研究課程-分藥學(xué)3章重組dna技術(shù)

重組DNA(binantDNA)技術(shù)是近代分子生物學(xué)技術(shù)的核心。第三章重組DNA技術(shù)-基因工程

一、相關(guān)概念

重組DNA技術(shù)是人類根據(jù)需要選擇目的基因（DNA片段）在體外與基因運(yùn)載體重組，轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞或生物體內(nèi)，以達(dá)到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的。這一技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，關(guān)鍵在于限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。重組DNA技術(shù)，又稱為基因克隆或分子克隆技術(shù)，克隆(clone)---無(wú)性繁殖分子克隆–DNA的無(wú)性繁殖技術(shù)重組DNA技術(shù)包括了一系列的分子生物學(xué)操作步驟?；蚬こ?geneticengineering)所謂基因工程(geneticengineering)就是把外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯表達(dá)的操作叫基因工程?；蚬こ炭墒沽硪环N生物獲得新的遺傳性狀或表達(dá)所需要的產(chǎn)物。二、重組DNA操作一般步驟：1.獲得目的基因；2.與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子；3.用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳；4.對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；5.對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過(guò)培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。獲得需要的目的基因常用的方法：（1）直接從生物體中提取總DNA，構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)，從中調(diào)用目的基因；（2）以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA片段，建立cDNA文庫(kù)；（3）利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）特異性地?cái)U(kuò)增所需要的目的基因片段，等等。（4）化學(xué)合成1.獲得需要的目的基因（外源基因）細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離與基因組文庫(kù)的構(gòu)建例：

細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離程序苯酚沉淀蛋白質(zhì)

基因組DNA及總RNA的提取

動(dòng)物DNA的來(lái)源（核DNA、線粒體DNA、質(zhì)粒DNA）1.血液、毛發(fā)、皮屑（口腔上皮細(xì)胞）、精液、化石及耳朵等活體組織；2.固定和包埋的組織標(biāo)本：脫蠟、蛋白酶K消化

RNA來(lái)源：新鮮組織或細(xì)胞DNA提取方法：常規(guī)苯酚-氯仿方法、試劑盒方法---；RNA提取：所用器皿和試劑必需經(jīng)高溫滅菌或DEPC（焦碳酸二乙酯

）處理GenomeDNATotalRNA

紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA溶液的純度和濃度。

基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建將總DNA經(jīng)過(guò)酶解，經(jīng)蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝膠電泳分離不同長(zhǎng)短的DNA片段。包含的基因組片段分別克隆在質(zhì)?；蚴删w載體上，轉(zhuǎn)染細(xì)菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基因組文庫(kù)。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建mRNA

反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補(bǔ)DNA）第二條DNA鏈

反轉(zhuǎn)錄人工合成互補(bǔ)DNA,cDNA構(gòu)建基因文庫(kù)獲取目的基因存在的問(wèn)題——

費(fèi)時(shí)費(fèi)事 內(nèi)含子序列反轉(zhuǎn)錄人工合成互補(bǔ)DNA方法的優(yōu)勢(shì)——獲取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因

PCR技術(shù)的發(fā)明PCR的發(fā)明是DNA操作技術(shù)的革命美國(guó)Mullis教授開(kāi)汽車時(shí)的聯(lián)想

逶迤崎嶇的山路——DNA雙螺旋行駛的汽車——一小段DNA引物

……

1988年發(fā)明了PCR技術(shù)

1993年獲得諾貝爾獎(jiǎng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）定義：PCR技術(shù)就是在體外，通過(guò)酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增（包括分離）一段目的基因的技術(shù)。反應(yīng)物：加入4種物質(zhì)：（1）作為模板的DNA序列；10XPCR緩沖液（2）與被分離的目的基因兩條鏈各自5’端序列相互補(bǔ)的

DNA引物（20個(gè)左右堿基的短DNA單鏈）；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）；（5）無(wú)菌蒸餾水。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理（PCR）變性、退火、延伸三步曲變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA（93℃-96℃）退火：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合（55℃-65℃）

延伸：以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈（72℃）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）每一輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可使目的基因片段增加一倍30輪循環(huán)可獲得——230（1.07×109)個(gè)基因片段PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 討論1：為何酶促反應(yīng)需要那么高的溫度為了確保模板是單鏈，尤其是第一次反應(yīng)的模板防止非特異性的引物退火延伸的溫度必須大于退火溫度，而小于變性溫度

DNA聚合酶不能熱變性，所以選用耐高溫的聚合酶

常規(guī)用的PCRDNA聚合酶是從一種嗜熱細(xì)菌分離出來(lái)的DNA聚合酶。酶活性在1000C條件下，能保持幾個(gè)小時(shí)。而其最適合酶促溫度在720C左右。

討論2：影響PCR質(zhì)量的一些因素模板:選用純度較高的DNA作模板，雜質(zhì)蛋白和RNA的存在都會(huì)影響到DNA聚合酶與引物和模板的結(jié)合。目的片斷：目的片斷或者目的片斷相鄰的DNA含GC量較高，或者有重復(fù)序列存在，都會(huì)導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在?？稍诜磻?yīng)體系里加入DMSO，破壞模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物的設(shè)計(jì)：引物太短，要求退火的溫度就低，錯(cuò)配的可能性就大，再者，兩條引物不能存在較長(zhǎng)的互補(bǔ)斷。酶：純度、可信度，堿基錯(cuò)配率<1/10000。

PCR技術(shù)的發(fā)展逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)巢式PCR反向PCR差示PCR（DD-PCR)單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR(SSCP-PCR)原位PCR不對(duì)稱PCR兼并引物PCR免疫-PCR(immuno-PCR)MSP甲基化特異PCR基因重組和克隆操作最重要的工具是：（1）限制性內(nèi)切酶（2）載體（3）宿主菌微量的目的基因必須經(jīng)過(guò)基因克隆獲得大量的拷貝后，才能實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的重組、轉(zhuǎn)化和表達(dá)等操作。2.構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA和基因克隆

（1）限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶是從細(xì)菌中分離提純的核酸內(nèi)切酶，可以識(shí)別并切開(kāi)核酸序列特定位點(diǎn)——分子手術(shù)刀Arber、Smith和Nathans因?yàn)樵诎l(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶方面開(kāi)創(chuàng)性工作而共同獲得了1978年的諾貝爾獎(jiǎng)。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶

分子刀-DNA限制性內(nèi)切酶種類根據(jù)其來(lái)源命名。如：

屬名菌株名

EcoRI

種名編號(hào)EcoRI來(lái)源于大腸桿菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。識(shí)別特定的核苷酸序列4~6個(gè)堿基對(duì)形成粘性末端或平端（1）限制性內(nèi)切酶EcoRI特異識(shí)別GAATTC及其互補(bǔ)堿基組成的雙鏈片段粘性末端T4連接酶酶切原理重組DNA的操作

基因體外重組TheformationofabinantDNAmolecule2.載體（Vector）

載體是運(yùn)送目的基因片段進(jìn)入宿主細(xì)胞,并能自我復(fù)制和增殖的工具，載體具以下特征：（1）分子量小，便于攜帶較大的DNA片段，能進(jìn)入宿主細(xì)胞并在其中增殖；（2）有多種限制酶切點(diǎn)，每種限制酶最好只有單一切點(diǎn)；（3）被切割后的載體，插入外源DNA后，不影響其復(fù)制能力，并有可選擇的標(biāo)記基因（如，抗藥基因）（4）細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高目前最常用的載體包括細(xì)菌質(zhì)粒、l噬菌體、cosmid質(zhì)粒等。

質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞中自然存在于染色體外可以自主復(fù)制的一段環(huán)狀DNA分子。進(jìn)入到宿主細(xì)胞中的一個(gè)質(zhì)粒可以大量增加其拷貝數(shù)。質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒，載體質(zhì)粒質(zhì)粒載體

的一般結(jié)構(gòu)

3、重組DNA轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增（以大腸桿菌為例）

根據(jù)重組DNA時(shí)所采用的載體性質(zhì)不同，導(dǎo)入重組DNA分子有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和感染等不同手段。

1.轉(zhuǎn)化：以質(zhì)粒為載體，將攜帶外源基因的載體DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。

2.轉(zhuǎn)染：以噬菌體為載體，用DNA連接酶使噬菌體DNA環(huán)化，再通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入受體菌。

3.感染：以噬菌體為載體，在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，使其感染受體菌。宿主菌或受體細(xì)胞大腸桿菌（例）酵母昆蟲(chóng)細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）經(jīng)一定方法處理(如用CaCl2，電擊法等處理)后細(xì)胞的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞植物遺傳轉(zhuǎn)化常用的方法(了解)載體法轉(zhuǎn)化——農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（Ti質(zhì)粒）基因的直接轉(zhuǎn)移（1）高壓電脈沖電激穿孔（2）基因槍法（3）微注射法

感受態(tài)細(xì)胞和重組基因的導(dǎo)入（轉(zhuǎn)化）．制備感受態(tài)細(xì)胞，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞；

pUC118質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)整合在lacZ基因中，該位點(diǎn)如果沒(méi)有插入外源目的基因，lacZ基因便可表達(dá)出半乳糖苷酶，如果平板培養(yǎng)基中含有X-gal（半乳糖苷酶的底物），便會(huì)被半乳糖苷酶水解成蘭色，大腸桿菌形成藍(lán)色克隆。在多克隆位點(diǎn)插入外源目的基因，破壞了lacZ基因的結(jié)構(gòu)，大腸桿菌形成白色的克隆4、轉(zhuǎn)化子的