢測：1）3+，HER2表達陽性；2）1+或陰性，表達陰性；3）2+FISH檢測。FISH檢測：HER2CEP17信號數(shù)比值：≥2。0為陽性,HER-2/neu基因擴增；HER2CEP17信號數(shù)比值:＜2.0時，HER2拷貝數(shù)≥6。0HER2拷貝數(shù)＜4.0基因擴增；若HER2拷貝數(shù)≥4.0，但＜6.0時為不確定，不能確定HER-2/neu基因狀態(tài).3)若眾多信號HER2信號連接成簇時可不計算，即視為基因擴增。HER2療方案的先決條件，對乳腺癌的診療具有重要的指導作用。（1)預后評價:研究顯示,HER2還是一個重要的臨床預后指標,HER2基因擴增的乳腺癌浸潤性強、無進展生存期(progressfreesurvivalPFS）短、預后差。而且這部分患者就診時HER2基因擴增與導管原位癌（ductalcarcinomainsitu，DCIS)的預后相關。（2),HER2而言,HER2HER2CMF化療方案的反應性降低，宜采用高劑量的蒽環(huán)類藥物方案.（3）靶向藥物療效預測：大量臨床研究數(shù)據(jù)提示，使用曲妥珠單克隆抗體HER2基因擴增或蛋白過表達患者的生存，使乳腺癌患者獲益。即使在使用曲妥珠單抗治療過程中出現(xiàn)疾病進展而需要進一步治療的乳腺HER2增的乳腺癌患者，使用曲妥珠單抗療效不佳.HER2HER2HER2PI3KCA基因突變、PTENHER2生突變時，則會對曲妥珠單抗和拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制劑耐藥。【局限性】由于方法學本身的局限性，IHCFISHHER2基因狀態(tài)做出明確判斷.即使經(jīng)IHC或FISHHER2身所造成的假陽性，也可能是HER2基因的信號通路中還存在其他異常的位點IHCFISH分患者無法提供檢測所需的組織樣本，或組織樣本無法滿足進行檢測的基本要HER2IHCHER2基因狀態(tài)進行動態(tài)、實時的監(jiān)測.融合基因檢測項目A。3。1EML4-ALK融合基因檢測項目（anaplasticlymphoma1994AMS31620個氨基酸組成的跨膜蛋白,屬于胰島素受體家族。EML4是人類棘皮動物微管相關蛋白4（echinodermmicrotubule—associatedprotein-like（anaplasticlymphoma1994AMS31620個氨基酸組成的跨膜蛋白,屬于胰島素受體家族。EML4是人類棘皮動物微管相關蛋白4（echinodermmicrotubule—associatedprotein-like4，EML4)，屬于棘皮動物N末端堿基區(qū)、疏水的棘皮動物微管相關蛋白區(qū)（hydrophobicechinodermmicrotubule-associatedprotein—likeprotein，HELP)及WD2（2p215EML4的片段,3ALK的片段,EML4基因片段與殘ALKEML4BASIC區(qū)域，疏水的棘WD（后兩部分在部分亞型中缺失ALKKinase功能區(qū).EML4-ALKPI3—K/Akt、STAT3/5Ras-MEKPLC-γ/PIP2等，這些通路與細胞存活、增殖和遷移密切相關?！綞ML4—ALK融合與克唑替尼】克唑替尼是一種酪氨酸激酶受體抑制劑，靶向ALK、肝細胞生長因子受體（HGFR，c