大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定燕學(xué)波;杜運(yùn)華;呂安林;邢玉潔;胡朝暉;胡新君;岳峰【摘要】目的研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定方法.方法采用頸椎脫臼法處死大鼠，用淋巴細(xì)胞分離液通過密度梯度離心法分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞.然后通過換液培養(yǎng)去除懸浮不貼壁的細(xì)胞.待原代細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底85%左右時(shí)傳代.倒置顯微鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)傳代過程中細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞儀鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD44、CD45表達(dá)情況.結(jié)果在倒置顯微鏡下,剛接種的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈圓形或球形，體積小，折光性強(qiáng).3d后大部分細(xì)胞貼壁,體積較小形態(tài)多樣，為橢圓形、短梭形.2周形成集落，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，體積增大,以長梭形為主,呈放射狀向四周擴(kuò)展.傳代后細(xì)胞生長旺盛，呈長梭形、旋渦狀生長且細(xì)胞形態(tài)均一，趨向一致.流式細(xì)胞儀測定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD44陽性表達(dá)率為(89.98±1.29)%,CD45陽性表達(dá)率為(2.14±0.22)%.結(jié)論聯(lián)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞表面標(biāo)記抗原CD44和CD45的鑒定，采用密度梯度離心法聯(lián)合差速貼壁法能夠獲得純化的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞.％ObjectiveToinvestigateisolation,cultureandidentificationofratBMMSCs.MethodsRatswerekilledbycervicaldislocation,BMMSCswereisolatedfrombonemarrowofSDratsbydensitygradientcentrifugation.OthercellsmixedinBMMSCswereremovedbydifferentialadhesionmethod,thenthepurifiedBMMSCswereobtained.Thecellsgrownto85%confluenceweredigestedandpassagedattheratioof1:2tillfourthpassageinvitro.ThemorphologicalchangeswereobservedunderphasecontrastmicroscopeduringthecultureandpassageofBMMSCs.ThepositivesurfacemarkerCD44andnegativemarkerCD45ofcellsweredetectedfortheidentificationofBMMSCswithflowcytometry.ResultsPrimaryBMMSCsweresmallerandhadvariedshapes,mostofcellswereofovalorshortspindleandhadstrongrefraction.Themajorityadheredafter3d,andthecellsshowedmorphologicaldiversityrangingfromoval,shortspindle,totriangularorstar-shaped.After2w,theadherentcellsrapidlyproliferatedandformedlargeorsmallcolonies.Afterpassage,thecellswerelargerthantheoriginalcellsandshowedelongatedspindle,arrangedthesametrend.TheresultsofflowcytometryshowedthatCD44expressionofBMMSCswas(89.98±1.29)%,CD45positiveexpressionratewas(2.14±0.22)%.ConclusionThepurifiedBMMSCswereobtainedbydensitygradientcentrifugationcombineddifferentialadhesionmethod.ThepurifiedBMMSCscouldbeidentifiedbydetectingpositivesurfaceantigenCD44andnegativesurfaceantigenCD45.【期刊名稱】《實(shí)用醫(yī)藥雜志》【年(卷)，期】2012(000)010【總頁數(shù)】3頁(P931-933)【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；CD44;CD45汾離;鑒定【作者】燕學(xué)波;杜運(yùn)華;呂安林;邢玉潔;胡朝暉;胡新君;岳峰【作者單位】河南信陽，154醫(yī)院心腎內(nèi)科;河南信陽，154醫(yī)院心腎內(nèi)科;陜西西安，解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心內(nèi)科;陜西西安，解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心內(nèi)科;河南信陽，154醫(yī)院心腎內(nèi)科;河南信陽，154醫(yī)院心腎內(nèi)科;河南信陽，154醫(yī)院心腎內(nèi)科【正文語種】中文【中圖分類】Q2-33近幾年自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）移植技術(shù)發(fā)展迅速，逐漸成為治療心肌梗死后心衰的有效辦法之一。Frieden-stein于1966年首先證實(shí)BMMSCs是骨髓基質(zhì)的重要組成成分，在一定條件下能向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。骨髓是由造血干細(xì)胞和非造血干細(xì)胞組成，BMMSCs是骨髓的非造血干細(xì)胞，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，在體外可被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞等。BMMSCs因取材容易，不涉及倫理問題和無免疫排斥反應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究。但是目前尚未篩選出BMMSCs特征性的表面標(biāo)記分子，因此無法直接鑒定BMMSCs。目前研究發(fā)現(xiàn)BMMSCs表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等的一些表面標(biāo)志抗原，而不表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志抗原。因此可以通過檢測BMMSCs陽性和陰性表面標(biāo)志抗原的方法間接鑒定BMMSCs。主要的分離純化方法有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀篩選和免疫磁珠篩選。但是4種主要分離純化方法各有利弊，為此筆者提出，通過密度梯度離心法和貼壁法聯(lián)合分離純化BMMSCs，聯(lián)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和檢測傳代4代的BMMSCs表面陽性標(biāo)志抗原CD44和表面陰性標(biāo)志抗原CD45來鑒定BMMSCs。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4周齡健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，體質(zhì)量（120±20）g，SPF級(jí)，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。1.2主要試劑及儀器L-DMEM培養(yǎng)液，胰蛋白酶，胎牛血清（FBS），F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液(1.077g/ml),FITC標(biāo)記的抗大鼠CD44,PE標(biāo)記的抗大鼠CD45，超凈工作臺(tái)，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，光學(xué)倒置相差顯微鏡，高速室溫離心機(jī)，流式細(xì)胞儀。1.3方法BMMSCs分離、培養(yǎng)及傳代①采用頸椎脫臼法處死大鼠，在超凈臺(tái)中用不完全培養(yǎng)液徹底沖洗大鼠骨髓腔，獲取骨髓懸液；用密度為1.077g/ml的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液離心分離出BMMSCs，加入適量L-DMEM完全培養(yǎng)液(L-DMEM,10%FBS,300mg/LL-Gln,100U/ml青霉素，100pg/ml鏈霉素)，充分混勻，重懸、計(jì)數(shù)，以1x106/ml的細(xì)胞密度接種于T25無菌塑料培養(yǎng)瓶，隨后將培養(yǎng)瓶置于37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng)，3d后首次更換新鮮L-DMEM培養(yǎng)液，去除未貼壁的懸浮細(xì)胞，以后換液1次/3d，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，待原代細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底85%左右時(shí)傳代；②待原代細(xì)胞接近85%融合時(shí)傳代，加入2.5g/L的胰蛋白酶2~3ml,將培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞間隙增大，回縮變圓時(shí)，立即棄去胰蛋白酶，加入適量L-DMEM培養(yǎng)液終止消化，按1:2的比例將細(xì)胞懸液接種于L-DMEM培養(yǎng)基中，第3天首次換液，以后換液1次/3d，傳代細(xì)胞記為P1,再次傳代細(xì)胞記為P2,培養(yǎng)至第4代，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及表面標(biāo)記抗原鑒定。BMMSCs的鑒定1.3.2.1BMMSCs形態(tài)學(xué)變化倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長情況并拍照記錄典型細(xì)胞形態(tài)。1.3.2.2流式細(xì)胞儀鑒定取第4代BMMSCs細(xì)胞，用PBS清洗之后加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液移入離心管中，室溫下1500r/min，離心5min。用PBS洗滌2次，棄上清，余50pl,配成濃度為1x106/ml的細(xì)胞懸液。分別加入FITC標(biāo)記的抗大鼠CD44單抗抗體2.5pl,PE標(biāo)記的抗大鼠CD45單抗抗體5pl,4°C,避光孵育30min。再次用PBS洗滌2次，棄上清液，加入300pl的PBS，混勻細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將樣本上樣于流式細(xì)胞儀，檢測FITC標(biāo)記細(xì)胞和PE標(biāo)記細(xì)胞各占細(xì)胞總數(shù)的百分比。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果BMMSCs培養(yǎng)傳代細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化在倒置顯微鏡下，剛接種的BMMSCs呈圓形或球形，體積小，折光性強(qiáng)（圖la）。3d后首次換液大部分細(xì)胞貼壁，體積較小，形態(tài)多樣，大部分細(xì)胞為橢圓形、短梭形，也有三角形和/或星形細(xì)胞，且伸出長短不一、粗細(xì)不等的胞質(zhì)突起互相連接（圖lb）。7d后，細(xì)胞快速增殖，形成大小不一的細(xì)胞集落，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，體積增大，以長梭形為主，呈放射狀向四周擴(kuò)展（圖lc）。傳代后細(xì)胞生長旺盛，呈長梭形、旋渦狀生長，且細(xì)胞形態(tài)均一，趨向一致（圖ld）。圖1BMMSCs培養(yǎng)傳代細(xì)胞形態(tài)變化BMMSCs表面抗原鑒定結(jié)果對(duì)傳至第4代的BMMSCs進(jìn)行鑒定，采用流式細(xì)胞儀檢測BMMSCs表面抗原CD44和CD45，結(jié)果顯示：BMMSCsCD44陽性表達(dá)率為（89.98±1.29）%,CD45陽性表達(dá)率為（2.14±0.22）%（圖2）。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。提示采用聯(lián)合法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過傳代培養(yǎng)擴(kuò)增，可以得到純化的BMMSCs。3討論BMMSCs是骨髓中的非造血干細(xì)胞，主要來源于中胚層，在骨膜、肌肉和夕卜周組織中均有存在，以骨髓和臍血中含量最多，但也只占骨髓有核細(xì)胞的0.001%~0.01%。因臍血涉及倫理學(xué)問題，且不易采取，故從骨髓中分離、純化和擴(kuò)增BMMSCs就顯得非常重要［1,6］。最初Friedenstein［7］建立BMMSCs的分離方法是利用貼壁法分離得到。但隨著BMMSCs研究的深入，對(duì)細(xì)胞需求增加，快速獲得足夠的BMMSCs是各項(xiàng)研究的基礎(chǔ)。目前比較常用的分離純化方法是貼壁分離法和密度梯度離心法，流式細(xì)胞篩選和免疫磁珠分離法因操作繁瑣，且易損傷細(xì)胞，影響細(xì)胞的生物學(xué)功能而較少使用。圖2BMMSCs表面抗原表達(dá)a:BMMSCs表達(dá)CD44流式圖；b:BMMSCs表達(dá)CD45流式圖；c:BMMSCs表達(dá)CD44、CD45統(tǒng)計(jì)圖。筆者通過充分沖洗大鼠骨髓腔獲取最大量骨髓后，用淋巴細(xì)胞分離液通過密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，然后利用BMMSCs易于貼壁的特點(diǎn)，通過換液培養(yǎng)去除懸浮不貼壁的細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，懸浮不貼壁的細(xì)胞隨換液而不斷被清除，而BMMSCs因貼壁生長得以純化。通過觀察BMMSCs形態(tài)學(xué)變化和流式細(xì)胞儀檢測BMMSCs表面陽性和陰性標(biāo)志物來進(jìn)行鑒定。從形態(tài)學(xué)上來鑒別：骨髓造血干細(xì)胞多呈圓形，而BMMSCs呈細(xì)長梭形，核大，且在培養(yǎng)傳代過程中，體積逐漸增大，并形成細(xì)胞集落，排列緊密，走向趨于均勻一致。在分離培養(yǎng)的BMMSCs中，雖然含有部分造血細(xì)胞，但因其不貼壁懸浮在培養(yǎng)液中，在換液時(shí)可以逐步去除，少量造血細(xì)胞也能貼壁，但增殖緩慢，在消化傳代時(shí)脫壁速度比BMMSCs慢，因此通過消化傳代的方法也可逐漸將其去除，傳至第4代基本可達(dá)到純化目的。另外一種方法就是通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志抗原間接鑒定BMMSCs。目前研究BMMSCs表達(dá)CD29、CD44、CD71、CD105、CD166等，而不表達(dá)CD14、CD31、CD34、CD45等［2-5］。朱勇等［8］采用直接貼壁法分離培養(yǎng)BMMSCs，通過流式細(xì)胞儀檢測BMMSCs表面標(biāo)志抗原CD90、CD45進(jìn)行鑒定，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示第3代BMMSCs表面標(biāo)記物CD90和CD45陽性表達(dá)率分別為99.8%和6.8%，提示BMMSCs表達(dá)CD90而不表達(dá)CD45。倪玉霞等［9］對(duì)全骨髓貼壁培養(yǎng)法和密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMMSCs的純度進(jìn)行比較，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD29、CD90及CD11b。結(jié)果顯示兩種方法分離培養(yǎng)的BMMSCs均表達(dá)CD44、CD29和CD90，不表達(dá)CD34、CD45和CD11b。密度梯度離心法分離培養(yǎng)出的BMMSCs較全骨髓貼壁培養(yǎng)法純度高，但全骨髓貼壁培養(yǎng)法能夠縮短原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，提高效率。Zhang等［10］將分離的大鼠BMMSCs利用表面抗原CD54和CD90進(jìn)行免疫磁珠分選，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測證實(shí)可以獲得高表達(dá)CD54和CD90，而不表達(dá)CD45的高純度的BMMSCs。也有研究者采用檢測細(xì)胞基因的方法來鑒定BMMSCs［11］。筆者選擇檢測BMMSCs陽性標(biāo)志抗原CD44和陰性標(biāo)志抗原CD45相結(jié)合的方式進(jìn)行鑒定，其結(jié)果顯示BMMSCsCD44陽性表達(dá)率為(89.98±1.29)%，CD45陽性表達(dá)率為(2.14±0.22)%。此結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。提示采用密度梯度離心法和貼壁分離法聯(lián)合分離純化大鼠BMMSCs，經(jīng)過傳代培養(yǎng)擴(kuò)增，可以得到純化的BMMSCs?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】【相關(guān)文獻(xiàn)】PittengerMF,MartinBJ.Mesenchymalstemcellsandtheirpotentialascardiactherapeutics[J].CircRes,2004,95(1):9220.ArufeMC,DelaFuenteA,FuentesI,etal.Chondrogenicpotentialofsubpopulationsofcellsexpressingmesenchymalstemcellmarkersderivedfromhumansynovialmembranes[J].JCellBiochem,2010,111(4):834-45.BarryFP,BoyntonRE,HaynesworthS,etal.ThemonoclonalantibodySH-2,raisedagainsthumanmesenchymalstemcells,recognizesanepitopeonendoglin(CD105)[J].BiochemBiophysResCommun,1999,265(1):134-9.CampagnoliC,RobertsIA,KumarS,etal.Identificationofmesenchymalstem/progenitorcellsinhumanfirst-trimesterfetalblood,liver,andbonemarrow[J].Blood,2001,98(8):2396-402.KimJ,LeeY,KimH,etalHumanamnioticfluid-derivedstemcellshavecharacteristicsofmultipotent