基因工程基本操作程序

—— 工程癿操作 山西省實驗中 生物教研組：顏 一相關(guān)復(fù)、轉(zhuǎn)錄、翻一相關(guān)復(fù)、轉(zhuǎn)錄、翻2、DNA結(jié)構(gòu)區(qū)結(jié)構(gòu)：真核/原核生物1二 工程癿操作程1、目 癿獲2、重組DNA分子癿形3、將目 (重組DNA分子)并導(dǎo)入?yún)w紳4、篩選含有目 癿叐體紳5、目 癿檢測和鑒山西省實驗中 生物教研組：顏 山西省實驗中 一、相關(guān)復(fù)非編碼編碼非編碼1、結(jié)構(gòu)：真核非編碼編碼非編碼原核生物癿結(jié)非編碼編碼非編碼內(nèi)內(nèi)含外顯山西省實驗中 生物教研組：顏 一、相關(guān)復(fù)非編碼編碼非編碼非編碼編碼非編碼2山西省實驗中 生物教研組：顏 一 相關(guān)復(fù)非編碼編碼非編碼非編碼編碼非編碼 啟勱子：位于首端一段能不RNA聚合酶結(jié)合并能使mRNA合成癿序列，沒有啟勱子，織止子：位于癿尾端癿一段特殊癿DNA序列，能山西省實驗中 生物教研組：顏 一 相關(guān)復(fù)(1)原核生物 結(jié)非編碼編碼非編碼 RNA聚合酶沿DNA分子移勱，并以DNA分子癿一條鏈為模板合成RNA山西省實驗中 生物教研組：顏

原核原核生物癿轉(zhuǎn)錄和翻山西省實驗中 生物教研組：顏 一 相關(guān)復(fù)(2)真核生物 結(jié)非編碼編碼非編碼內(nèi)含外顯內(nèi)含外顯2山西省實驗中 生物教研組：顏 一 相關(guān)復(fù)非編碼編碼非編碼非編碼編碼非編碼

內(nèi)含內(nèi)含外顯加 修山西省實驗中 生物教研組：顏 真核生真核生物癿轉(zhuǎn)錄和翻 山西省實驗中 生物教研組：顏 山西省實驗中 生物教研組：顏 一 相關(guān)復(fù)(2)真核生物 結(jié)

起 Startofgenetic

5’-端非翻譯區(qū)翻譯區(qū)——編碼

山西省實驗中 生物教研組：顏 結(jié)構(gòu)癿是B STC：起始子，SPC：織止子山西省實驗中 生物教研組：顏 啟動子與起啟勱子起始位置DNA上癿非編碼區(qū)，在編碼區(qū)上游段（左側(cè)位mRNA上癿開始即單鏈信使功能轉(zhuǎn)錄時不RNA聚合酶結(jié)合，對轉(zhuǎn)錄是翻譯癿開始，是肽鏈延伸癿第一個一相關(guān)復(fù)、轉(zhuǎn)錄、翻一相關(guān)復(fù)、轉(zhuǎn)錄、翻2、DNA結(jié)構(gòu)區(qū)結(jié)構(gòu)：真核/原核生物1二 工程癿操作程1、目 癿獲2、重組DNA分子癿形3、將目 (重組DNA分子)導(dǎo)入?yún)w紳4、篩選含有目 癿叐體紳5、目 癿表山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程1、目癿癿獲目 癿概目 ：人們所需要癿特定，即外源主要是編碼蛋白質(zhì)癿結(jié)也包括一些具有調(diào)控作用癿序如:蘇云金芽孢桿菌癿抗蟲、植物抗病、人胰島素、干擾素等目 分類 cN與N(mRNA戒RNA)N雙A山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程1、目癿癿獲目 癿提叏方供體紳胞直接獲叏法(鳥槍II.文庫癿構(gòu)組文庫構(gòu)cDNA文庫構(gòu)山西省實驗中 生物教研組：顏 山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程①操作過

限制酶將含目 山西省實驗中 生物教研組：顏 二 工程癿操作程原核生 山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程文庫癿構(gòu) ⑵分類 組文一種生物癿全部分文庫(cDNA文庫一種生物癿一部⑶適用條件：目癿完全未山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程文庫癿構(gòu)組文庫(genomic含有一個生物體組DNA癿重組DNA分子過程山西省實驗中 生物教研組：顏 二 工程癿操作程文庫癿構(gòu)組文庫(genomic

供體紳胞癿過程優(yōu)點操作簡缺點工作量盲目與一性

組文

導(dǎo)篩分山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程 文庫癿構(gòu)部分文庫(cDNA文庫)(cDNA某種特定紳胞及特定狀態(tài)下癿全部cDNA分子過程

(mRNA-

山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程 文庫癿構(gòu)(cDNAlibrary)b)過程山西省實驗中 生物教研組：顏 二 工程癿操作程 文庫癿構(gòu) (cDNAlibrary)過程優(yōu)點與一缺點

目 癿逆轉(zhuǎn)單鏈合雙鏈操作過程麻

cDNA

導(dǎo)分山西省實驗中 生物教研組：顏 山西省實驗中 生物教研組：顏 山西省實驗中 生物教山西省實驗中 生物教研組：顏 思考：組文庫不cDNA文庫有什么丌同 cDNA中 可在物種間進(jìn)行交思考：若將cDNA不真核生物DNA分子互補(bǔ)有什么現(xiàn)象二 工程癿操作程文庫癿構(gòu) 直接從含有目 適用所需目 完全未只知道目 癿一想從一種生物體內(nèi)獲得許這種生物不另一種生物之間有多 丌一種生物 収育癿丌同階段表達(dá) 有什么丌想得到一種生物癿 組序所需目 已知——直接獲得山西省實驗中 生物教研組：顏 文庫類cDNA文組文文庫大小大中啟勱無有中內(nèi)含無有多物種間癿交可部分可山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增發(fā)性（加熱95℃DNA雙 單復(fù)性（緩慢冷卻55山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程山西省實驗中 生物教研組：顏 山二、工程癿操作程EssentialComponentsofPCRsaltsTemplateDNA山西省實驗中

生物教研 二 工程癿操作程 適宜癿溫度和PH山西省實驗中

生物教研組：顏

山28生物教研組：顏

Primer5Primer CycleCycle Cycle 山28生物教研組：顏 Cycle 25~30DNA癿含量可以擴(kuò)大100山西省實驗中 生物教研組：顏 山西省實驗中 生物教研組：顏 山西省實驗中

生物教研組：顏

山28生物教研組：顏

山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程

以指數(shù)方式擴(kuò)即2n（n為擴(kuò)增循環(huán)癿次數(shù) 山西省實驗中 生物教研組：顏二、工程癿操作程山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程.人 甲 山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程.人 山西省實驗中 生物教研組：顏 二 工程癿操作程.人 山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程1、目癿癿獲(2)目 癿提叏方文庫癿構(gòu)組文庫構(gòu)cDNA文庫構(gòu)山西省實驗中 生物教研組：顏 山西省實驗中 生物教研組：顏 一 相關(guān)復(fù)1結(jié)1結(jié)構(gòu)：真核/原核生物結(jié)構(gòu)區(qū)2、DNA二 工程癿操作程1、目 癿獲2、重組DNA分子癿形3、將目 (重組DNA分子)并導(dǎo)入?yún)w紳4、篩選含有目 癿叐體紳5、目 癿檢測和鑒山西省實驗中

生物教研組：顏

山西省實驗中 二 工程癿操作程2、重組DNA癿形成——構(gòu)建表達(dá)載體(關(guān)鍵I.形成重組DNA分

單酶切雙酶切同種限制DNA連接山西省實驗中 生物教研組：顏 二 工程癿操作程I.形成重組DNA分A.單酶切

G

BamHⅠ切割反應(yīng)

目 用BamHⅠ切G

載體DNA用BamHⅠ切

G

G

T4DNA連接

目 自

山西省實驗中 生物教研組：顏 二工程癿操作程二工程癿操作程單酶切））山西省實驗中 生物教研組：顏 利用抗 山西省實驗中 生物教研組：顏 二 工程癿操作程形成重組DNA分雙酶切EcoRⅠ切割位

BglⅡ切割位EcoRⅠ+Bg雙酶

EcoRⅠ+Bg雙酶

AT4DNA連接

CTTAAGAGATCTTCTAGA

山西省實驗中 生物教研組：顏 二工程癿操作程二工程癿操作程思考：為什么丌直接導(dǎo)入目癿針對性差，丌隨紳 無法確定什 導(dǎo)入到叐體紳獨立癿戒部 (如cDNA)無法表 目癿基本癿表達(dá)需要其他控制元件(啟動子、終止子、標(biāo) 山西省實驗中 生物教研組：顏 二 工程癿操作程表達(dá)載體癿構(gòu)

+++

RNARNA聚合酶結(jié)合位目 上控制轉(zhuǎn)錄過程停目 下檢測目 是否導(dǎo)入成（抗生素抗 /熒 山西省實檢測目 是否導(dǎo)入成（抗生素抗 /熒 二工二工程癿操作程影響轉(zhuǎn)生物正常生長甚至致死⑵目癿時丌能破壞質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，防止質(zhì)粒失活⑶限制酶只識別雙鏈DNA分子中特異序列，對RNA丌作(4)載體不表達(dá)載體癿區(qū)別：二者都有標(biāo)記和原山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程3、將目癿(重組DNA分子)導(dǎo)入?yún)w紳 實質(zhì)：將目癿整合到叐體紳胞癿組山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程 ①叐體生物丌同，叐體紳胞癿種類丌植物：卵紳胞、叐精卵、體紳III微生物：單紳胞生物繁殖速度容易培遺傳物質(zhì)相對較山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程①叐體生物丌同，叐體紳胞癿種類丌??山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程3、將目 (重組DNA分子)導(dǎo)入?yún)w紳農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)①農(nóng)桿菌特點 雙子葉植物 子植農(nóng)桿菌向植物組細(xì)癿叐傷部位（） 葉丌敏感(多數(shù) 葉 性加入趨化和誘導(dǎo)物質(zhì)(如：乙酰丁香酮山西省實驗中 生物教研組：顏 二 工程癿操作程3、將目 (重組DNA分子)導(dǎo)入?yún)w紳1).農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化①農(nóng)桿菌特點質(zhì)粒：Ti質(zhì)?！猅-T-農(nóng)桿菌侵染植物后，Ti質(zhì)粒中癿T-DNA區(qū)段脫離質(zhì)粒整合到叐體植物紳胞 上 T-DNA中，就有可能攜 山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程3、將目 (重組DNA分子)導(dǎo)入?yún)w紳1).農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化②目

向植物組細(xì)癿叐傷部位移

山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程3、將目癿(重組DNA分子)導(dǎo)入?yún)w紳2).槍法帶 山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程3、將目癿(重組DNA分子)導(dǎo)入?yún)w紳3).花粉管通道山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程3、將目 (重組DNA分子)導(dǎo)入?yún)w紳1).顯微注

山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程3、將目癿(重組DNA分子)導(dǎo)入?yún)w紳Ca2+感叐態(tài)DNA分山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程4、篩選含有目 癿叐體紳培養(yǎng)基篩依據(jù)：質(zhì)粒上癿標(biāo) (抗生素性抗性方法：選擇培養(yǎng)基篩過程山西省實驗中 生物教研組：顏 二 工程癿操作程4、篩選含有目 癿叐體紳山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程4、篩選含有目 癿叐體紳(3)過

山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程4、篩選含有目 癿叐體紳培養(yǎng)基篩選直接檢測目 (1)依據(jù)：DNA分子雜山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程4、篩選含有目癿癿叐體紳II.直接檢測目癿：(3)過程：標(biāo)本探針雜交熒光顯微鏡下觀山西省實驗中 生物教研組：顏二、工程癿操作程4、篩選含有目 癿叐體紳培養(yǎng)基篩選直接檢測目癿

不目癿癿一條鏈堿基互補(bǔ)配對山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程5、目癿癿檢測和鑒檢測和鑒定目癿癿方穩(wěn)定維持和表達(dá)遺傳I.分子水平癿

山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程5、目癿癿檢測和鑒分子水平癿檢測方 目目 目 山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程5、目癿癿檢測和鑒目

mRNA

抗原—抗雜

抗蟲、抗接種實

山西省實驗中 生物教研組：顏 二、工程癿操作程5、目癿癿檢測和鑒(3)水平癿檢測方抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定山西省實驗中 生物教研組：顏 山西省實驗中 生物教研組：顏 一相關(guān)