《原生質體融合育種》課件

第一節(jié)微生物原生質體育種原生質體：1953年首次用巨大芽孢桿菌制備成功1955年發(fā)現(xiàn)再生方法第一節(jié)微生物原生質體育種原生質體：1微生物原生質體的特點：對滲透壓特別敏感對誘變劑的誘變效應更敏感失去對噬菌體的敏感性不受感受態(tài)的影響微生物原生質體的特點：2第一節(jié)微生物原生質體育種一、原生質體再生育種二、

誘變育種三、

轉化育種四、

融合育種五、其他微生物原生質體育種第一節(jié)微生物原生質體育種一、原生質體再生育種3一、原生質體再生育種

~：微生物制備原生質體后直接再生，從再生菌落中分離篩選變異株，最終得到優(yōu)良性狀提高的正變菌株一、原生質體再生育種4原生質體再生育種正變率高于常規(guī)育種？制備和再生過程中相關因素微生物組成和結構改變一般選用對數(shù)期細胞制備原生質體不需要加遺傳標記原生質體再生育種正變率高于常規(guī)育種？5第一節(jié)微生物原生質體育種一、原生質體再生育種出發(fā)菌株選擇菌種活化和預培養(yǎng)原生質體制備原生質體再生高產菌株分離第一節(jié)微生物原生質體育種一、原生質體再生育種出發(fā)菌株選擇6二、原生質體誘變育種微生物制備原生質體后誘變處理，分離到再生培養(yǎng)基中再生，從再生菌落中分離篩選高產正變菌株二、原生質體誘變育種7二、原生質體誘變育種操作：物理誘變劑化學誘變劑特點：操作繁瑣、技術要求高再生時間長、容易染菌

P223擴展青霉PF-868原生質體誘變二、原生質體誘變育種8第一節(jié)微生物原生質體育種三、原生質體轉化育種何種形式DNA轉化率高？質粒第一節(jié)微生物原生質體育種三、原生質體轉化育種9第一節(jié)微生物原生質體育種五、其他微生物原生質體育種脂質體轉移原生質體轉染等第一節(jié)微生物原生質體育種五、其他微生物原生質體育種10第二節(jié)微生物原生質體融合育種微生物原生質體融合育種：

通過人為方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質體發(fā)生融合，并產生重組子的過程。

聚乙二醇誘導電場誘導第二節(jié)微生物原生質體融合育種微生物原生質體融合育種：11微生物原生質體融合育種的優(yōu)點？1、大幅度提高親本間重組頻率2、擴大重組的親本范圍3、集中雙親本優(yōu)良性狀機會更大微生物原生質體融合育種的優(yōu)點？12第二節(jié)微生物原生質體融合育種微生物原生質體融合育種程序（見圖9.2）

第二節(jié)微生物原生質體融合育種微生物原生質體融合1314

原生質體融合技術的一般步驟融合親本的選擇與標記；原生質體的制備；原生質體的融合；原生質體的再生；融合子的選擇與鑒定；目標菌株的篩選。14原生質體融合技術的一般步驟融合親本的選擇與標記；14一、直接親本及其遺傳標記的選擇

1.營養(yǎng)缺陷型、抗性標記、熱致死孢子顏色、菌落形態(tài)等注意：多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株會影響代謝產物的產量

2.常把一方滅活后再融合

3.可用不同熒光標記直接親本一、直接親本及其遺傳標記的選擇153.可用不同熒光標記直接親本提取擬南芥葉片的原生質體，并轉化帶有GFP標簽的目的蛋白表達載體，瞬時表達觀察目的蛋白在亞細胞中的定位情況紅色為葉綠體自發(fā)熒光綠色為GFP的熒光。3.可用不同熒光標記直接親本提取擬南芥葉片的原16二、原生質體制備與再生制備過程：分離、收集、純化、活性鑒定、保存去壁方法：1.機械法2.非酶分離法3.酶法酶法分離原生質體：參考圖9.3二、原生質體制備與再生17第二節(jié)微生物原生質體融合育種酶法分離原生質體的影響因素？（1）培養(yǎng)基組成放線菌加入亞適量甘氨酸黑曲霉第二節(jié)微生物原生質體融合育種酶法分離原生質體的影響因素？18第二節(jié)微生物原生質體融合育種酶法分離原生質體的影響因素？（2）菌體培養(yǎng)方式：1.平板玻璃紙法：絲狀菌2.振蕩沉沒培養(yǎng)法細菌和酵母菌第二節(jié)微生物原生質體融合育種酶法分離原生質體的影響因素？19酶法分離原生質體的影響因素？（3）菌體年齡絲狀真菌菌絲體尖端細胞放線菌對數(shù)期到靜止期細菌對數(shù)期酵母菌菌體同步化酶法分離原生質體的影響因素？20酶法分離原生質體的影響因素？（4）穩(wěn)定劑高滲溶液無機鹽：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2有機物：蔗糖、甘露醇、山梨醇絲狀真菌無機鹽細菌蔗糖、氯化鈉穩(wěn)定劑常用濃度：0.3~1mol/L酶法分離原生質體的影響因素？21（５）酶解前的預處理加入某種物質，抑制或阻止細胞壁某種成分合成酵母菌、絲狀真菌巰基乙醇酵母菌EDTA放線菌甘氨酸細菌亞適量青霉素（５）酶解前的預處理22酶法分離原生質體的影響因素？（６）酶系和酶的濃度細菌、放線菌溶菌酶真菌蝸牛酶注意事項：酶法分離原生質體的影響因素？23酶法分離原生質體的影響因素？（７）酶的作用溫度和ｐＨ值酶的最適溫度、菌株生長最適溫度（８）菌體密度酶法分離原生質體的影響因素？24酶法分離原生質體的影響因素？（９）酶解方式使用培養(yǎng)皿分離效果好分離時保持良好的通氣條件、適當振蕩分離條件經試驗可確定如計算測定原生質體形成率酶法分離原生質體的影響因素？25第七節(jié)微生物原生質體融合育種如何計算測定原生質體形成率？原生質體形成率=（A-B）/A×100%細菌、酵母菌血球計數(shù)板計數(shù)法高滲再生培養(yǎng)基培養(yǎng)法霉菌、放線菌高滲再生培養(yǎng)基培養(yǎng)法第七節(jié)微生物原生質體融合育種如何計算測定原生質體形成率？26二、原生質體制備與再生２．原生質體的鑒定（１）低滲爆破法p233

（２）熒光染色法熒光增白劑熒光顯微鏡二、原生質體制備與再生27二、原生質體制備與再生３．原生質體的收集和純化（１）過濾法適于絲狀微生物（２）密度梯度離心法離心后，原生質體上浮（３）界面法離心后，原生質體在界面（４）漂浮法適于細胞較大的微生物二、原生質體制備與再生28二、原生質體制備與再生４．原生質體的活力測定（１）熒光素雙醋酸鹽染色法（２）酚藏花紅染色法（３）伊文思藍染色法二、原生質體制備與再生29二、原生質體制備與再生５．原生質體的保存液氮冷藏加入保護劑，如：二甲亞砜、甘油等二、原生質體制備與再生30二、原生質體制備與再生原生質體的再生：在高滲再生培養(yǎng)基上，原生質體重新合成細胞壁，恢復成完整細胞。參見p234圖9.4二、原生質體制備與再生311.原生質體再生的影響因素（ｐ234）菌體生理狀態(tài)穩(wěn)定劑酶濃度和作用時間再生培養(yǎng)基組成殘存菌體的分離；再生培養(yǎng)基上冷凝水原生質體密度、再生方法1.原生質體再生的影響因素（ｐ234）32二、原生質體制備與再生

２．再生率及其計算

p236目的：找出最佳的原生質體制備和再生條件再生頻率（%）=[（C-B）/（A-B）]×100%二、原生質體制備與再生33三、原生質體融合（一）原生質體融合過程P236（二）原生質體融合的影響因素１、融合劑２、溫度３、親株的親和力和原生質體的活性４、無機離子三、原生質體融合34（二）原生質體融合的影響因素１、融合劑化學融合劑：PEG不同微生物適合不同相對分子質量的

PEG

真菌4000-6000細菌1500-6000物理融合劑：電場、激光（二）原生質體融合的影響因素35（二）原生質體融合的影響因素１、融合劑電場融合的優(yōu)點：適于動植物、微生物細胞；融合頻率高可在顯微鏡下觀察（二）原生質體融合的影響因素36（二）原生質體融合的影響因素１、融合劑２、溫度20~30℃３、親株的親和力和原生質體的活性４、無機離子PEG介導融合鈣離子、鎂離子電場融合糖或糖醇（二）原生質體融合的影響因素37四、融合體再生復原：再生培養(yǎng)基細胞壁重建形成菌落P239圖9.8四、融合體再生38四、融合體再生（二）融合體的檢出和分離利用營養(yǎng)缺陷型標記選擇融合體利用抗藥性用滅活原生質體利用熒光染色法雙親對碳源利用不同四、融合體再生39四、融合體再生（二）融合體的檢出和分離1.利用營養(yǎng)缺陷型標記選擇融合體雙親原生質體的融合體形成菌落親本不能在基本培養(yǎng)基上生長生產育種不常用，可用于遺傳研究四、融合體再生40（二）融合體的檢出和分離2.利用抗藥性選擇融合體營養(yǎng)缺陷型和抗藥性結合篩選P240（二）融合體的檢出和分離41（二）融合體的檢出和分離3.用滅活原生質體檢出融合體滅活方法：藥物紫外線溫度（二）融合體的檢出和分離42（二）融合體的檢出和分離4.利用熒光染色法親本分別帶上不同顏色熒光融合后直接根據熒光顏色選出融合體注意事項：（二）融合體的檢出和分離43四、融合體再生（二）融合體的檢出和分離觀察形態(tài)生化指標測定DNA含量：分光光度計四、融合體再生44五、融合重組體檢出與遺傳特性分析（一）重組體的檢出和鑒別方法1、直接法圖9.92、間接選擇法圖9.103、鈍化選擇法（滅活一方原生質體）五、融合重組體檢出與遺傳特性分析45五、融合重組體檢出與遺傳特性分析（二）融合率見表9.2五、融合重組體檢出與遺傳特性分析46五、融合重組體檢出與遺傳特性分析（三）DNA含量及孢子形態(tài)測定1、DNA含量測定2、單倍化3、酶活性及孢子體積測定4、分子生物學方法五、融合重組體檢出與遺傳特性分析47六、原生質體融合的應用1、提高產量或質量，合成新物質2、改良菌種遺傳特性3、優(yōu)化菌種發(fā)酵特性4、質粒轉移5、原生質體與細胞核融合6、進行遺傳分析六、原生質體融合的應用48第三節(jié)細菌原生質體融合育種細菌細胞壁如何降解？P247

第三節(jié)細菌原生質體融合育種49第三節(jié)細菌原生質體融合育種

1.如何提高細菌原生質體制備率和再生率？（1）預處理：目的改變細胞壁的性質（2）溶菌酶：（3）細菌生理狀態(tài)：對數(shù)期（4）培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件：第三節(jié)細菌原生質體融合育種50第三節(jié)細菌原生質體融合育種

2.建立最佳融合體系PEG相對分子質量：4000~6000濃度：40%~50%融合時間：30min第三節(jié)細菌原生質體融合育種51第三節(jié)細菌原生質體融合育種（三）操作方法p251斜面活化兩代液體振蕩培養(yǎng)第三節(jié)細菌原生質體融合育種52第四節(jié)放線菌原生質體融合育種（二）菌體培養(yǎng)及預處理水解酶：溶菌酶預處理：加甘氨酸第四節(jié)放線菌原生質體融合育種53第五節(jié)酵母菌原生質體融合育種一、酵母細胞壁結構和遺傳標記菌齡對原生質體形成影響大親本滅火的方法：紫外線熱藥物第五節(jié)酵母菌原生質體融合育種54第五節(jié)酵母菌原生質體融合育種一、酵母原生質體制備p259預處理：EDTA；巰基乙醇蝸牛酶第五節(jié)酵母菌原生質體融合育種55第六節(jié)霉菌原生質體融合育種二、培養(yǎng)基及相關溶液p262（1）查氏培養(yǎng)基的作用：菌絲生長（3）酶液的制備：第六節(jié)霉菌原生質體融合育種56第六節(jié)霉菌原生質體融合育種三、霉菌原生質體融合的關鍵步驟p262（一）原生質體制備1、水解酶的選擇2、菌絲的制備：常用玻璃紙法第六節(jié)霉菌原生質體融合育種57第一節(jié)微生物原生質體育種原生質體：1953年首次用巨大芽孢桿菌制備成功1955年發(fā)現(xiàn)再生方法第一節(jié)微生物原生質體育種原生質體：58微生物原生質體的特點：對滲透壓特別敏感對誘變劑的誘變效應更敏感失去對噬菌體的敏感性不受感受態(tài)的影響微生物原生質體的特點：59第一節(jié)微生物原生質體育種一、原生質體再生育種二、

誘變育種三、

轉化育種四、

融合育種五、其他微生物原生質體育種第一節(jié)微生物原生質體育種一、原生質體再生育種60一、原生質體再生育種

~：微生物制備原生質體后直接再生，從再生菌落中分離篩選變異株，最終得到優(yōu)良性狀提高的正變菌株一、原生質體再生育種61原生質體再生育種正變率高于常規(guī)育種？制備和再生過程中相關因素微生物組成和結構改變一般選用對數(shù)期細胞制備原生質體不需要加遺傳標記原生質體再生育種正變率高于常規(guī)育種？62第一節(jié)微生物原生質體育種一、原生質體再生育種出發(fā)菌株選擇菌種活化和預培養(yǎng)原生質體制備原生質體再生高產菌株分離第一節(jié)微生物原生質體育種一、原生質體再生育種出發(fā)菌株選擇63二、原生質體誘變育種微生物制備原生質體后誘變處理，分離到再生培養(yǎng)基中再生，從再生菌落中分離篩選高產正變菌株二、原生質體誘變育種64二、原生質體誘變育種操作：物理誘變劑化學誘變劑特點：操作繁瑣、技術要求高再生時間長、容易染菌

P223擴展青霉PF-868原生質體誘變二、原生質體誘變育種65第一節(jié)微生物原生質體育種三、原生質體轉化育種何種形式DNA轉化率高？質粒第一節(jié)微生物原生質體育種三、原生質體轉化育種66第一節(jié)微生物原生質體育種五、其他微生物原生質體育種脂質體轉移原生質體轉染等第一節(jié)微生物原生質體育種五、其他微生物原生質體育種67第二節(jié)微生物原生質體融合育種微生物原生質體融合育種：

通過人為方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質體發(fā)生融合，并產生重組子的過程。

聚乙二醇誘導電場誘導第二節(jié)微生物原生質體融合育種微生物原生質體融合育種：68微生物原生質體融合育種的優(yōu)點？1、大幅度提高親本間重組頻率2、擴大重組的親本范圍3、集中雙親本優(yōu)良性狀機會更大微生物原生質體融合育種的優(yōu)點？69第二節(jié)微生物原生質體融合育種微生物原生質體融合育種程序（見圖9.2）

第二節(jié)微生物原生質體融合育種微生物原生質體融合7071

原生質體融合技術的一般步驟融合親本的選擇與標記；原生質體的制備；原生質體的融合；原生質體的再生；融合子的選擇與鑒定；目標菌株的篩選。14原生質體融合技術的一般步驟融合親本的選擇與標記；71一、直接親本及其遺傳標記的選擇

1.營養(yǎng)缺陷型、抗性標記、熱致死孢子顏色、菌落形態(tài)等注意：多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株會影響代謝產物的產量

2.常把一方滅活后再融合

3.可用不同熒光標記直接親本一、直接親本及其遺傳標記的選擇723.可用不同熒光標記直接親本提取擬南芥葉片的原生質體，并轉化帶有GFP標簽的目的蛋白表達載體，瞬時表達觀察目的蛋白在亞細胞中的定位情況紅色為葉綠體自發(fā)熒光綠色為GFP的熒光。3.可用不同熒光標記直接親本提取擬南芥葉片的原73二、原生質體制備與再生制備過程：分離、收集、純化、活性鑒定、保存去壁方法：1.機械法2.非酶分離法3.酶法酶法分離原生質體：參考圖9.3二、原生質體制備與再生74第二節(jié)微生物原生質體融合育種酶法分離原生質體的影響因素？（1）培養(yǎng)基組成放線菌加入亞適量甘氨酸黑曲霉第二節(jié)微生物原生質體融合育種酶法分離原生質體的影響因素？75第二節(jié)微生物原生質體融合育種酶法分離原生質體的影響因素？（2）菌體培養(yǎng)方式：1.平板玻璃紙法：絲狀菌2.振蕩沉沒培養(yǎng)法細菌和酵母菌第二節(jié)微生物原生質體融合育種酶法分離原生質體的影響因素？76酶法分離原生質體的影響因素？（3）菌體年齡絲狀真菌菌絲體尖端細胞放線菌對數(shù)期到靜止期細菌對數(shù)期酵母菌菌體同步化酶法分離原生質體的影響因素？77酶法分離原生質體的影響因素？（4）穩(wěn)定劑高滲溶液無機鹽：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2有機物：蔗糖、甘露醇、山梨醇絲狀真菌無機鹽細菌蔗糖、氯化鈉穩(wěn)定劑常用濃度：0.3~1mol/L酶法分離原生質體的影響因素？78（５）酶解前的預處理加入某種物質，抑制或阻止細胞壁某種成分合成酵母菌、絲狀真菌巰基乙醇酵母菌EDTA放線菌甘氨酸細菌亞適量青霉素（５）酶解前的預處理79酶法分離原生質體的影響因素？（６）酶系和酶的濃度細菌、放線菌溶菌酶真菌蝸牛酶注意事項：酶法分離原生質體的影響因素？80酶法分離原生質體的影響因素？（７）酶的作用溫度和ｐＨ值酶的最適溫度、菌株生長最適溫度（８）菌體密度酶法分離原生質體的影響因素？81酶法分離原生質體的影響因素？（９）酶解方式使用培養(yǎng)皿分離效果好分離時保持良好的通氣條件、適當振蕩分離條件經試驗可確定如計算測定原生質體形成率酶法分離原生質體的影響因素？82第七節(jié)微生物原生質體融合育種如何計算測定原生質體形成率？原生質體形成率=（A-B）/A×100%細菌、酵母菌血球計數(shù)板計數(shù)法高滲再生培養(yǎng)基培養(yǎng)法霉菌、放線菌高滲再生培養(yǎng)基培養(yǎng)法第七節(jié)微生物原生質體融合育種如何計算測定原生質體形成率？83二、原生質體制備與再生２．原生質體的鑒定（１）低滲爆破法p233

（２）熒光染色法熒光增白劑熒光顯微鏡二、原生質體制備與再生84二、原生質體制備與再生３．原生質體的收集和純化（１）過濾法適于絲狀微生物（２）密度梯度離心法離心后，原生質體上?。ǎ常┙缑娣x心后，原生質體在界面（４）漂浮法適于細胞較大的微生物二、原生質體制備與再生85二、原生質體制備與再生４．原生質體的活力測定（１）熒光素雙醋酸鹽染色法（２）酚藏花紅染色法（３）伊文思藍染色法二、原生質體制備與再生86二、原生質體制備與再生５．原生質體的保存液氮冷藏加入保護劑，如：二甲亞砜、甘油等二、原生質體制備與再生87二、原生質體制備與再生原生質體的再生：在高滲再生培養(yǎng)基上，原生質體重新合成細胞壁，恢復成完整細胞。參見p234圖9.4二、原生質體制備與再生881.原生質體再生的影響因素（ｐ234）菌體生理狀態(tài)穩(wěn)定劑酶濃度和作用時間再生培養(yǎng)基組成殘存菌體的分離；再生培養(yǎng)基上冷凝水原生質體密度、再生方法1.原生質體再生的影響因素（ｐ234）89二、原生質體制備與再生

２．再生率及其計算

p236目的：找出最佳的原生質體制備和再生條件再生頻率（%）=[（C-B）/（A-B）]×100%二、原生質體制備與再生90三、原生質體融合（一）原生質體融合過程P236（二）原生質體融合的影響因素１、融合劑２、溫度３、親株的親和力和原生質體的活性４、無機離子三、原生質體融合91（二）原生質體融合的影響因素１、融合劑化學融合劑：PEG不同微生物適合不同相對分子質量的

PEG

真菌4000-6000細菌1500-6000物理融合劑：電場、激光（二）原生質體融合的影響因素92（二）原生質體融合的影響因素１、融合劑電場融合的優(yōu)點：適于動植物、微生物細胞；融合頻率高可在顯微鏡下觀察（二）原生質體融合的影響因素93（二）原生質體融合的影響因素１、融合劑２、溫度20~30℃３、親株的親和力和原生質體的活性４、無機離子PEG介導融合鈣離子、鎂離子電場融合糖或糖醇（二）原生質體融合的影響因素94四、融合體再生復原：再生培養(yǎng)基細胞壁重建形成菌落P239圖9.8四、融合體再生95四、融合體再生（二）融合體的檢出和分離利用營養(yǎng)缺陷型標記選擇融合體利用抗藥性用滅活原生質體利用熒光染色法雙親對碳源利用不同四、融合體再生96四、融合體再生（二）融合體的檢出和分離1.利用營養(yǎng)缺陷型標記選擇融合體雙親原生質體的融合體形成菌落親本不能在基本培養(yǎng)基上生長生產育種不常用，可用于遺傳研究四、融合體再生97（二）融合體的檢出和分離2.利用抗藥性選擇融合體營養(yǎng)缺陷型和抗藥性結合篩選P240（二）融合體的檢出和分離98（二）融合體的檢出和分離3.用滅活原生質體檢出融合體滅活方法：藥物紫外線溫度（二）融合體的檢出和分離99（二）融合體的檢出和分離4.利用熒光染色法親本分別帶上不同顏色熒光融合后直接根據熒光顏色選出融合體注意事項：（二）融合體的檢出和分離100四、融合體再生（二）融合體的檢出和分離觀察形態(tài)生化指標測定DNA含量：分光光度計四、融合體再生101五、融合重組體檢出與遺傳特性分析（一）重組體的檢出和鑒別方法1、直接法圖9.92、間接選擇法圖9.103、鈍化選擇法（滅活一方原生