外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離課件_第1頁(yè)
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外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離和鑒定DepartmentofClinicalImmunology,GuangdongMedicalCollegeXuJun-Fa2010.11.免疫細(xì)胞的種類淋巴細(xì)胞：T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等單核－巨噬細(xì)胞樹突狀細(xì)胞粒細(xì)胞免疫細(xì)胞的分布外周血免疫器官胸腺、骨髓脾臟、淋巴結(jié)黏膜相關(guān)淋巴組織組織分離免疫細(xì)胞的樣本來(lái)源外周血脾臟淋巴結(jié)胸腺骨髓分離免疫細(xì)胞的一般原理根據(jù)各種免疫細(xì)胞的物理學(xué)和生物學(xué)特征不同將其分離密度大小表面標(biāo)志其它活性：吞噬、黏附等外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離外周血細(xì)胞的密度血小板：1.030-1.035

淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞：1.075-1.090

粒細(xì)胞：1.092紅細(xì)胞：1.093外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC):

Monocyte、Lymphocyte聚蔗糖－泛影葡胺分層液法一、原理1.單次密度梯度分離法

單次密度梯度連續(xù)密度梯度3.離心分離：將細(xì)胞疊加在密度合適的分層液(1.075-1.09)上層，經(jīng)離心后細(xì)胞可分為不同的區(qū)帶。二、方法抽血：靜脈抽血2ml(每大組)，用2滴肝素抗凝；稀釋：加2mlNS于抗凝血中，輕輕混勻；疊加：在離心管中先加入1.5ml分層液，將2ml稀釋血液疊加在分離液上面。這是操作的關(guān)鍵步驟。離心：將上述疊加好的血液輕輕放在水平離心機(jī)中離心，800rpm，30min；瑞氏染色取細(xì)胞懸液涂片甲醇固定，待干后加瑞氏燃料第一液染色3－5min。加第二液染1分鐘。洗滌，鏡檢三、實(shí)驗(yàn)安排每?jī)蓚€(gè)組抽一個(gè)同學(xué)的血。每組做一支試管分離。每位同學(xué)單獨(dú)做染色。要求計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)單個(gè)核細(xì)胞的百分率。四、注意事項(xiàng)血液加入到抗凝劑中和稀釋血液時(shí)混勻不能太用力，否則會(huì)溶血。疊加血液時(shí)要小心，將毛細(xì)管貼近分離液并傾斜離心管后再加血液。瑞氏染色時(shí)第一液不能干，否則會(huì)有染料沉積。此實(shí)驗(yàn)與下周實(shí)驗(yàn)一起寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，用論文格式。（二）方法評(píng)價(jià)是

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