第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件

第六章園藝植物的染色體工程第六章園藝植物的染色體工程1優(yōu)選第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)選第六章園藝植物的染色體工程2

第一節(jié)園藝植物單倍體的制備

單倍體（haploid）是指體細胞中含有本物種配子體（gametophyte）染色體數(shù)目的個體。制備園藝植物單倍體一般采用離體誘導法從具有單倍染色體數(shù)的性器官獲得植株。其中，雄配子途徑以雄性器官為外植體，經(jīng)歷雄核發(fā)育（androgenesis）獲得單倍體；而雌配子途徑以雌性器官及其相關(guān)結(jié)構(gòu)為外植體，經(jīng)雌核發(fā)育（gynogenesis）獲得單倍體植株。第一節(jié)園藝植物單倍體的制備3一、雄配子途徑采用花藥或花粉培養(yǎng)（或游離小孢子），即離體培養(yǎng)花藥和花粉（小孢子），使小孢子改變原來的配子體發(fā)育途徑，轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑，形成花粉胚或花粉愈傷組織，最后形成花粉植株，從中鑒定出單倍體并加倍成純合二倍體。一、雄配子途徑4

離體條件下對植物的花粉或花藥進行培養(yǎng)（PollenCultureandAntherCulture）獲得單倍體植株的技術(shù)最早是在1964年由印度植物學家Guha和Maheshiwari在毛葉曼佗羅（Daturainnoxia)的花藥培養(yǎng)中成功獲得單倍體植株。目前已在250多種植物中由花藥或花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株。第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件5花藥和花粉（小孢子）培養(yǎng)的基本程序:

外植體的選擇----預處理----表面滅菌----接種----培養(yǎng)----再生植株-----單倍體鑒定----染色體加倍----獲得純合二倍體?；ㄋ幒突ǚ郏ㄐ℃咦樱┡囵B(yǎng)的基本程序:6第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件7（1）材料的表面滅菌與無菌操作：對花蕾進行表面滅菌，然后分離花藥和花粉。（2）花粉的分離與清洗：花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：把花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于液體表面經(jīng)1-7天的培養(yǎng)，藥壁開裂，花粉自然散落下來．及時將花藥壁從培養(yǎng)瓶取出，留下的花粉繼續(xù)培養(yǎng)。（1）材料的表面滅菌與無菌操作：8

機械分離法

A.分離：把花藥放在玻璃容器中，加入一定量適當濃度的蔗糖溶液，加入適量液體培養(yǎng)基，用注射器內(nèi)筒輕輕擠壓花藥把花粉擠出來。或用磁力攪拌器把花藥攪裂使花粉散出來。

B.過篩：把上述的花藥殘渣和花粉的混合液經(jīng)·一定孔徑的不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾?；ǚ蹫V液注入離心管。

C.清洗：花粉藥壁混合液置于100-1000轉(zhuǎn)／分的速度下離心1-5分鐘，上清液再離心，最后懸浮花粉。密度為104-105/ml。機械分離法9（3）花粉培養(yǎng)方式：直接培養(yǎng)法：不經(jīng)預處理直接接種于培養(yǎng)基。看護培養(yǎng)法：花藥接種于培養(yǎng)基，上面放置一塊濾紙，花粉接種于濾紙上。微室培養(yǎng)法:蓋玻片上滴加一滴瓊脂，花粉接種在瓊脂上，反向放置于凹型載玻片上。（3）花粉培養(yǎng)方式：10第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件11第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件122.雄核發(fā)育

在適宜離體培養(yǎng)的條件下，花粉（或小孢子）的發(fā)育偏離活體時的正常發(fā)育而轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育，經(jīng)胚狀體途徑或器官發(fā)生途徑形成完整植株，稱為雄核發(fā)育。2.雄核發(fā)育13第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件14離體小孢子發(fā)育途徑（雄核發(fā)育，Androgenesis）：小孢子第一次分裂為均等分裂（B途徑）

形成大小相似的細胞，然后由單一類細胞形成多核花粉細胞（途徑Ⅰ)。小孢子第一次分裂為不均等分裂(A途徑)：根據(jù)第二次及以后的分裂不同又分為A-V途徑（營養(yǎng)核分裂,途徑Ⅱ）、A-G（生殖核分裂，途徑Ⅲ）、A-VG（營養(yǎng)和生殖核均分裂，途徑Ⅳ）、C（分裂中出現(xiàn)融合加倍等現(xiàn)象）途徑等。

離體小孢子發(fā)育途徑（雄核發(fā)育，Androgenesis）：15花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：把花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于液體表面經(jīng)1-7天的培養(yǎng)，藥壁開裂，花粉自然散落下來．及時將花藥壁從培養(yǎng)瓶取出，留下的花粉繼續(xù)培養(yǎng)。（3）未受精子房或胚珠培養(yǎng)獲得的再生植株為綠苗，白化現(xiàn)象少；不同發(fā)育階段的煙草花芽單倍體（haploid）是指體細胞中含有本物種配子體（gametophyte）染色體數(shù)目的個體。三、染色體易位系的創(chuàng)制第三節(jié)園藝植物非整套染色體操作雌核發(fā)育的主要影響因素（3）未受精子房或胚珠培養(yǎng)獲得的再生植株為綠苗，白化現(xiàn)象少；（3）供體植株的生理狀態(tài)：受植株生長環(huán)境和生理年齡等影響。第三節(jié)園藝植物非整套染色體操作浸泡法無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。目前已在向日葵、甜菜、黃瓜、洋蔥、百合等園藝植物上獲得了成功。Identicalnucleiareformedinlowfrequency(c).植物胚囊中具有單倍性染色體構(gòu)成的細胞在適當?shù)臈l件下可以發(fā)育成單倍體植株，這就是制備單倍體的雌配子體途徑，常用的方法是通過未授粉子房和未授粉胚珠培養(yǎng)。離體小孢子發(fā)育途徑（雄核發(fā)育，Androgenesis）：第二節(jié)園藝植物多倍體的制備第一次有絲分裂為均等分裂，B途徑.單倍體（haploid）是指體細胞中含有本物種配子體（gametophyte）染色體數(shù)目的個體。1976年SanNoeum首次在大麥未受精子房培養(yǎng)得到單倍體植株，并采用離體雌核發(fā)育來闡明單倍體產(chǎn)生的過程。Thefirstmitoticdivisionoccursatthe4thdayofculture.第一次有絲分裂為均等分裂，B途徑.花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：把花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于16第一次有絲分裂為不均等分裂.A.途徑（D.自然萌發(fā)）第一次有絲分裂為不均等分裂.A.途徑（D.自然萌發(fā)）17C途徑，在第一次不均等分裂后，營養(yǎng)核、生殖核同時核內(nèi)復制C途徑，在第一次不均等分裂后，營養(yǎng)核、生殖核同時核內(nèi)復制18Figure-Segmentationpatternofinvitrowheatpollenobservedfromthe1stto14thdayofantherculture.Thefigureshowsthatauninucleatedmicrosporemaydegeneratebeforedivision,(a)ormaygiverise,bymitosis,tonormalbinucleatedgrainpresentingvegetativeandgenerativenuclei(b).Identicalnucleiareformedinlowfrequency(c).Thefirstmitoticdivisionoccursatthe4thdayofculture.Thenormalbinucleatedpollenmayfollowthenormalinsitudevelopmentalpatternformingstarchandthen,degenerate(d).Thesecondmitoticdivisiontakesplaceatthe6-8thandatthe10thdayofculture.Intheandrogeneticpollen,thevegetative,generativeorbothnucleiareabletodividegivingrisetoanembryo(e,f,g).Inpollenwithidenticalnuclei,bothcellscontributetoandrogenesis(h).Pollendegenerationcanoccurinanystepofthisprocess.Atthe14thday,multicellularstructurescanbeseen(i).

Figure-Segmentationpattern19第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件20花粉植株的誘導：（1）胚狀體途徑直接形成胚狀體。（2）愈傷組織途徑形成愈傷組織然后分化出不定芽等器官，最后發(fā)育成完整植株?；ǚ壑仓甑恼T導：21第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件22第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件23第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件243.影響花藥和花粉（小孢子）培養(yǎng)的主要因素（1）供體植株基因型：植物屬間、種間、品種間可能存在一定的差異。（2）小孢子發(fā)育時期：醋酸洋紅染色鏡檢花粉發(fā)育時期。大多數(shù)植物以單核后期花粉適宜花藥培養(yǎng)。（3）供體植株的生理狀態(tài)：受植株生長環(huán)境和生理年齡等影響。如木本植物幼齡植株比老齡誘導率高；始花期和盛花期比開花末期適宜；一二年生草本生長健壯且處于生殖高峰期的花粉花藥誘導率高。3.影響花藥和花粉（小孢子）培養(yǎng)的主要因素25第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件26四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色單核期雙核期成熟花粉粒不同發(fā)育時期的煙草小孢子四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色27對不同發(fā)育階段的花藥進行培養(yǎng)測試確定最佳小孢子發(fā)育時期的形態(tài)特征注意形態(tài)特征會因品種、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化不同發(fā)育階段的煙草花芽花粉發(fā)育時期的確定對不同發(fā)育階段的花藥進行培養(yǎng)測試不同發(fā)育階段的煙草花芽花粉28花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：把花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于液體表面經(jīng)1-7天的培養(yǎng)，藥壁開裂，花粉自然散落下來．及時將花藥壁從培養(yǎng)瓶取出，留下的花粉繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基處理將植株的任何一部分作為外植體，接種于附加一定濃度的秋水仙素培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，轉(zhuǎn)入無秋水仙素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導胚狀體。前期要求高溫（25-28℃），光照條件要求不高，愈傷組織誘導階段黑暗或弱光、散射光培養(yǎng)；形成大小相似的細胞，然后由單一類細胞形成多核花粉細胞（途徑Ⅰ)。看護培養(yǎng)法：花藥接種于培養(yǎng)基，上面放置一塊濾紙，花粉接種于濾紙上。體細胞含有3個或3個以上染色體組的生物體稱為多倍體（polyploidy）。離體條件下對植物的花粉或花藥進行培養(yǎng)（PollenCultureandAntherCulture）獲得單倍體植株的技術(shù)最早是在1964年由印度植物學家Guha和Maheshiwari在毛葉曼佗羅（Daturainnoxia)的花藥培養(yǎng)中成功獲得單倍體植株。第一次有絲分裂為均等分裂，B途徑.附加系的創(chuàng)制方法包括雜交法、橋梁親本法、雙重單體或多重單體附加法、雙二倍體回交法、遠緣雜種F1花藥（花粉）培養(yǎng)法等。第三節(jié)園藝植物非整套染色體操作是以未受精子房或胚珠為外植體誘導單倍體的方法。對外界環(huán)境條件的適應性強，抗病力、耐旱力、耐寒力一般比二倍體強，但結(jié)實力多會下降。（1）材料的表面滅菌與無菌操作：（2)供體植株的生理狀態(tài)：適宜生長條件下的供體植株，其未授粉子房和胚珠培養(yǎng)效果較好；（5）培養(yǎng)條件：溫度以25℃為適宜，黑暗條件有利于雌核發(fā)育。染色體相互發(fā)生片段交換的植株叫相互易位系，染色體片段只從一方移接到另一方染色體上的植株叫簡單易位系。對外界環(huán)境條件的適應性強，抗病力、耐旱力、耐寒力一般比二倍體強，但結(jié)實力多會下降。1976年SanNoeum首次在大麥未受精子房培養(yǎng)得到單倍體植株，并采用離體雌核發(fā)育來闡明單倍體產(chǎn)生的過程。小孢子第一次分裂為均等分裂（B途徑）常規(guī)法創(chuàng)制代換系采用單體法、缺體回交法和單端體法等。Thefigureshowsthatauninucleatedmicrosporemaydegeneratebeforedivision,(a)ormaygiverise,bymitosis,tonormalbinucleatedgrainpresentingvegetativeandgenerativenuclei(b).（4）預處理：

花粉和花藥培養(yǎng)中材料的預處理方法有黑暗處理、光照處理、高滲處理（蔗糖、甘露醇等）、藥物處理（秋水仙素、乙稀利、EMS等）、溫度處理以及射線處理（r射線）等。溫度處理又包括低溫處理和高溫處理，接種前的處理和接種后的處理等，采用較多的方式是把取來的材料放在冰箱里3-10℃下進行1-15天的低溫處理。也可采用接種后預處理的方法。花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：把花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于29（5）培養(yǎng)基成分：

培養(yǎng)基類型

MS、Miller、Nitsh、H、N6、W14等。激素及生長調(diào)節(jié)劑早期要求生長素促進分裂，后期細胞分裂素促進花粉植株的形成。碳源及其他成分高濃度蔗糖等，要求較低的銨態(tài)氮、氨基酸等。（6）溫度和光照：

前期要求高溫（25-28℃），光照條件要求不高，愈傷組織誘導階段黑暗或弱光、散射光培養(yǎng)；分化階段光照有利于分化。（7）接種方式和密度接種方向和密度影響小孢子離體形態(tài)發(fā)生。（5）培養(yǎng)基成分：30不結(jié)球白菜小孢子培養(yǎng)不結(jié)球白菜小孢子培養(yǎng)31二、雌配子途徑

植物胚囊中具有單倍性染色體構(gòu)成的細胞在適當?shù)臈l件下可以發(fā)育成單倍體植株，這就是制備單倍體的雌配子體途徑，常用的方法是通過未授粉子房和未授粉胚珠培養(yǎng)?；虿捎闷渌椒ㄍㄟ^雌配子體途徑獲得單倍體。

1980年成功培養(yǎng)了未授粉的非洲菊、煙草的胚珠，獲得了單倍體植株。二、雌配子途徑32

顯花植物花的結(jié)構(gòu)圖示顯花植物花的結(jié)構(gòu)圖示33第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件34第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件35第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件361.未受精子房或胚珠培養(yǎng)的意義

是以未受精子房或胚珠為外植體誘導單倍體的方法。1976年SanNoeum首次在大麥未受精子房培養(yǎng)得到單倍體植株，并采用離體雌核發(fā)育來闡明單倍體產(chǎn)生的過程。目前已在向日葵、甜菜、黃瓜、洋蔥、百合等園藝植物上獲得了成功。（1）目前部分植物花粉花藥培養(yǎng)技術(shù)尚未成功建立或誘導頻率過低，因此可以采用未受精子房或胚珠培養(yǎng)；（2）對于雄性不育植物也可以采用該方法培養(yǎng)單倍體；（3）未受精子房或胚珠培養(yǎng)獲得的再生植株為綠苗，白化現(xiàn)象少；（4）未授粉子房或胚珠培養(yǎng)再生植株穩(wěn)定；（5）雌雄異株植物可以采用未授粉子房或胚珠培養(yǎng)獲得單倍體。1.未受精子房或胚珠培養(yǎng)的意義372.雌核發(fā)育

胚囊中具有單倍性染色體構(gòu)成的細胞都可以通過離體雌核發(fā)育產(chǎn)生單倍體植株，包括（1）助細胞或胚囊的無配子生殖產(chǎn)生單倍體；（2）卵細胞、助細胞和反足細胞發(fā)育產(chǎn)生單倍體；（3）非正常發(fā)育的大孢子四分體產(chǎn)生單倍體。2.雌核發(fā)育383.雌核發(fā)育的主要影響因素（1）基因型：培養(yǎng)難易程度受基因型影響。（2)供體植株的生理狀態(tài)：適宜生長條件下的供體植株，其未授粉子房和胚珠培養(yǎng)效果較好；生理年齡小，培養(yǎng)效果好。（3）胚囊發(fā)育時期：接近成熟階段的子房和胚珠易培養(yǎng)成功。3.雌核發(fā)育的主要影響因素39密度為104-105/ml。顯花植物花的結(jié)構(gòu)圖示1976年SanNoeum首次在大麥未受精子房培養(yǎng)得到單倍體植株，并采用離體雌核發(fā)育來闡明單倍體產(chǎn)生的過程。（5）雌雄異株植物可以采用未授粉子房或胚珠培養(yǎng)獲得單倍體。單倍體（haploid）是指體細胞中含有本物種配子體（gametophyte）染色體數(shù)目的個體。（5）雌雄異株植物可以采用未授粉子房或胚珠培養(yǎng)獲得單倍體。對遠緣雜種的花藥（或花粉）進行培養(yǎng)，再生植株中有可能鑒定出染色體代換系。目前已在向日葵、甜菜、黃瓜、洋蔥、百合等園藝植物上獲得了成功。（3）供體植株的生理狀態(tài)：受植株生長環(huán)境和生理年齡等影響。第二節(jié)園藝植物多倍體的制備1976年SanNoeum首次在大麥未受精子房培養(yǎng)得到單倍體植株，并采用離體雌核發(fā)育來闡明單倍體產(chǎn)生的過程。胚乳培養(yǎng)應注意的問題：始花期和盛花期比開花末期適宜；對花蕾進行表面滅菌，然后分離花藥和花粉。矮牽牛未授粉胚珠培養(yǎng)不需激素，其他需要適當添加。前期要求高溫（25-28℃），光照條件要求不高，愈傷組織誘導階段黑暗或弱光、散射光培養(yǎng)；（3）供體植株的生理狀態(tài)：受植株生長環(huán)境和生理年齡等影響。而雌配子途徑以雌性器官及其相關(guān)結(jié)構(gòu)為外植體，經(jīng)雌核發(fā)育（gynogenesis）獲得單倍體植株。（4）培養(yǎng)基成分：

A.植物激素

授粉胚珠：細胞分裂素對胚發(fā)育通常有促進作用。未授粉胚珠：外源激素不利于向日葵孤雌生殖。矮牽牛未授粉胚珠培養(yǎng)不需激素，其他需要適當添加。

B.有機物：添加有機附加物可以促進授粉胚珠的發(fā)育。

C.蔗糖濃度：3-12%，通常5%，高濃度利于孤雌生殖。密度為104-105/ml。（4）培養(yǎng)基成分：40第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件41第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件42（5）培養(yǎng)條件：溫度以25℃為適宜，黑暗條件有利于雌核發(fā)育。（6）接種方向：花柄插入培養(yǎng)效果好。第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件43

第二節(jié)園藝植物多倍體的制備

體細胞含有3個或3個以上染色體組的生物體稱為多倍體（polyploidy）。多倍體在植物形態(tài)和細胞上都表現(xiàn)明顯的巨大性、遺傳性較豐富，變異的范圍廣；對外界環(huán)境條件的適應性強，抗病力、耐旱力、耐寒力一般比二倍體強，但結(jié)實力多會下降。第二節(jié)園藝植物多倍體的制備44

人工誘導多倍體方法較多，如利用未減數(shù)配子（2n配子），采用物理方法（機械損傷、射線、溫度、高速離心）使染色體加倍；采用原生質(zhì)體融合、胚乳培養(yǎng)等也可以獲得多倍體。采用化學方法誘導植物染色體加倍，常用的是秋水仙素（colchicine），具有阻礙紡錘絲形成和赤道板的產(chǎn)生而導致染色體加倍。此外抗微管形成的除草劑如氟樂靈（trifluralin）、氨磺靈（oryzalin）、APM等也具有染色體加倍功能。人工誘導多倍體方法較多，如利用未減數(shù)配子（2n配子），45A.浸泡法無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。B.生長點處理秋水仙素水溶液直接涂抹生長點（頂芽或腋芽）。C.培養(yǎng)基處理將植株的任何一部分作為外植體，接種于附加一定濃度的秋水仙素培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，轉(zhuǎn)入無秋水仙素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導胚狀體。A.浸泡法無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，46第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件47第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件48離體誘導影響因素：（1）外植體：愈傷組織、種子、芽、莖尖分生組織、葉片、原球莖等均可；以生長旺盛時期為適宜。（2）加倍劑的類型：秋水仙素、氨磺靈、氟樂靈等。（3）加倍劑濃度和時間：高濃度短時間或低濃度長時間處理。（4）加倍劑的加入時間：接種前浸泡處理或先獲得無菌材料再處理。（5）助劑：如二甲基亞砜（DMSO）。離體誘導影響因素：49

胚乳培養(yǎng)

胚乳在被子植物中是雙受精的產(chǎn)物，由極核和雄配子結(jié)合成的三倍體組織。而裸子植物胚乳在受精前形成，為單倍體。僅40多種植物進行胚乳培養(yǎng)研究，20種獲得再生植株，如獼猴桃等。多存在混倍現(xiàn)象。胚乳培養(yǎng)胚乳在被子植物中是雙受精的產(chǎn)物，由極核和雄配子50胚乳培養(yǎng)應注意的問題：（1）確定適宜的發(fā)育時期（生長旺盛期）；（2）嚴格區(qū)分胚乳和其他組織；（3）合理使用激素；（4）注意光、溫條件（24-280C；黑暗條件）。胚乳培養(yǎng)應注意的問題：51

第三節(jié)園藝植物非整套染色體操作

生物體的核內(nèi)染色體數(shù)不是染色體基數(shù)整數(shù)倍，而發(fā)生個別染色體增減的生物體稱為非整倍體（aneuploid）。非整倍體多不具有直接利用價值，但可以利用非整倍體進行染色體添加、消減、代換和易位，將帶有異源優(yōu)良基因的染色體或片段導入生物體中，從而達到定向改變遺傳特性，創(chuàng)造新類型和新品種的目的。第三節(jié)園藝植物非整套染色體操作52一、染色體代換系的創(chuàng)制

生物體的染色體被異源種屬染色體所代換的品系稱為代換系，一條染色體被代換稱為單體代換系，一對染色體被代換稱為二體代換系，整套被代換稱為整套染色體代換系。常規(guī)法創(chuàng)制代換系采用單體法、缺體回交法和單端體法等。生物技術(shù)方法創(chuàng)制代換系主要是組織培養(yǎng)法，其中常用的是花藥（花粉）培養(yǎng)法。對遠緣雜種的花藥（或花粉）進行培養(yǎng)，再生植株中有可能鑒定出染色體代換系。一、染色體代換系的創(chuàng)制53二、染色體附加系的創(chuàng)制

將同種或異種的染色體導入受體中，這種染色體在受體中增加的技術(shù)叫做染色體附加。具有附加染色體的品種或品系叫附加系。導入一條或幾條異源種屬的染色體的品種稱為異附加系；得到一條異源染色體的的受體叫做單體附加系；達到一對染色體的叫做二體附加系，整套染色體附加到受體，可能創(chuàng)造出具有一套異源種屬染色體的異附加系。

附加系的創(chuàng)制方法包括雜交法、橋梁親本法、雙重單體或多重單體附加法、雙二倍體回交法、遠緣雜種F1花藥（花粉）培養(yǎng)法等。二、染色體附加系的創(chuàng)制54三、染色體易位系的創(chuàng)制

易位是指某染色體的一個區(qū)段移接在非同源的另一個染色體上。染色體相互發(fā)生片段交換的植株叫相互易位系，染色體片段只從一方移接到另一方染色體上的植株叫簡單易位系。易位系的創(chuàng)制常規(guī)方法包括輻射誘導易位和雜交誘導易位。組織培養(yǎng)誘導易位是利用組織培養(yǎng)過程?？梢鹑旧w不穩(wěn)定，出現(xiàn)染色體斷裂、易位、缺失及染色體數(shù)目改變的現(xiàn)象，而篩選易位系。種間雜種的組織培養(yǎng)可以提高染色體同源配對和交換頻率，誘發(fā)易位系。三、染色體易位系的創(chuàng)制55第六章園藝植物的染色體工程第六章園藝植物的染色體工程56優(yōu)選第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)選第六章園藝植物的染色體工程57

第一節(jié)園藝植物單倍體的制備

單倍體（haploid）是指體細胞中含有本物種配子體（gametophyte）染色體數(shù)目的個體。制備園藝植物單倍體一般采用離體誘導法從具有單倍染色體數(shù)的性器官獲得植株。其中，雄配子途徑以雄性器官為外植體，經(jīng)歷雄核發(fā)育（androgenesis）獲得單倍體；而雌配子途徑以雌性器官及其相關(guān)結(jié)構(gòu)為外植體，經(jīng)雌核發(fā)育（gynogenesis）獲得單倍體植株。第一節(jié)園藝植物單倍體的制備58一、雄配子途徑采用花藥或花粉培養(yǎng)（或游離小孢子），即離體培養(yǎng)花藥和花粉（小孢子），使小孢子改變原來的配子體發(fā)育途徑，轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑，形成花粉胚或花粉愈傷組織，最后形成花粉植株，從中鑒定出單倍體并加倍成純合二倍體。一、雄配子途徑59

離體條件下對植物的花粉或花藥進行培養(yǎng)（PollenCultureandAntherCulture）獲得單倍體植株的技術(shù)最早是在1964年由印度植物學家Guha和Maheshiwari在毛葉曼佗羅（Daturainnoxia)的花藥培養(yǎng)中成功獲得單倍體植株。目前已在250多種植物中由花藥或花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株。第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件60花藥和花粉（小孢子）培養(yǎng)的基本程序:

外植體的選擇----預處理----表面滅菌----接種----培養(yǎng)----再生植株-----單倍體鑒定----染色體加倍----獲得純合二倍體。花藥和花粉（小孢子）培養(yǎng)的基本程序:61第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件62（1）材料的表面滅菌與無菌操作：對花蕾進行表面滅菌，然后分離花藥和花粉。（2）花粉的分離與清洗：花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：把花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于液體表面經(jīng)1-7天的培養(yǎng)，藥壁開裂，花粉自然散落下來．及時將花藥壁從培養(yǎng)瓶取出，留下的花粉繼續(xù)培養(yǎng)。（1）材料的表面滅菌與無菌操作：63

機械分離法

A.分離：把花藥放在玻璃容器中，加入一定量適當濃度的蔗糖溶液，加入適量液體培養(yǎng)基，用注射器內(nèi)筒輕輕擠壓花藥把花粉擠出來。或用磁力攪拌器把花藥攪裂使花粉散出來。

B.過篩：把上述的花藥殘渣和花粉的混合液經(jīng)·一定孔徑的不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾?；ǚ蹫V液注入離心管。

C.清洗：花粉藥壁混合液置于100-1000轉(zhuǎn)／分的速度下離心1-5分鐘，上清液再離心，最后懸浮花粉。密度為104-105/ml。機械分離法64（3）花粉培養(yǎng)方式：直接培養(yǎng)法：不經(jīng)預處理直接接種于培養(yǎng)基。看護培養(yǎng)法：花藥接種于培養(yǎng)基，上面放置一塊濾紙，花粉接種于濾紙上。微室培養(yǎng)法:蓋玻片上滴加一滴瓊脂，花粉接種在瓊脂上，反向放置于凹型載玻片上。（3）花粉培養(yǎng)方式：65第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件66第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件672.雄核發(fā)育

在適宜離體培養(yǎng)的條件下，花粉（或小孢子）的發(fā)育偏離活體時的正常發(fā)育而轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育，經(jīng)胚狀體途徑或器官發(fā)生途徑形成完整植株，稱為雄核發(fā)育。2.雄核發(fā)育68第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件69離體小孢子發(fā)育途徑（雄核發(fā)育，Androgenesis）：小孢子第一次分裂為均等分裂（B途徑）

形成大小相似的細胞，然后由單一類細胞形成多核花粉細胞（途徑Ⅰ)。小孢子第一次分裂為不均等分裂(A途徑)：根據(jù)第二次及以后的分裂不同又分為A-V途徑（營養(yǎng)核分裂,途徑Ⅱ）、A-G（生殖核分裂，途徑Ⅲ）、A-VG（營養(yǎng)和生殖核均分裂，途徑Ⅳ）、C（分裂中出現(xiàn)融合加倍等現(xiàn)象）途徑等。

離體小孢子發(fā)育途徑（雄核發(fā)育，Androgenesis）：70花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：把花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于液體表面經(jīng)1-7天的培養(yǎng)，藥壁開裂，花粉自然散落下來．及時將花藥壁從培養(yǎng)瓶取出，留下的花粉繼續(xù)培養(yǎng)。（3）未受精子房或胚珠培養(yǎng)獲得的再生植株為綠苗，白化現(xiàn)象少；不同發(fā)育階段的煙草花芽單倍體（haploid）是指體細胞中含有本物種配子體（gametophyte）染色體數(shù)目的個體。三、染色體易位系的創(chuàng)制第三節(jié)園藝植物非整套染色體操作雌核發(fā)育的主要影響因素（3）未受精子房或胚珠培養(yǎng)獲得的再生植株為綠苗，白化現(xiàn)象少；（3）供體植株的生理狀態(tài)：受植株生長環(huán)境和生理年齡等影響。第三節(jié)園藝植物非整套染色體操作浸泡法無菌條件下以一定濃度的秋水仙素浸泡再生小植株，再轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。目前已在向日葵、甜菜、黃瓜、洋蔥、百合等園藝植物上獲得了成功。Identicalnucleiareformedinlowfrequency(c).植物胚囊中具有單倍性染色體構(gòu)成的細胞在適當?shù)臈l件下可以發(fā)育成單倍體植株，這就是制備單倍體的雌配子體途徑，常用的方法是通過未授粉子房和未授粉胚珠培養(yǎng)。離體小孢子發(fā)育途徑（雄核發(fā)育，Androgenesis）：第二節(jié)園藝植物多倍體的制備第一次有絲分裂為均等分裂，B途徑.單倍體（haploid）是指體細胞中含有本物種配子體（gametophyte）染色體數(shù)目的個體。1976年SanNoeum首次在大麥未受精子房培養(yǎng)得到單倍體植株，并采用離體雌核發(fā)育來闡明單倍體產(chǎn)生的過程。Thefirstmitoticdivisionoccursatthe4thdayofculture.第一次有絲分裂為均等分裂，B途徑.花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：把花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于71第一次有絲分裂為不均等分裂.A.途徑（D.自然萌發(fā)）第一次有絲分裂為不均等分裂.A.途徑（D.自然萌發(fā)）72C途徑，在第一次不均等分裂后，營養(yǎng)核、生殖核同時核內(nèi)復制C途徑，在第一次不均等分裂后，營養(yǎng)核、生殖核同時核內(nèi)復制73Figure-Segmentationpatternofinvitrowheatpollenobservedfromthe1stto14thdayofantherculture.Thefigureshowsthatauninucleatedmicrosporemaydegeneratebeforedivision,(a)ormaygiverise,bymitosis,tonormalbinucleatedgrainpresentingvegetativeandgenerativenuclei(b).Identicalnucleiareformedinlowfrequency(c).Thefirstmitoticdivisionoccursatthe4thdayofculture.Thenormalbinucleatedpollenmayfollowthenormalinsitudevelopmentalpatternformingstarchandthen,degenerate(d).Thesecondmitoticdivisiontakesplaceatthe6-8thandatthe10thdayofculture.Intheandrogeneticpollen,thevegetative,generativeorbothnucleiareabletodividegivingrisetoanembryo(e,f,g).Inpollenwithidenticalnuclei,bothcellscontributetoandrogenesis(h).Pollendegenerationcanoccurinanystepofthisprocess.Atthe14thday,multicellularstructurescanbeseen(i).

Figure-Segmentationpattern74第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件75花粉植株的誘導：（1）胚狀體途徑直接形成胚狀體。（2）愈傷組織途徑形成愈傷組織然后分化出不定芽等器官，最后發(fā)育成完整植株?；ǚ壑仓甑恼T導：76第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件77第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件78第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件793.影響花藥和花粉（小孢子）培養(yǎng)的主要因素（1）供體植株基因型：植物屬間、種間、品種間可能存在一定的差異。（2）小孢子發(fā)育時期：醋酸洋紅染色鏡檢花粉發(fā)育時期。大多數(shù)植物以單核后期花粉適宜花藥培養(yǎng)。（3）供體植株的生理狀態(tài)：受植株生長環(huán)境和生理年齡等影響。如木本植物幼齡植株比老齡誘導率高；始花期和盛花期比開花末期適宜；一二年生草本生長健壯且處于生殖高峰期的花粉花藥誘導率高。3.影響花藥和花粉（小孢子）培養(yǎng)的主要因素80第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件81四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色單核期雙核期成熟花粉粒不同發(fā)育時期的煙草小孢子四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色82對不同發(fā)育階段的花藥進行培養(yǎng)測試確定最佳小孢子發(fā)育時期的形態(tài)特征注意形態(tài)特征會因品種、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化不同發(fā)育階段的煙草花芽花粉發(fā)育時期的確定對不同發(fā)育階段的花藥進行培養(yǎng)測試不同發(fā)育階段的煙草花芽花粉83花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：把花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于液體表面經(jīng)1-7天的培養(yǎng)，藥壁開裂，花粉自然散落下來．及時將花藥壁從培養(yǎng)瓶取出，留下的花粉繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基處理將植株的任何一部分作為外植體，接種于附加一定濃度的秋水仙素培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，轉(zhuǎn)入無秋水仙素的相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)誘導胚狀體。前期要求高溫（25-28℃），光照條件要求不高，愈傷組織誘導階段黑暗或弱光、散射光培養(yǎng)；形成大小相似的細胞，然后由單一類細胞形成多核花粉細胞（途徑Ⅰ)。看護培養(yǎng)法：花藥接種于培養(yǎng)基，上面放置一塊濾紙，花粉接種于濾紙上。體細胞含有3個或3個以上染色體組的生物體稱為多倍體（polyploidy）。離體條件下對植物的花粉或花藥進行培養(yǎng)（PollenCultureandAntherCulture）獲得單倍體植株的技術(shù)最早是在1964年由印度植物學家Guha和Maheshiwari在毛葉曼佗羅（Daturainnoxia)的花藥培養(yǎng)中成功獲得單倍體植株。第一次有絲分裂為均等分裂，B途徑.附加系的創(chuàng)制方法包括雜交法、橋梁親本法、雙重單體或多重單體附加法、雙二倍體回交法、遠緣雜種F1花藥（花粉）培養(yǎng)法等。第三節(jié)園藝植物非整套染色體操作是以未受精子房或胚珠為外植體誘導單倍體的方法。對外界環(huán)境條件的適應性強，抗病力、耐旱力、耐寒力一般比二倍體強，但結(jié)實力多會下降。（1）材料的表面滅菌與無菌操作：（2)供體植株的生理狀態(tài)：適宜生長條件下的供體植株，其未授粉子房和胚珠培養(yǎng)效果較好；（5）培養(yǎng)條件：溫度以25℃為適宜，黑暗條件有利于雌核發(fā)育。染色體相互發(fā)生片段交換的植株叫相互易位系，染色體片段只從一方移接到另一方染色體上的植株叫簡單易位系。對外界環(huán)境條件的適應性強，抗病力、耐旱力、耐寒力一般比二倍體強，但結(jié)實力多會下降。1976年SanNoeum首次在大麥未受精子房培養(yǎng)得到單倍體植株，并采用離體雌核發(fā)育來闡明單倍體產(chǎn)生的過程。小孢子第一次分裂為均等分裂（B途徑）常規(guī)法創(chuàng)制代換系采用單體法、缺體回交法和單端體法等。Thefigureshowsthatauninucleatedmicrosporemaydegeneratebeforedivision,(a)ormaygiverise,bymitosis,tonormalbinucleatedgrainpresentingvegetativeandgenerativenuclei(b).（4）預處理：

花粉和花藥培養(yǎng)中材料的預處理方法有黑暗處理、光照處理、高滲處理（蔗糖、甘露醇等）、藥物處理（秋水仙素、乙稀利、EMS等）、溫度處理以及射線處理（r射線）等。溫度處理又包括低溫處理和高溫處理，接種前的處理和接種后的處理等，采用較多的方式是把取來的材料放在冰箱里3-10℃下進行1-15天的低溫處理。也可采用接種后預處理的方法?；ㄋ幤∨囵B(yǎng)自然釋放法：把花藥接種在液體培養(yǎng)基上，花藥漂浮于84（5）培養(yǎng)基成分：

培養(yǎng)基類型

MS、Miller、Nitsh、H、N6、W14等。激素及生長調(diào)節(jié)劑早期要求生長素促進分裂，后期細胞分裂素促進花粉植株的形成。碳源及其他成分高濃度蔗糖等，要求較低的銨態(tài)氮、氨基酸等。（6）溫度和光照：

前期要求高溫（25-28℃），光照條件要求不高，愈傷組織誘導階段黑暗或弱光、散射光培養(yǎng)；分化階段光照有利于分化。（7）接種方式和密度接種方向和密度影響小孢子離體形態(tài)發(fā)生。（5）培養(yǎng)基成分：85不結(jié)球白菜小孢子培養(yǎng)不結(jié)球白菜小孢子培養(yǎng)86二、雌配子途徑

植物胚囊中具有單倍性染色體構(gòu)成的細胞在適當?shù)臈l件下可以發(fā)育成單倍體植株，這就是制備單倍體的雌配子體途徑，常用的方法是通過未授粉子房和未授粉胚珠培養(yǎng)?；虿捎闷渌椒ㄍㄟ^雌配子體途徑獲得單倍體。

1980年成功培養(yǎng)了未授粉的非洲菊、煙草的胚珠，獲得了單倍體植株。二、雌配子途徑87

顯花植物花的結(jié)構(gòu)圖示顯花植物花的結(jié)構(gòu)圖示88第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件89第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件90第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件911.未受精子房或胚珠培養(yǎng)的意義

是以未受精子房或胚珠為外植體誘導單倍體的方法。1976年SanNoeum首次在大麥未受精子房培養(yǎng)得到單倍體植株，并采用離體雌核發(fā)育來闡明單倍體產(chǎn)生的過程。目前已在向日葵、甜菜、黃瓜、洋蔥、百合等園藝植物上獲得了成功。（1）目前部分植物花粉花藥培養(yǎng)技術(shù)尚未成功建立或誘導頻率過低，因此可以采用未受精子房或胚珠培養(yǎng)；（2）對于雄性不育植物也可以采用該方法培養(yǎng)單倍體；（3）未受精子房或胚珠培養(yǎng)獲得的再生植株為綠苗，白化現(xiàn)象少；（4）未授粉子房或胚珠培養(yǎng)再生植株穩(wěn)定；（5）雌雄異株植物可以采用未授粉子房或胚珠培養(yǎng)獲得單倍體。1.未受精子房或胚珠培養(yǎng)的意義922.雌核發(fā)育

胚囊中具有單倍性染色體構(gòu)成的細胞都可以通過離體雌核發(fā)育產(chǎn)生單倍體植株，包括（1）助細胞或胚囊的無配子生殖產(chǎn)生單倍體；（2）卵細胞、助細胞和反足細胞發(fā)育產(chǎn)生單倍體；（3）非正常發(fā)育的大孢子四分體產(chǎn)生單倍體。2.雌核發(fā)育933.雌核發(fā)育的主要影響因素（1）基因型：培養(yǎng)難易程度受基因型影響。（2)供體植株的生理狀態(tài)：適宜生長條件下的供體植株，其未授粉子房和胚珠培養(yǎng)效果較好；生理年齡小，培養(yǎng)效果好。（3）胚囊發(fā)育時期：接近成熟階段的子房和胚珠易培養(yǎng)成功。3.雌核發(fā)育的主要影響因素94密度為104-105/ml。顯花植物花的結(jié)構(gòu)圖示1976年SanNoeum首次在大麥未受精子房培養(yǎng)得到單倍體植株，并采用離體雌核發(fā)育來闡明單倍體產(chǎn)生的過程。（5）雌雄異株植物可以采用未授粉子房或胚珠培養(yǎng)獲得單倍體。單倍體（haploid）是指體細胞中含有本物種配子體（gametophyte）染色體數(shù)目的個體。（5）雌雄異株植物可以采用未授粉子房或胚珠培養(yǎng)獲得單倍體。對遠緣雜種的花藥（或花粉）進行培養(yǎng)，再生植株中有可能鑒定出染色體代換系。目前已在向日葵、甜菜、黃瓜、洋蔥、百合等園藝植物上獲得了成功。（3）供體植株的生理狀態(tài)：受植株生長環(huán)境和生理年齡等影響。第二節(jié)園藝植物多倍體的制備1976年SanNoeum首次在大麥未受精子房培養(yǎng)得到單倍體植株，并采用離體雌核發(fā)育來闡明單倍體產(chǎn)生的過程。胚乳培養(yǎng)應注意的問題：始花期和盛花期比開花末期適宜；對花蕾進行表面滅菌，然后分離花藥和花粉。矮牽牛未授粉胚珠培養(yǎng)不需激素，其他需要適當添加。前期要求高溫（25-28℃），光照條件要求不高，愈傷組織誘導階段黑暗或弱光、散射光培養(yǎng)；（3）供體植株的生理狀態(tài)：受植株生長環(huán)境和生理年齡等影響。而雌配子途徑以雌性器官及其相關(guān)結(jié)構(gòu)為外植體，經(jīng)雌核發(fā)育（gynogenesis）獲得單倍體植株。（4）培養(yǎng)基成分：

A.植物激素

授粉胚珠：細胞分裂素對胚發(fā)育通常有促進作用。未授粉胚珠：外源激素不利于向日葵孤雌生殖。矮牽牛未授粉胚珠培養(yǎng)不需激素，其他需要適當添加。

B.有機物：添加有機附加物可以促進授粉胚珠的發(fā)育。

C.蔗糖濃度：3-12%，通常5%，高濃度利于孤雌生殖。密度為104-105/ml。（4）培養(yǎng)基成分：95第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件96第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件97（5）培養(yǎng)條件：溫度以25℃為適宜，黑暗條件有利于雌核發(fā)育。（6）接種方向：花柄插入培養(yǎng)效果好。第六章園藝植物的染色體工程優(yōu)質(zhì)課件98

第二節(jié)園藝植物多倍體的制備

體細胞含有3個或3個以上染色體組的生物體稱為多倍體（polyploidy）。多倍體在植物形態(tài)和細胞上都表現(xiàn)明顯的巨大性、遺傳性較豐富，變異的范圍廣；對外