動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)

關(guān)于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)第一頁，共三十七頁，2022年，8月28日第十一章動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)教學(xué)內(nèi)容

1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法3、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器4、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)5、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝第二頁，共三十七頁，2022年，8月28日第十一章動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)本章內(nèi)容提要

在生物技術(shù)中，人們已廣泛地圍繞著細(xì)菌、酵母、絲狀真菌等微生物的大量培養(yǎng)來生產(chǎn)各種酶、抗生素、蛋白質(zhì)等產(chǎn)物。然而，許多有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)，必須借助于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)來獲得，例如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等，如表11-1所示的是一些已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化和正在研究開發(fā)的產(chǎn)品。大規(guī)模的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)開始于本世紀(jì)50年代，經(jīng)過多年來的研究，人類對動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了大量的研究開發(fā)，取得了很大的進(jìn)展。盡管如此，目前的技術(shù)水平還遠(yuǎn)不能滿足細(xì)胞生物產(chǎn)品研究和生產(chǎn)的要求，隨著動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用日趨廣泛，已顯示出很廣闊的發(fā)展前景。目前由動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物包括哪幾類？請分別列舉出2-3個(gè)產(chǎn)物。問題第三頁，共三十七頁，2022年，8月28日表11-1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物

疫苗人小兒麻痹癥疫苗、狂犬疫苗、風(fēng)疹疫苗、腦炎疫苗、皰疹疫苗等

動(dòng)物牛病毒性腹瀉疫苗、牛痢疾疫苗、犬傳染性肝炎疫苗、雞痘病疫苗、豬霍亂疫苗、牛疫狂犬疫苗、草魚出血熱疫苗單克隆抗體IgG、IgM、IgA等免疫調(diào)節(jié)劑β-細(xì)胞生長因子、干擾素、白細(xì)胞活化因子、血清胸腺因子、白細(xì)胞介素、胸腺素、巨噬細(xì)胞毒力因子等酶尿激酶、天門冬氨酰胺酶、膠原酶、細(xì)胞色素P、450、纖維蛋白溶酶原激活劑、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脫羥酶等激素絨膜促性腺激素、促紅細(xì)胞生成素、促濾泡激素、生長激素、促間質(zhì)細(xì)胞激素、促黃體激素等第四頁，共三十七頁，2022年，8月28日補(bǔ)充內(nèi)容（一）單克隆抗體哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有一套復(fù)雜的防御系統(tǒng)保護(hù)自己不受有毒物質(zhì)和病原物的侵害，其中一部分防御反應(yīng)就是淋巴細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異的蛋白，這些蛋白可以在其他免疫系統(tǒng)蛋白的幫助下與外來物質(zhì)結(jié)合，并抵消其生物學(xué)功能。這些特異的蛋白，就是抗體；相對于抗體，誘發(fā)產(chǎn)生抗體的外來物質(zhì)即稱為抗原。抗體最早是由德國微生物學(xué)家貝林發(fā)現(xiàn)的，它們存在于人和脊椎動(dòng)物的血清之中，是這些生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的重要組成成分。由于抗體分子具有極其精確的結(jié)合特異性，可以識(shí)別各種不同的抗原，還可以激活細(xì)胞的其他防衛(wèi)系統(tǒng)以消滅抗原，因此抗體在基礎(chǔ)研究和臨床診斷中獲得了廣泛的重視和應(yīng)用。隨著雜交瘤技術(shù)、蛋白質(zhì)工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等技術(shù)的發(fā)展，抗體已逐步在疾病治療等應(yīng)用領(lǐng)域顯示出越來越廣闊的應(yīng)用前景。第五頁，共三十七頁，2022年，8月28日抗體

由B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白，它能識(shí)別抗原的某一特定位點(diǎn)?？贵w分子由兩個(gè)完全相同的重鏈分子以及兩個(gè)完全相同的輕鏈分子組成。存在于人或哺乳動(dòng)物的血清之中?？乖刚T導(dǎo)產(chǎn)生抗體的物質(zhì)。如前所述，抗體分子是免疫系統(tǒng)反應(yīng)的一個(gè)重要組分，因?yàn)榭贵w分子可以識(shí)別各種不同的外來抗原，同時(shí)可激活宿主的防衛(wèi)系統(tǒng)。對于一個(gè)免疫刺激（有毒物質(zhì)或病原物侵入，即抗原），每一個(gè)淋巴細(xì)胞都會(huì)合成并分泌一種單個(gè)的抗體，這些抗體可以高度特異地識(shí)別免疫抗原的特定區(qū)域，也就是抗原決定簇。由于一個(gè)抗原通常都有幾個(gè)不同的抗原決定簇，因此每個(gè)免疫淋巴細(xì)胞都可能產(chǎn)生一種針對某一個(gè)抗原決定簇的抗體，這些由同一抗原而產(chǎn)生的不同的抗體統(tǒng)稱為多克隆抗體。有毒物質(zhì)或病原物侵入，即抗原侵入抗體2抗體1第六頁，共三十七頁，2022年，8月28日于是，人們認(rèn)識(shí)到要把抗體應(yīng)用于臨床診斷或是治療，必須要制備單一類型的只對某一特定抗原決定簇的抗體分子，也就是單克隆抗體。多克隆抗體在一個(gè)血清樣品中包含了對同一抗原分子上不同抗原決定簇的多種抗體。單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的針對某一特定抗原決定簇的單一類型的抗體。第七頁，共三十七頁，2022年，8月28日補(bǔ)充內(nèi)容（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)步驟培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞一般可按以下步驟進(jìn)行：無菌取出目的細(xì)胞所在組織，用培養(yǎng)液漂洗干凈

以鋒利無菌刀具割舍多余部分，切成小組織塊

將小組織塊置解離液離散細(xì)胞。解離液含蛋白酶類，無鈣、鎂離子低速離心洗滌細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移培養(yǎng)瓶培養(yǎng)

第八頁，共三十七頁，2022年，8月28日一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基

1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境動(dòng)物細(xì)胞的生長、繁殖和代謝等生理性質(zhì)在很大程度上受到各種環(huán)境因素的影響。為了使動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)處于最佳狀態(tài)，了解環(huán)境因素對其影響無疑是很重要的，影響動(dòng)物細(xì)胞生長、繁殖的環(huán)境因素很多，主要有溫度、PH值、營養(yǎng)成分、溶氧、氣體環(huán)境、滲透壓以及其他因素。溫度細(xì)胞在體外生存的基本條件之一，來源不同的動(dòng)物細(xì)胞，其最適的生長溫度是不盡相同的，例如昆蟲細(xì)胞的最適溫度是25-28℃，人和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞的最適溫度是37℃.細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比，高于最適溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝和生長將會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致死亡?？偟膩碚f，動(dòng)物細(xì)胞對低溫的耐受力比對高溫的耐受力強(qiáng)，如溫度升至45℃時(shí)，1h內(nèi)人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞將被殺死；相反，降低細(xì)胞置于25-35℃時(shí)，細(xì)胞仍能生長，但速度減慢，并維持長時(shí)間不死，甚至于放在4℃，數(shù)小時(shí)后再置于37℃培養(yǎng)，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長。第九頁，共三十七頁，2022年，8月28日PH值

合適的PH值是細(xì)胞生存的必要的條件之一。動(dòng)物細(xì)胞合適的PH值一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6時(shí)都對細(xì)胞產(chǎn)生不利的影響，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞退變或死亡。不同的細(xì)胞對PH值也有不同的要求，原代培養(yǎng)細(xì)胞對PH值的變化耐受性差，傳代細(xì)胞對PH值變化的耐受性較強(qiáng)。而對于同一種細(xì)胞，增長期和維持期的最適PH也不盡相同，對于大多數(shù)細(xì)胞來說，偏堿性環(huán)境比酸性環(huán)境更有利于細(xì)胞的生長。營養(yǎng)成分

細(xì)胞的生長、繁殖以及產(chǎn)物的合成都必須從環(huán)境中攝取各種營養(yǎng)物質(zhì)，以合成細(xì)胞物質(zhì)及在新陳代謝中起調(diào)節(jié)作用。這些營養(yǎng)物質(zhì)包括碳源、氮源、氨基酸、無機(jī)鹽、微量元素、生長因子等。溶氧及氣體環(huán)境（P205）滲透壓等其它因素（P205）第十頁，共三十七頁，2022年，8月28日1、影響動(dòng)物細(xì)胞生長、繁殖的環(huán)境因素有哪些？問題2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)合適的PH值為多少？2、培養(yǎng)基的組成

培養(yǎng)基是維持體外細(xì)胞生存和生長的基本溶液，是組織細(xì)胞培養(yǎng)最重要的條件。用于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基可以分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基兩大類。

天然培養(yǎng)基是使用最早、最為有效的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，它主要取自于動(dòng)物體液或從動(dòng)物組織分離提取而得，其優(yōu)點(diǎn)是營養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果良好；缺點(diǎn)是成分復(fù)雜、個(gè)體差異大、來源有限。

天然培養(yǎng)基的種類有很多，包括生物性液體（如血清）、組織浸出液（如胚胎浸出液）、凝固劑（如血漿）等。3、溶氧濃度過高過低對細(xì)胞生長有何影響？4、細(xì)胞代謝產(chǎn)物CO2對細(xì)胞生長有何作用？第十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日1、天然培養(yǎng)基有哪些？它有何優(yōu)缺點(diǎn)？問題2、血清和血漿分別如何取得？

血液組成：紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和血漿。高速離心，分三層：上層為血漿40%多。

血漿冷凍到-30度，離心，分層：上層為血清，下層為雜蛋白（少）。3、最廣泛使用的血清是什么動(dòng)物血清？它有何營養(yǎng)成分？第十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日血漿

組織浸出液血清

組織細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的天然培養(yǎng)基是血清，這是因?yàn)檠逯泻邪ù蠓肿拥牡鞍踪|(zhì)和核酸等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，對促進(jìn)細(xì)胞生長繁殖、粘附及中和某些物質(zhì)的毒性起著一定的作用。用于組織細(xì)胞培養(yǎng)的血清的種類很多，其來源主要?jiǎng)游?，有小牛血清、胎牛血清、馬血清、兔血清以及人血清等，最廣泛使用的是小牛血清和胎牛血清。優(yōu)質(zhì)的血清外觀應(yīng)為透明、無溶血、淡黃色、無沉淀物。

血漿不僅可用來支持培養(yǎng)組織塊，而且還供給細(xì)胞生物匠營養(yǎng)物質(zhì)，但由于血漿很容易發(fā)生液人經(jīng)，目前已很少單獨(dú)使用。一般使用的是禽類血漿。

組織浸出液常用的是胚胎浸出液（如雞胚浸出液），它的主要成分含有大分子核蛋白和小分子的氨基酸，有促進(jìn)細(xì)胞生長的作用。第十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日水解乳蛋白

水解乳蛋白是常用的一種天然培養(yǎng)基，是由乳白蛋白經(jīng)水解而制得，氨基酸的含量較高。一般配制成0.5%的溶液，或與合成培養(yǎng)基以1：1共同使用。

合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)對細(xì)胞體內(nèi)生存環(huán)境中各種已知物質(zhì)在體外人工條件的模擬，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選、強(qiáng)化和重新組合后形成的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基在很多方面有天然培養(yǎng)基所無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，它既能經(jīng)細(xì)胞提供一個(gè)近似于體內(nèi)的生存環(huán)境，又便于控制和提供標(biāo)準(zhǔn)化體外生存環(huán)境。

目前所有的細(xì)胞培養(yǎng)都已采用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、組成和含量都相對固定的各種合成培養(yǎng)基，并已有配制好的干粉型商品。盡管現(xiàn)在的合成培養(yǎng)基成分和含量已經(jīng)較為復(fù)雜，但仍然不能完全滿足體外培養(yǎng)細(xì)胞生長的需要，合成培養(yǎng)基中還是需要加入一定量的天然培養(yǎng)基予以補(bǔ)充。合成培養(yǎng)基中一般都有哪些營養(yǎng)成分？問題第十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日3、常用的合成培養(yǎng)基

目前合成培養(yǎng)基的種類已有數(shù)十種，大多數(shù)培養(yǎng)基都是為適應(yīng)某種組織細(xì)胞的生長而在某種合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良而來的。目前較為常用的有199培養(yǎng)液、Eagle(MEM、DMEM)培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、HAM培養(yǎng)液等。表11-2為常用的培養(yǎng)基的成分和配方。1、目前較常用的合成培養(yǎng)基有哪些？問題2、為什么在要求較高的基礎(chǔ)性研究中要用無血清培養(yǎng)液？3、無血清培養(yǎng)液由哪兩部分組成？P208第十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日表11-4微生物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞性質(zhì)的比較性質(zhì)微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞大小1-10μm10-100μm代謝調(diào)節(jié)方式內(nèi)部內(nèi)部和激素營養(yǎng)要求寬松，可利用多種底物苛刻生長速率倍增時(shí)間一般為0.5-2h倍增時(shí)間一般為12-60h機(jī)械強(qiáng)度較好很差，缺乏保護(hù)性細(xì)胞壁環(huán)境適應(yīng)好差

二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法

所謂動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是將動(dòng)物組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，給予必要的生長條件，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長和繁殖。表11-4，表11-5是微生物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞性質(zhì)和培養(yǎng)方法的比較。第十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日表11-5微生物和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法的比較微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞PH控制添加酸、堿CO2-HCO3緩沖液攪拌速度速度快、范圍廣較慢溶氧控制改變攪拌速度、通氣量、進(jìn)氣氧濃度改變進(jìn)入氣體的氧濃度培養(yǎng)基滅菌方法高溫蒸煮過濾培養(yǎng)時(shí)間幾小時(shí)—幾天幾天—3、4周對水純度的要求較低很高

與微生物細(xì)胞培養(yǎng)類似，動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)有兩種類型：一類是非貼壁依賴性細(xì)胞，這類細(xì)胞可以采用與微生物培養(yǎng)類似的方法進(jìn)行懸浮培養(yǎng)；另一類是貼壁依賴性細(xì)胞，它們需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面上生長。第十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日1、懸浮培養(yǎng)P2091、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)有哪三種類型？提問1、懸浮培養(yǎng)是用培養(yǎng)哪一類細(xì)胞的？問題2、懸浮培養(yǎng)有何優(yōu)缺點(diǎn)？2、貼壁培養(yǎng)

貼壁指必須貼附在固體介質(zhì)表面上生長的細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)，主要用于非淋巴組織和許多單倍體等貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)。由于大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于貼壁依賴性細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一種重要方法。第十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日在貼壁培養(yǎng)過程中，貼壁依賴性細(xì)胞需要附著在帶適量正電荷或半固體的表面上，原來是圓形的細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展開來，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。一般可在數(shù)天后鋪滿生長表面，形成致密的細(xì)胞單層。在貼壁培養(yǎng)依賴性細(xì)胞中，請比較滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng)和微載體培養(yǎng)系統(tǒng)？問題細(xì)胞貼壁一般分為貼壁因子吸附于培養(yǎng)表面、細(xì)胞與表面接觸、細(xì)胞貼壁于培養(yǎng)表面和貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)表面上擴(kuò)展等幾個(gè)步驟。圖11-1為細(xì)胞在培養(yǎng)表面貼壁過程示意圖。第十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日3、固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)是既適用于貼壁依賴性細(xì)胞，又適用于非貼壁依賴性細(xì)胞的包埋培養(yǎng)方式，具有細(xì)胞生長密度高、抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。由于所培養(yǎng)的細(xì)胞的不同，固定化培養(yǎng)的方式也有不同，一般對于貼壁依賴性細(xì)胞通常采用膠原包埋，而對于非貼壁依賴性細(xì)胞則常用海藻酸鈣包埋。常用的細(xì)胞固定化的方法主要有吸附、共價(jià)貼附、離子/共價(jià)交聯(lián)、包埋和微囊化等。第二十頁，共三十七頁，2022年，8月28日三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器

自70年代以來，用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生長反應(yīng)器有了很大的發(fā)展，種類越來越多，規(guī)模也越來越大。根據(jù)生物反應(yīng)器的不同用途，有懸浮培養(yǎng)用、貼壁培養(yǎng)用、包埋培養(yǎng)用生物反應(yīng)器等，其種類大致上有塑料增殖器、填充床增殖器、多層板增殖器、螺旋增殖器、管式螺旋增殖器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀增殖器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其他膜式反應(yīng)器、槳式攪拌反應(yīng)器、棒式攪拌反應(yīng)器、船舶推進(jìn)槳反應(yīng)器、傾斜槳葉攪拌反應(yīng)器、般帆形攪拌反應(yīng)器、往復(fù)振動(dòng)錐孔篩板攪拌反應(yīng)器、籠式通氣攪拌反應(yīng)器、雙層籠式通氣攪拌反應(yīng)器、空氣提升式反應(yīng)器等。1、氣升式細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器的基本原理如圖11-2所示。氣體混合物從底部的噴射管進(jìn)入反應(yīng)器的中央導(dǎo)流管使得中央導(dǎo)流管側(cè)的液體密度低于外部區(qū)域從而形成循環(huán)。氣升式生物反應(yīng)器主要采用內(nèi)循環(huán)式，但也有采用外循環(huán)式。第二十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日與攪拌式生長反應(yīng)器相比，氣升式生物反應(yīng)器產(chǎn)生的湍流溫和而均勻，剪切力相當(dāng)小，反應(yīng)器內(nèi)沒有機(jī)械運(yùn)動(dòng)部件，因而細(xì)胞損傷率比較低；同時(shí)由于采用直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高；液體循環(huán)量大，能使細(xì)胞和營養(yǎng)成分均勻地分布于培養(yǎng)基中。

表11-9列出了八種細(xì)胞的有關(guān)培養(yǎng)數(shù)據(jù)，可以看出同傳統(tǒng)的方法（培養(yǎng)瓶和滾瓶）相比，氣升反應(yīng)器的抗體產(chǎn)量平均提高4.6倍。在氣升式生物反應(yīng)器中，溶氧的控制可以通過自動(dòng)調(diào)節(jié)進(jìn)入空氣的速率來實(shí)現(xiàn)；PH值可通過在進(jìn)氣中加入二氧化碳或加入氫氧化鈉來控制。優(yōu)點(diǎn)請畫出氣升式反應(yīng)器的簡圖，并說說溶氧濃度和PH值是如何控制的？問題第二十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日表11-9氣升式反應(yīng)器和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的抗體產(chǎn)率比較

細(xì)胞系抗體類型抗體產(chǎn)量，mm/l氣升式/傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶滾瓶氣升式1IgG1420865.12IgM701272953.03IgG910737.74IgG28301003.45IgG60762603.86IgM20251125.07IgG30382005.98IgG1201003503.2第二十三頁，共三十七頁，2022年，8月28日圖11-3中空纖維反應(yīng)器示意圖細(xì)胞培養(yǎng)基入口培養(yǎng)基出口2、中空纖維管生物反應(yīng)器中空纖維管生物反應(yīng)器如圖11-3所示，它的用途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長的細(xì)胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞，細(xì)胞的密度最高可達(dá)109/ml數(shù)量級(jí)。如果控制系統(tǒng)不受污染，能長期運(yùn)轉(zhuǎn)。已用這種反應(yīng)器培養(yǎng)過的細(xì)胞型和生產(chǎn)的分泌產(chǎn)物如表11-10所示。生長的細(xì)胞型雜交瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、乳腺組織細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、垂體腫瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞、BHK-2細(xì)胞、肺細(xì)胞等分泌的產(chǎn)物IgG、IgM、IgA、干擾素、激素、尿激酶、蛋白質(zhì)C、病毒蛋白、乙型肝炎表面抗原、T抑制因子、促細(xì)胞生長素、白細(xì)胞介素等空氣與CO2出口空氣與CO2入口第二十四頁，共三十七頁，2022年，8月28日

中空纖維管生物反應(yīng)器已進(jìn)入工業(yè)生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。（重點(diǎn)掌握）3、通氣攪拌反應(yīng)器通氣攪拌反應(yīng)器有哪些型式？問題第二十五頁，共三十七頁，2022年，8月28日4、流化床生物反應(yīng)器流化床生物反應(yīng)器的基本原理類似于流態(tài)床化學(xué)反應(yīng)器，不同的是，流態(tài)化的固體是帶有細(xì)胞的微粒。培養(yǎng)液通過反應(yīng)器垂直向上循環(huán)流動(dòng)不斷提供給細(xì)胞必要的營養(yǎng)成分，使細(xì)胞得以在微粒中生長；同時(shí)，不斷地加入新鮮的培養(yǎng)液，并不斷地排除培養(yǎng)產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物。圖11-7為生產(chǎn)用CF-IMMOTM流化床生物反應(yīng)器的示意圖，這種反應(yīng)器的傳質(zhì)性能很好，并在循環(huán)系統(tǒng)中采用膜氣體交換器，能快速提供給高密度細(xì)胞所需的氧，同時(shí)排除代謝產(chǎn)物；反應(yīng)器中的液體流速足以使細(xì)胞微粒懸浮卻不會(huì)損壞脆弱的細(xì)胞。由于流化床生物反應(yīng)器滿足了高密度細(xì)胞培養(yǎng)、使高產(chǎn)量細(xì)胞長時(shí)間停留在所應(yīng)器中、優(yōu)化細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成的環(huán)境等細(xì)胞培養(yǎng)的要求，流化床生物反應(yīng)器既可用于貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)。表11-11為流化床生物反應(yīng)器達(dá)到的細(xì)胞密度。氣體交換氧氣回流收獲營養(yǎng)液泵反應(yīng)塔加熱器PH傳感器TDOCO2圖11-7生產(chǎn)用CF-IMMOTM流化床生物反應(yīng)器示意圖第二十六頁，共三十七頁，2022年，8月28日5、無泡沫攪拌生物反應(yīng)器（了解）表11-11流化床生物反應(yīng)器與其它方法培養(yǎng)達(dá)到的細(xì)胞比較培養(yǎng)類型細(xì)胞類型細(xì)胞密度（個(gè)/ml）流化床雜交瘤0.3*108貼壁依賴性細(xì)胞1.3*108恒化器雜交瘤2*106微載體攪拌釜貼壁依賴性細(xì)胞0.2*107-2*107第二十七頁，共三十七頁，2022年，8月28日四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

動(dòng)物細(xì)胞無論是貼壁培養(yǎng)或是懸浮培養(yǎng)，均可分為分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式等多種培養(yǎng)方式。1、分批式培養(yǎng)定義

分批式培養(yǎng)是指先將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長，同時(shí)產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，終止培養(yǎng)。

在細(xì)胞分批培養(yǎng)過程中，不向培養(yǎng)系統(tǒng)補(bǔ)加營養(yǎng)物質(zhì)，而只向培養(yǎng)基通入氧，能夠控制的參數(shù)只有PH、溫度和通氣量，因此細(xì)胞所處的生長環(huán)境隨著營養(yǎng)物的消耗和產(chǎn)物、副產(chǎn)物的積累時(shí)刻都在發(fā)生變化，不能使細(xì)胞自始至終處于最優(yōu)的條件下，因而分批培養(yǎng)并不是一種很好的培養(yǎng)方式。分批培養(yǎng)過程的持征如圖11-8所示。0時(shí)間分批圖11-8分批式培養(yǎng)過程的特征營養(yǎng)物廢產(chǎn)物PH、溫度、DO第二十八頁，共三十七頁，2022年，8月28日0培養(yǎng)時(shí)間（d）細(xì)胞密度圖11-9分批式培養(yǎng)的生長曲線對數(shù)生長期減速期平穩(wěn)期衰退期延滯期為什么說采用分批式培養(yǎng)細(xì)胞效果不佳？問題

細(xì)胞分批式培養(yǎng)的生長曲線如圖11-9所示。在分批式培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的生長可分為延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期等五個(gè)階段。第二十九頁，共三十七頁，2022年，8月28日2、流加式培養(yǎng)（補(bǔ)料分批式）定義

流加式培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜的條件下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物不斷形成，而在此過程中隨著營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，不斷地向系統(tǒng)中補(bǔ)充新的營養(yǎng)成分，使細(xì)胞進(jìn)一步生長代謝，直到整個(gè)培養(yǎng)結(jié)束后取出產(chǎn)物。

流加式培養(yǎng)只是向培養(yǎng)系統(tǒng)補(bǔ)加必要的營養(yǎng)成分，以維持營養(yǎng)物質(zhì)的濃度不變。由于流加式培養(yǎng)能控制更多的環(huán)境參數(shù)（），使得細(xì)胞生長和產(chǎn)物生成容易維持在優(yōu)化狀態(tài)。流加式培養(yǎng)有何特點(diǎn)？（P219）問題0時(shí)間流加圖11-11流加式培養(yǎng)過程的特征PH、溫度、DO廢產(chǎn)物營養(yǎng)物第三十頁，共三十七頁，2022年，8月28日

根據(jù)流加控制方式不同，有兩種流加式培養(yǎng)方式：無反饋控制流加和有反饋控制流加。無反饋控制流加包括定流量加和間斷流加等；有反饋控制流加一般是連續(xù)或間斷地測定系統(tǒng)中限制性營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，并以此為控制指標(biāo)來調(diào)節(jié)流加速率或流加液中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度等。3、半連續(xù)式培養(yǎng)

半連續(xù)式培養(yǎng)又可稱為反復(fù)分批式培養(yǎng)，是指在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并重新補(bǔ)充加入等量的新鮮培養(yǎng)基，從而使反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變的培養(yǎng)方式。定義第三十一頁，共三十七頁，2022年，8月28日4、連續(xù)式培養(yǎng)

連續(xù)式培養(yǎng)是指將細(xì)胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮的培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)器液連續(xù)不斷地取出，使反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。定義

與分批式培養(yǎng)和半連續(xù)式培養(yǎng)不同，連續(xù)式培養(yǎng)可以保持細(xì)胞所處的環(huán)境條件長時(shí)間地穩(wěn)定，可以使細(xì)胞維持在優(yōu)化的狀態(tài)下，促進(jìn)細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的形成。由于連續(xù)式培養(yǎng)過程中連續(xù)不斷地收獲產(chǎn)物，并能提高細(xì)胞密度，在生產(chǎn)上已被應(yīng)用于培養(yǎng)非貼壁依賴性細(xì)胞。請比較半連續(xù)式培養(yǎng)和連續(xù)式培養(yǎng)？問題第三十二頁，共三十七頁，2022年，8月28日圖11-14細(xì)胞灌注培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)例液位控制細(xì)胞懸液細(xì)胞新鮮培養(yǎng)基收液過濾器細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

動(dòng)物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)一般是采用灌注培養(yǎng)。灌注培養(yǎng)是把細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面連續(xù)向反應(yīng)器中注入新鮮的培養(yǎng)基，同時(shí)又連續(xù)不斷地取出等量的培養(yǎng)液，但是過程中不取出細(xì)胞，細(xì)胞仍留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種營養(yǎng)不斷的狀態(tài)。當(dāng)高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，必須確保補(bǔ)充給細(xì)胞以足夠的營養(yǎng)以及除去有素毒的代謝物。灌注培養(yǎng)時(shí)用新鮮的培養(yǎng)液進(jìn)行灌