重組DNA技術(shù)與基因組學(xué)課件

第十七章重組DNA技術(shù)與基因組學(xué)

第一節(jié)DNA序列測定第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作原理第三節(jié)重組DNA技術(shù)的應(yīng)用第四節(jié)基因組學(xué)和蛋白組學(xué)及研究技術(shù)簡介第十七章重組DNA技術(shù)與基因組學(xué)

第一節(jié)DNA序DNA測序的基本策略

設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長度的成套DNA片段，各帶有標(biāo)記的片段起點(diǎn)相同、終點(diǎn)不同，使待測的DNA鏈中的相應(yīng)每個(gè)核苷酸處都有斷裂或終止。通過PAGE電泳，能夠?qū)⑾嗖钜粋€(gè)核苷酸的DNA片段分開，放射自顯影后，根據(jù)長短排列，根據(jù)特定末端堿基的DNA片段就可讀出待測DNA的堿基序列。

雙脫氧末端終止法

化學(xué)法

測序技術(shù)進(jìn)展+-MarkDNA測序的基本策略

設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長度的成套DNA測序的基本策略

設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長度的成套DNA片段，各帶有標(biāo)記的片段起點(diǎn)相同、終點(diǎn)不同，使待測的DNA鏈中的相應(yīng)每個(gè)核苷酸處都有斷裂或終止。通過高分辨率的電泳，能夠?qū)⑾嗖钜粋€(gè)核苷酸的DNA片段分開，根據(jù)DNA片段長短排列順序及其末端堿基就可讀出待測DNA的堿基序列。

雙脫氧末端終止法

化學(xué)法

測序技術(shù)進(jìn)展+-Mark有相同的起點(diǎn),不同終點(diǎn)的一套DNA片段示意圖電泳圖譜

DNA測序的基本策略

設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長度的成套D雙脫氧末端終止法測序原理酶反應(yīng)電泳方向模板CCGGTAGCAACT3′5′GG5′3′引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTACGTAGTTGCTACC3′5′TCAACGATGG5′3′讀出模板互補(bǔ)序列讀出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGC雙脫氧末端終止法測序原理酶反應(yīng)電泳方向模板CCGGTAGCA雙脫氧末端終止法（Sanger測序法）

讀出模板互補(bǔ)序列dNTP

凝膠電泳

較大片段

較小片段ddGTPddATPddCTPddTTP

反應(yīng)混合物Klenow酶

未知序列的單鏈DNA

讀出待測序列CTGACTTCGACAAAGAA5′3′

放射性標(biāo)記的引物TGTTACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3′5′CTGACTTCGACAA5′3′雙脫氧末端終止法（Sanger測序法）

讀出模板互補(bǔ)序列dDNA的測序儀示意圖computeranalysis凝膠中DNA移動方向樣品槽激光器輸入光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機(jī)旋光鏡/棱鏡組件DNA的測序儀示意圖computeranalysis凝膠中DNA的化學(xué)測序示意圖

反應(yīng)試劑G反應(yīng)：硫酸二甲酯G+A反應(yīng)：甲酸T+C反應(yīng)：肼C反應(yīng)：NaCl+肼DNA的化學(xué)測序示意圖反應(yīng)試劑測序技術(shù)進(jìn)展

同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記,平板電泳到毛細(xì)管電泳

多色熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳

單色熒光標(biāo)記平板電泳同位素標(biāo)記平板電泳ACGTACGT測序圖譜TA

TTGCATTGTC

TGCATTGT

C

T測序技術(shù)進(jìn)展

同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記,平板電泳到毛細(xì)管電泳

引物標(biāo)記法測序(DyePrimer)

一個(gè)樣本，4個(gè)反應(yīng)。4個(gè)反應(yīng)中引物序列相同，但分別標(biāo)記有不同顏色的熒光。+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)

反應(yīng)結(jié)束后，將4管反應(yīng)液混合，經(jīng)乙醇沉淀后上樣+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddGTP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddCTP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddTTP(terminator)引物標(biāo)記法測序(DyePrimer)

一個(gè)樣本，4個(gè)反應(yīng)。終止法測序(DyeTerminator)一個(gè)樣本，1個(gè)反應(yīng)。反應(yīng)中包含分別帶4色熒光標(biāo)記的ddNTP(終止子)unlabeledprimertemplateDNA+AmpliTaqFSdATP,dCTP,dGTP,dTTPddCTPddATPddGTPddTTP

測序反應(yīng)結(jié)束后，采用乙醇沉淀法進(jìn)行純化，除去過量的ddNTP后上樣。終止法測序(DyeTerminator)一個(gè)樣本，1個(gè)反應(yīng)第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作原理

重組DNA是基因工程的核心技術(shù)，即把DNA作為組件，在細(xì)胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，使外源基因DNA在宿主細(xì)胞中隨細(xì)胞的繁殖而增殖（cloning，克?。?，或最后得到表達(dá)，最終獲得基因表達(dá)產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀。一、DNA重組技術(shù)重要的工具酶二、重組DNA技術(shù)的基本操作原理返回第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作原理

重一、重組DNA的重要的工具酶1、限制性內(nèi)切酶2、DNA連接酶3、逆轉(zhuǎn)錄酶一、重組DNA的重要的工具酶1、限制性內(nèi)切酶常用的DNA限制性內(nèi)切酶的專一性酶辨認(rèn)的序列和切口特點(diǎn)‥‥AGCT‥‥‥‥TCGA‥‥‥‥GGATCC‥‥‥‥CCTAGG‥‥‥‥AGATCT‥‥‥‥TCTAGA‥‥‥‥GAATTC‥‥‥‥CTTAAG‥‥‥‥AAGCTT‥‥‥‥TTCGAA‥‥‥‥GTCGAC‥‥‥‥CAGCTG‥‥‥‥CCCGGG‥‥‥‥GGGCCC‥‥BamHIAluIBglIEcoRIHindⅢSalISmaI四核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口常用的DNA限制性內(nèi)切酶的專一性酶辨認(rèn)的序列和切口特點(diǎn)‥‥連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPTCPTTPPPGAPACPPPPOHGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'AGAACCTTG3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或反轉(zhuǎn)錄酶的三種催化功能

依賴RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依賴DNA的DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶的三種催化功能

依賴RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H重組DNA技術(shù)基本操作原理

ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmoleculeIntroductionintohostcellsbytransformationofviralinfectionHostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因的獲取

2、載體的構(gòu)建

3、目的基因與載體的重組

4、重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增

5、篩選克隆細(xì)胞重組DNA技術(shù)基本操作原理

ForeignDNAto目的基因的獲取1、建立DNA和cDNA文庫2、體外擴(kuò)增—PCR技術(shù)3、人工合成重組DNA技術(shù)路線—1目的基因的獲取1、建立DNA和cDNA文庫重組DNA技術(shù)路線基因文庫(DNAlibrary)

基因文庫是指整套由基因組DNA片段插入克隆載體獲得的分子克隆之總和。應(yīng)用DNA重組技術(shù)，可以將各種生物體全部基因組的遺傳信息，貯存在可以長期保存的穩(wěn)定重組體中，以備需要時(shí)應(yīng)用。好象將文獻(xiàn)資料貯存于圖書館一樣，所以稱其為genomiclibrary。

cDNA文庫（complementalDNAlibrary）

將細(xì)胞全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并被克隆的總和稱為cDNA文庫。基因文庫(DNAlibrary)

基因文庫基因文庫和cDNA文庫的建立可克隆之DNA載體DNAcDNAmRNA部分或完全酶解DNADNA長度分級甲基化，雙鏈接頭DNADNA與載體連接引入大腸桿菌鑒定文庫的滴度和特性擴(kuò)增后供長期儲存篩選出所需要的克隆組織基因文庫和cDNA文庫的建立可克隆之DNA載體DNAcDNADNA克隆的載體1、質(zhì)粒2、噬菌體3、動物病毒4、植物寄生菌重組DNA技術(shù)路線—2DNA克隆的載體1、質(zhì)粒重組DNA技術(shù)路線—2重組DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)1、轉(zhuǎn)化(transformation)：以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。2、轉(zhuǎn)染(Transfection

):以噬菌體或真核病毒為載體構(gòu)建的重組體依靠對細(xì)胞的感染功能導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。3、電穿孔法(electroporation):高壓脈沖電流使細(xì)胞產(chǎn)生臨時(shí)的通透性以吸收DNA。4、微注射法(microinjection):借助極細(xì)針管的幫助把DNA注射入細(xì)胞核的方法。重組DNA技術(shù)路線—4重組DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)1、轉(zhuǎn)化(transformation)：電穿孔法示意圖

細(xì)胞壁原生質(zhì)膜纖維素酶電穿孔細(xì)胞壁再生瞬間的開口外來的DNA插入外源DNA的植物細(xì)胞電穿孔法示意圖

細(xì)胞壁原生質(zhì)膜纖維素酶電穿孔細(xì)胞壁再生瞬間的pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

噬菌體感染大腸桿菌的途徑

噬菌體感染大腸桿菌的途徑

噬菌體突變型作為克隆載體DNA用限制性內(nèi)切酶除去中間一段與外源DNA連接重組載體的體外包裝帶有外源DNA的噬菌體太小不能被包裝噬菌體突變型作為克隆載體DNA用限制性內(nèi)切酶除去中間一段反轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期

RNA衣殼被膜逆轉(zhuǎn)錄酶整合入宿主細(xì)胞染色體DNA進(jìn)入細(xì)胞丟失被膜丟失衣殼逆轉(zhuǎn)錄RNAcDNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯RNA衣殼蛋白被膜蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期

RNA衣殼被膜逆轉(zhuǎn)錄酶整合入宿主細(xì)胞染植物冠癭瘤（其表達(dá)產(chǎn)物幫助T-DNA轉(zhuǎn)移和整合）鱆魚堿Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)編碼兩類酶：植物生長激素和細(xì)胞分裂素合成酶冠癭氨基酸或冠癭堿合成酶植物冠癭瘤（其表達(dá)產(chǎn)物幫助T-DNA轉(zhuǎn)移和整合）鱆魚堿Ti質(zhì)篩選克隆細(xì)胞

載體特征的直接篩選

菌落的原位雜交免疫學(xué)方法重組DNA技術(shù)路線—5篩選克隆細(xì)胞

載體特征的直接篩選重組DNA技術(shù)路線—5pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

如果外源DNA插入，氨卞青霉素原位雜交法篩選DNA重組體圖解用NaOH將菌體裂解，變性的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上雜交放射自顯影32P-cDNA與放射性cDNA雜交的菌落的斑點(diǎn)細(xì)菌菌落單鏈DNA結(jié)合到膜上將菌落復(fù)印至硝酸纖維素膜上原位雜交法篩選DNA重組體圖解用NaOH將菌體裂解，變性的D重組DNA表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)檢測32P-抗體裂解細(xì)胞，表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上與放射性抗體雜交的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)轉(zhuǎn)化到E.Coli細(xì)菌啟動子插入的真核DNA片段放射自顯影重組體重組DNA表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)檢測32P-抗體裂解細(xì)胞，表達(dá)蛋白Southern和Western印跡法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiographySouthern和Western印跡法DNA第三節(jié)重組DNA技術(shù)的應(yīng)用

一、產(chǎn)生新品種新選擇

轉(zhuǎn)基因動植物

構(gòu)建微生物工程菌基因藥物二、法醫(yī)學(xué)的強(qiáng)大武器—DNA指紋法三、基因診斷和治療第三節(jié)重組DNA技術(shù)的應(yīng)用

一、產(chǎn)生新品種新選擇胰島素原的人工合成

胰臟(A)n胰島素原mRNAcDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌mRNA反轉(zhuǎn)錄酶胰島素原基因與質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化E.coli胰島素原胰島素原的人工合成

胰臟(A)ncDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌mRTi質(zhì)粒為載體的植物基因工程

I二元載體系統(tǒng)II共整合載體IIIT-DNA的轉(zhuǎn)移與整合Ti輔助質(zhì)粒Ti輔助DNA給體質(zhì)粒Ti輔助DNA給體質(zhì)粒pBR型質(zhì)粒（給體質(zhì)粒）宿主特異性外源基因宿主特異性整合帶有外源基因的Ti質(zhì)粒植物DNATi質(zhì)粒轉(zhuǎn)移并插入植物DNATi質(zhì)粒為載體的植物基因工程

I二元載體系統(tǒng)IISouthern印跡法在DNA指紋法中的應(yīng)用1DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物2犯罪嫌疑人13現(xiàn)場證據(jù)4犯罪嫌疑人21234Southern印跡法圖譜Southern印跡法在DNA指紋法中的應(yīng)用1DNA分子量Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電第四節(jié)基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)

及研究技術(shù)簡介

攜帶有細(xì)胞或生物機(jī)體的一整套遺傳指令的核酸量稱為基因組(genome)，在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生的基因組學(xué)(genomics)是一門在整個(gè)細(xì)胞、整個(gè)物種的基因水平研究DNA順序、整個(gè)基因組成分和功能的科學(xué)。由一個(gè)基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)成分叫做蛋白質(zhì)組（proteome），從整體水平研究蛋白質(zhì)組的結(jié)構(gòu)和功能即為蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)。一、基因組文庫提供基因組特異的遺傳信息目錄二、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增特異性的DNA片段三、基因組測序提供最完善的基因文庫四、序列和結(jié)構(gòu)相關(guān)性提供蛋白質(zhì)功能的信息返回第四節(jié)基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)

及研究技術(shù)簡介

基因組文庫提供基因組特異的遺傳信息目錄

DNA文庫是是許多DNA克隆的集合，理論上基因組的所有DNA序列都能存在于基因組文庫中。使用分子雜交的方法，可以在文庫中找到先前已知的基因或順序的位置，亦可用生物信息學(xué)（Bioinformatics）方法找出基因并研究其功能。在基因組文庫中的已知順序(稱為標(biāo)簽順序位點(diǎn)，sequence-taggedsite,STS)能夠?yàn)榛蚪M測序提供界標(biāo)?；蚪M文庫提供基因組特異的遺傳信息目錄

D多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增特異性的DNA片段

人類基因組工程以及對各種基因組測序的研究，為人們提供了前所未有的了解基因信息的好機(jī)會。這些DNA順序信息又為簡化單個(gè)基因的克隆以便更詳細(xì)地進(jìn)行生物化學(xué)研究提供了條件。如果知道一個(gè)被克隆的DNA片段的側(cè)接順序，就能利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

(polymerasechainreaction,PCR)擴(kuò)增這個(gè)DNA片段，這樣擴(kuò)增的DNA片段能直接用作目的基因或用于生物化學(xué)與分子生物學(xué)分析過程。該技術(shù)是KaryMullis在1984年發(fā)明的，主要是根據(jù)DNA復(fù)制的基本原則，用于特定DNA片段的體外擴(kuò)增。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增特異性的DNA片段人類基因組工程以

PCR技術(shù)原理示意圖靶序列變性和引物復(fù)姓循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3變性和引物復(fù)性鏈延伸Tag酶鏈延伸PCR技術(shù)原理示意圖靶序列變性和引物復(fù)姓循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

末知序列的PCR擴(kuò)增；將逆轉(zhuǎn)錄與PCR相偶聯(lián)（RT-PCR）；

用于DNA的測序；用于基因定位誘變；用于合成特異探針；基因組序列的比較研究；

用于臨床診斷。PCR技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

末知序列的PCR擴(kuò)增；基因組測序提供最完善的基因文庫

人類基因組測序?qū)嵤┑某晒粌H僅是獲得生物學(xué)迅速發(fā)展的數(shù)據(jù)庫，而且改變了人類對自身的思維；人類基因組DNA只有1.1%-1.4%用于編碼蛋白質(zhì)，獨(dú)特的基因表達(dá)模式能使一個(gè)基因產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)，這是人類和其他脊椎動物比細(xì)菌、蠕蟲等簡單生物優(yōu)越的地方；在人類群體中大約有幾百萬個(gè)堿基的區(qū)別，即所謂單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)；這些微小的差異產(chǎn)生了人類個(gè)體的差異性。國際數(shù)據(jù)庫中大量的數(shù)據(jù)信息不斷增加，它們具有不可估量的價(jià)值。基因組測序提供最完善的基因文庫

人類基因組測序?qū)嵤┑某扇祟惢蚪M各種順序組成圖

轉(zhuǎn)座子（45%）其他基因間DNA（20.7%）長重復(fù)順序（5%）簡單重復(fù)順序(衛(wèi)星DNA,3%）轉(zhuǎn)錄成RNA分子順序(25%）編碼蛋白質(zhì)(1.1～1.4%)人類基因組各種順序組成圖

轉(zhuǎn)座子（45%）其他基因間DNA序列和結(jié)構(gòu)相關(guān)性提供蛋白質(zhì)功能的信息

利用“比較基因組學(xué)”研究方法，能通過基因組DNA同源序列比對確定基因的功能；在一些蛋白質(zhì)內(nèi)可以找出特殊結(jié)構(gòu)模序(motif)相關(guān)的DNA或氨基酸順序，可以幫助鑒定蛋白質(zhì)的分子功能；為了進(jìn)一步進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)相關(guān)性的蛋白質(zhì)的功能鑒定，可盡可能多的獲取還沒有現(xiàn)有功能信息的蛋白質(zhì)結(jié)晶，測定它們的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域，并將其納入結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，通過與數(shù)據(jù)庫中已知功能蛋白質(zhì)的模序比對來獲取這些未知蛋白質(zhì)的功能信息。序列和結(jié)構(gòu)相關(guān)性提供蛋白質(zhì)功能的信息

利用“比較基因組蛋白質(zhì)技術(shù)和核酸技術(shù)的相互增強(qiáng)插入表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞推導(dǎo)出AA順序制備合成肽制備對所編碼蛋白專一的抗體基因或cDNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)測定出AA順序合成cDNA探針制備專一的抗體沉淀核糖體分離mRNA用Southern印跡法篩選DNA文庫基因或cDNA蛋白質(zhì)技術(shù)和核酸技術(shù)的相互增強(qiáng)插入表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞推導(dǎo)出

DNA芯片(DNAchip)技術(shù)是采用寡核苷酸原位合成或顯微打印手段，將數(shù)以萬計(jì)的DNA探針片段有序地固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，反應(yīng)結(jié)果通過檢測雜交信號的方法（同位素法、化學(xué)熒光法、化學(xué)發(fā)光法或酶標(biāo)法）顯示，再用精密的掃描儀或CCD攝象技術(shù)記錄，通過計(jì)算機(jī)軟件分析，綜合成可讀的IC總信息，來實(shí)現(xiàn)對生物樣品的快速、并行、高效地檢測或診斷。芯片分析實(shí)際上也是傳感器分析的組合。芯片陣列中的每一個(gè)單元微點(diǎn)都是一個(gè)傳感器的探頭，所以傳感器技術(shù)的精髓往往都被用于芯片的發(fā)展。陣列檢測可以大大提高檢測效率，減少工作量，增加可比性，所以芯片技術(shù)也是傳感器技術(shù)的發(fā)展。DNA芯片技術(shù)簡介DNA芯片(DNAchip)技術(shù)是采用寡核DVA芯片工作示意圖emissionLaser1Laser2computeranalysisDNAclonestestreversetranscriptionLabelwithfluordyesPCRamplificationpurficationhybridizetargettomicroarrayroboticprintingreferenceDVA芯片工作示意圖emissionLaser1Laser第十七章重組DNA技術(shù)與基因組學(xué)

第一節(jié)DNA序列測定第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作原理第三節(jié)重組DNA技術(shù)的應(yīng)用第四節(jié)基因組學(xué)和蛋白組學(xué)及研究技術(shù)簡介第十七章重組DNA技術(shù)與基因組學(xué)

第一節(jié)DNA序DNA測序的基本策略

設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長度的成套DNA片段，各帶有標(biāo)記的片段起點(diǎn)相同、終點(diǎn)不同，使待測的DNA鏈中的相應(yīng)每個(gè)核苷酸處都有斷裂或終止。通過PAGE電泳，能夠?qū)⑾嗖钜粋€(gè)核苷酸的DNA片段分開，放射自顯影后，根據(jù)長短排列，根據(jù)特定末端堿基的DNA片段就可讀出待測DNA的堿基序列。

雙脫氧末端終止法

化學(xué)法

測序技術(shù)進(jìn)展+-MarkDNA測序的基本策略

設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長度的成套DNA測序的基本策略

設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長度的成套DNA片段，各帶有標(biāo)記的片段起點(diǎn)相同、終點(diǎn)不同，使待測的DNA鏈中的相應(yīng)每個(gè)核苷酸處都有斷裂或終止。通過高分辨率的電泳，能夠?qū)⑾嗖钜粋€(gè)核苷酸的DNA片段分開，根據(jù)DNA片段長短排列順序及其末端堿基就可讀出待測DNA的堿基序列。

雙脫氧末端終止法

化學(xué)法

測序技術(shù)進(jìn)展+-Mark有相同的起點(diǎn),不同終點(diǎn)的一套DNA片段示意圖電泳圖譜

DNA測序的基本策略

設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長度的成套D雙脫氧末端終止法測序原理酶反應(yīng)電泳方向模板CCGGTAGCAACT3′5′GG5′3′引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTACGTAGTTGCTACC3′5′TCAACGATGG5′3′讀出模板互補(bǔ)序列讀出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGC雙脫氧末端終止法測序原理酶反應(yīng)電泳方向模板CCGGTAGCA雙脫氧末端終止法（Sanger測序法）

讀出模板互補(bǔ)序列dNTP

凝膠電泳

較大片段

較小片段ddGTPddATPddCTPddTTP

反應(yīng)混合物Klenow酶

未知序列的單鏈DNA

讀出待測序列CTGACTTCGACAAAGAA5′3′

放射性標(biāo)記的引物TGTTACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3′5′CTGACTTCGACAA5′3′雙脫氧末端終止法（Sanger測序法）

讀出模板互補(bǔ)序列dDNA的測序儀示意圖computeranalysis凝膠中DNA移動方向樣品槽激光器輸入光學(xué)系統(tǒng)成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機(jī)旋光鏡/棱鏡組件DNA的測序儀示意圖computeranalysis凝膠中DNA的化學(xué)測序示意圖

反應(yīng)試劑G反應(yīng)：硫酸二甲酯G+A反應(yīng)：甲酸T+C反應(yīng)：肼C反應(yīng)：NaCl+肼DNA的化學(xué)測序示意圖反應(yīng)試劑測序技術(shù)進(jìn)展

同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記,平板電泳到毛細(xì)管電泳

多色熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳

單色熒光標(biāo)記平板電泳同位素標(biāo)記平板電泳ACGTACGT測序圖譜TA

TTGCATTGTC

TGCATTGT

C

T測序技術(shù)進(jìn)展

同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記,平板電泳到毛細(xì)管電泳

引物標(biāo)記法測序(DyePrimer)

一個(gè)樣本，4個(gè)反應(yīng)。4個(gè)反應(yīng)中引物序列相同，但分別標(biāo)記有不同顏色的熒光。+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)

反應(yīng)結(jié)束后，將4管反應(yīng)液混合，經(jīng)乙醇沉淀后上樣+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddGTP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddCTP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddTTP(terminator)引物標(biāo)記法測序(DyePrimer)

一個(gè)樣本，4個(gè)反應(yīng)。終止法測序(DyeTerminator)一個(gè)樣本，1個(gè)反應(yīng)。反應(yīng)中包含分別帶4色熒光標(biāo)記的ddNTP(終止子)unlabeledprimertemplateDNA+AmpliTaqFSdATP,dCTP,dGTP,dTTPddCTPddATPddGTPddTTP

測序反應(yīng)結(jié)束后，采用乙醇沉淀法進(jìn)行純化，除去過量的ddNTP后上樣。終止法測序(DyeTerminator)一個(gè)樣本，1個(gè)反應(yīng)第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作原理

重組DNA是基因工程的核心技術(shù)，即把DNA作為組件，在細(xì)胞外將一種外源DNA（目的基因）和載體DNA重新組合連接（重組），最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，使外源基因DNA在宿主細(xì)胞中隨細(xì)胞的繁殖而增殖（cloning，克?。蜃詈蟮玫奖磉_(dá)，最終獲得基因表達(dá)產(chǎn)物或改變生物原有的遺傳性狀。一、DNA重組技術(shù)重要的工具酶二、重組DNA技術(shù)的基本操作原理返回第二節(jié)重組DNA技術(shù)的基本操作原理

重一、重組DNA的重要的工具酶1、限制性內(nèi)切酶2、DNA連接酶3、逆轉(zhuǎn)錄酶一、重組DNA的重要的工具酶1、限制性內(nèi)切酶常用的DNA限制性內(nèi)切酶的專一性酶辨認(rèn)的序列和切口特點(diǎn)‥‥AGCT‥‥‥‥TCGA‥‥‥‥GGATCC‥‥‥‥CCTAGG‥‥‥‥AGATCT‥‥‥‥TCTAGA‥‥‥‥GAATTC‥‥‥‥CTTAAG‥‥‥‥AAGCTT‥‥‥‥TTCGAA‥‥‥‥GTCGAC‥‥‥‥CAGCTG‥‥‥‥CCCGGG‥‥‥‥GGGCCC‥‥BamHIAluIBglIEcoRIHindⅢSalISmaI四核苷酸，平端切口六核苷酸，平端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口六核苷酸，粘端切口常用的DNA限制性內(nèi)切酶的專一性酶辨認(rèn)的序列和切口特點(diǎn)‥‥連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPTCPTTPPPGAPACPPPPOHGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'AGAACCTTG3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或反轉(zhuǎn)錄酶的三種催化功能

依賴RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依賴DNA的DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶的三種催化功能

依賴RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H重組DNA技術(shù)基本操作原理

ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmoleculeIntroductionintohostcellsbytransformationofviralinfectionHostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因的獲取

2、載體的構(gòu)建

3、目的基因與載體的重組

4、重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增

5、篩選克隆細(xì)胞重組DNA技術(shù)基本操作原理

ForeignDNAto目的基因的獲取1、建立DNA和cDNA文庫2、體外擴(kuò)增—PCR技術(shù)3、人工合成重組DNA技術(shù)路線—1目的基因的獲取1、建立DNA和cDNA文庫重組DNA技術(shù)路線基因文庫(DNAlibrary)

基因文庫是指整套由基因組DNA片段插入克隆載體獲得的分子克隆之總和。應(yīng)用DNA重組技術(shù)，可以將各種生物體全部基因組的遺傳信息，貯存在可以長期保存的穩(wěn)定重組體中，以備需要時(shí)應(yīng)用。好象將文獻(xiàn)資料貯存于圖書館一樣，所以稱其為genomiclibrary。

cDNA文庫（complementalDNAlibrary）

將細(xì)胞全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并被克隆的總和稱為cDNA文庫。基因文庫(DNAlibrary)

基因文庫基因文庫和cDNA文庫的建立可克隆之DNA載體DNAcDNAmRNA部分或完全酶解DNADNA長度分級甲基化，雙鏈接頭DNADNA與載體連接引入大腸桿菌鑒定文庫的滴度和特性擴(kuò)增后供長期儲存篩選出所需要的克隆組織基因文庫和cDNA文庫的建立可克隆之DNA載體DNAcDNADNA克隆的載體1、質(zhì)粒2、噬菌體3、動物病毒4、植物寄生菌重組DNA技術(shù)路線—2DNA克隆的載體1、質(zhì)粒重組DNA技術(shù)路線—2重組DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)1、轉(zhuǎn)化(transformation)：以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。2、轉(zhuǎn)染(Transfection

):以噬菌體或真核病毒為載體構(gòu)建的重組體依靠對細(xì)胞的感染功能導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。3、電穿孔法(electroporation):高壓脈沖電流使細(xì)胞產(chǎn)生臨時(shí)的通透性以吸收DNA。4、微注射法(microinjection):借助極細(xì)針管的幫助把DNA注射入細(xì)胞核的方法。重組DNA技術(shù)路線—4重組DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)1、轉(zhuǎn)化(transformation)：電穿孔法示意圖

細(xì)胞壁原生質(zhì)膜纖維素酶電穿孔細(xì)胞壁再生瞬間的開口外來的DNA插入外源DNA的植物細(xì)胞電穿孔法示意圖

細(xì)胞壁原生質(zhì)膜纖維素酶電穿孔細(xì)胞壁再生瞬間的pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

噬菌體感染大腸桿菌的途徑

噬菌體感染大腸桿菌的途徑

噬菌體突變型作為克隆載體DNA用限制性內(nèi)切酶除去中間一段與外源DNA連接重組載體的體外包裝帶有外源DNA的噬菌體太小不能被包裝噬菌體突變型作為克隆載體DNA用限制性內(nèi)切酶除去中間一段反轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期

RNA衣殼被膜逆轉(zhuǎn)錄酶整合入宿主細(xì)胞染色體DNA進(jìn)入細(xì)胞丟失被膜丟失衣殼逆轉(zhuǎn)錄RNAcDNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯RNA衣殼蛋白被膜蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期

RNA衣殼被膜逆轉(zhuǎn)錄酶整合入宿主細(xì)胞染植物冠癭瘤（其表達(dá)產(chǎn)物幫助T-DNA轉(zhuǎn)移和整合）鱆魚堿Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)編碼兩類酶：植物生長激素和細(xì)胞分裂素合成酶冠癭氨基酸或冠癭堿合成酶植物冠癭瘤（其表達(dá)產(chǎn)物幫助T-DNA轉(zhuǎn)移和整合）鱆魚堿Ti質(zhì)篩選克隆細(xì)胞

載體特征的直接篩選

菌落的原位雜交免疫學(xué)方法重組DNA技術(shù)路線—5篩選克隆細(xì)胞

載體特征的直接篩選重組DNA技術(shù)路線—5pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

如果外源DNA插入，氨卞青霉素原位雜交法篩選DNA重組體圖解用NaOH將菌體裂解，變性的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上雜交放射自顯影32P-cDNA與放射性cDNA雜交的菌落的斑點(diǎn)細(xì)菌菌落單鏈DNA結(jié)合到膜上將菌落復(fù)印至硝酸纖維素膜上原位雜交法篩選DNA重組體圖解用NaOH將菌體裂解，變性的D重組DNA表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)檢測32P-抗體裂解細(xì)胞，表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上與放射性抗體雜交的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)轉(zhuǎn)化到E.Coli細(xì)菌啟動子插入的真核DNA片段放射自顯影重組體重組DNA表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)檢測32P-抗體裂解細(xì)胞，表達(dá)蛋白Southern和Western印跡法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiographySouthern和Western印跡法DNA第三節(jié)重組DNA技術(shù)的應(yīng)用

一、產(chǎn)生新品種新選擇

轉(zhuǎn)基因動植物

構(gòu)建微生物工程菌基因藥物二、法醫(yī)學(xué)的強(qiáng)大武器—DNA指紋法三、基因診斷和治療第三節(jié)重組DNA技術(shù)的應(yīng)用

一、產(chǎn)生新品種新選擇胰島素原的人工合成

胰臟(A)n胰島素原mRNAcDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌mRNA反轉(zhuǎn)錄酶胰島素原基因與質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化E.coli胰島素原胰島素原的人工合成

胰臟(A)ncDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌mRTi質(zhì)粒為載體的植物基因工程

I二元載體系統(tǒng)II共整合載體IIIT-DNA的轉(zhuǎn)移與整合Ti輔助質(zhì)粒Ti輔助DNA給體質(zhì)粒Ti輔助DNA給體質(zhì)粒pBR型質(zhì)粒（給體質(zhì)粒）宿主特異性外源基因宿主特異性整合帶有外源基因的Ti質(zhì)粒植物DNATi質(zhì)粒轉(zhuǎn)移并插入植物DNATi質(zhì)粒為載體的植物基因工程

I二元載體系統(tǒng)IISouthern印跡法在DNA指紋法中的應(yīng)用1DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物2犯罪嫌疑人13現(xiàn)場證據(jù)4犯罪嫌疑人21234Southern印跡法圖譜Southern印跡法在DNA指紋法中的應(yīng)用1DNA分子量Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電第四節(jié)基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)

及研究技術(shù)簡介

攜帶有細(xì)胞或生物機(jī)體的一整套遺傳指令的核酸量稱為基因組(genome)，在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生的基因組學(xué)(genomics)是一門在整個(gè)細(xì)胞、整個(gè)物種的基因水平研究DNA順序、整個(gè)基因組成分和功能的科學(xué)。由一個(gè)基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)成分叫做蛋白質(zhì)組（proteome），從整體水平研究蛋白質(zhì)組的結(jié)構(gòu)和功能即為蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)。一、基因組文庫提供基因組特異的遺傳信息目錄二、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增特異性的DNA片段三、基因組測序提供最完善的基因文庫四、序列和結(jié)構(gòu)相關(guān)性提供蛋白質(zhì)功能的信息返回第四節(jié)基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)

及研究技術(shù)簡介

基因組文庫提供基因組特異的遺傳信息目錄

DNA文庫是是許多DNA克隆的集合，理論上基因組的所有DNA序列都能存在于基因組文庫中。使用分子雜交的方法，可以在文庫中找到先前已知的基因或順序的位置，亦可用生物信息學(xué)（Bioinformatics）方法找出基因并研究其功能。在基因組文庫中的已知順序(稱為標(biāo)簽順序位點(diǎn)，sequence-taggedsite,STS)能夠?yàn)榛蚪M測序提供界標(biāo)。基因組文庫提供基因組特異的遺傳信息目錄

D多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增特異性的DNA片段

人類基因組工程以及對各種基因組測序的研究，為人們提供了前所未有的了解基因信息的好機(jī)會。這些DNA順序信息又為簡化單個(gè)基因的克隆以便更詳細(xì)地進(jìn)行生物化學(xué)研究提供了條件。如果知道一個(gè)被克隆的DNA片段的側(cè)接順序，就能利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

(polymerasechainreaction,PCR)擴(kuò)增這個(gè)DNA片段，這樣擴(kuò)增的DN