DNA重組技術(shù)的基本工具概述

基因工程第一節(jié)：DNA重組技術(shù)的基本工具

?？h一中劉秀榮據(jù)WTO調(diào)查：2004年全世界因狂犬病致死人數(shù)約5.5萬(wàn)人

中國(guó)衛(wèi)生部通報(bào)：2004年７月，狂犬病列法定報(bào)告?zhèn)魅静∷劳鰯?shù)之首。發(fā)病死亡率近100%.能產(chǎn)生狂犬病抗體蛋白的轉(zhuǎn)基因植物基因工程的概念

基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人類(lèi)需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫DNA重組技術(shù)。基因工程的別名DNA重組技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對(duì)象基因操作水平DNA分子水平基本過(guò)程剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)結(jié)果人類(lèi)需要的基因產(chǎn)物或性狀概念分析：?jiǎn)栴}探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲(chóng)害的抗蟲(chóng)棉。

想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲(chóng)棉普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲(chóng)基因棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)上述培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟是什么？重組DNA導(dǎo)入形成基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程基因工程培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：形成重組DNA關(guān)鍵步驟三：重組DNA導(dǎo)入受體(棉花)細(xì)胞1.1DNA重組技術(shù)的基本工具關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：形成重組DNA關(guān)鍵步驟三：重組DNA導(dǎo)入受體(棉花)細(xì)胞“分子手術(shù)刀”——

限制性核酸內(nèi)切酶“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運(yùn)輸車(chē)”——

基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子手術(shù)刀”——

限制性核酸內(nèi)切酶⒈主要來(lái)源：2.種類(lèi)與命名：3.作用：4.作用結(jié)果：主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的一類(lèi)酶。約4000種識(shí)別特定的核苷酸序列，斷裂磷酸二酯鍵。形成粘性末端或平末端尋根問(wèn)底底你能推測(cè)測(cè)限制酶酶存在于于原核生生物中的的作用是是是什么么嗎？原核生物物易受自自然界外外源DNA的入侵，，但生物物在長(zhǎng)期期的進(jìn)化化過(guò)程中中形成了了一套完完善的防防御機(jī)制制，以防防止外來(lái)來(lái)病原物物的侵害害。限制制酶就是是細(xì)菌的的一種防防御性工工具，當(dāng)當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，，會(huì)利用用限制酶酶將外源源DNA切割掉，，以保證證自身的的安全。。所以，，限制酶在在原核生生物中主主要起到到切割外外源DNA、使之失失效，從從而達(dá)到到保護(hù)自自身的目目的。goback現(xiàn)在已經(jīng)經(jīng)從約300種微生物物中分離離出約4000種限制性性?xún)?nèi)切酶酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質(zhì)沙雷雷氏桿菌菌（Serratia大腸桿菌菌（EscherichiacoliR）練習(xí)：流流感嗜血血桿菌的的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分分離到3種限制酶酶，則分分別命名名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ限制酶的的識(shí)別序序列：能被限制制性?xún)?nèi)切切酶特異異性識(shí)別別的切割割部位都都具有回文序列列：在切割部部位，一一條鏈正向讀的堿基基順序與與另一條條鏈反向讀的順序序完全一致。限制性核核酸內(nèi)切切酶作用用的是DNA分子中的的什么鍵鍵？磷酸二酯酯鍵即脫氧核核糖、磷磷酸之間間的連接接ATGGCATCTTCGAAGP

APAGGobackEcoRⅠ黏性末端端黏性末端端什么叫黏黏性末端端？被限制酶酶切開(kāi)的的DNA兩條單鏈鏈的切口口，帶有有幾個(gè)伸出的核核苷酸，它們之之間正好好互補(bǔ)配對(duì)對(duì)，這樣的的切口叫叫黏性末端端。SmaⅠⅠ平末端平平末端限制酶DNA解旋酶區(qū)別限制酶與與DNA解旋酶的的區(qū)別切割特定定的核苷苷酸序列列的磷酸酸二酯鍵鍵將DNA兩條鏈的的氫鍵打打開(kāi)形成成兩條單單鏈限制酶DNA水解酶區(qū)別限制酶與與DNA水解酶的的區(qū)別切割特定的核核苷酸序序列的磷磷酸二酯酯鍵，形成片片段的DNA.（雙鏈））切割磷酸酸二酯鍵鍵，形成成單個(gè)的的脫氧核核苷酸。。目的基因因所在DNA片段載體DNA片段EcoRⅠEcoRⅠDNA連接酶1.作用:把切下來(lái)來(lái)的DNA片段拼接接成新的的DNA.2.作用原理理：催化磷酸二酯酯鍵形成3.種類(lèi)：⑴E·coliDNA連接酶⑵T4DNA連接酶“分子縫合合針”——DNA連接酶可把黏性性末端之之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·coliDNA連接酶或或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限限制酶切切開(kāi)的兩兩個(gè)核苷苷酸之間間的磷酸酸二酯鍵鍵DNA連接酶與T4DNA連接酶酶還可把把DNA連接酶DNA聚合酶連接DNA鏈連接部位相同點(diǎn)雙鏈單鏈在兩DNA片段之間形將單個(gè)核苷酸酸加到已存在的核核酸片段的3’末端的羥基上，形成成磷酸二酯鍵都能形成磷酸酸二酯鍵二者都是蛋白白質(zhì)類(lèi)化合物物嘗試寫(xiě)出下列列序列受EcoRI限制酶作用后后的黏性末端端CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATT“分子運(yùn)輸車(chē)”——基因進(jìn)入受體體細(xì)胞的載體體1.作用：2.條件：3.種類(lèi)：質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生生物和動(dòng)植物物病毒等。將外源基因送送入受體細(xì)胞胞。⑴有1~多個(gè)限制酶切切點(diǎn)⑵對(duì)受體細(xì)胞胞無(wú)害⑶使導(dǎo)入基因因能在受體細(xì)胞胞中復(fù)制、表表達(dá)⑷有某些標(biāo)記基基因，便于篩篩選⑶假如目的基基因?qū)胧荏w體細(xì)胞后不能能復(fù)制或不能能轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基基因生物能有有預(yù)想的效果果嗎？⑴作為分子運(yùn)運(yùn)輸車(chē)——載體，如果沒(méi)沒(méi)有切割位點(diǎn)點(diǎn)將會(huì)怎樣？？⑵霍亂菌的質(zhì)質(zhì)粒多個(gè)限制制酶切點(diǎn)，你你會(huì)用它來(lái)做做分子運(yùn)輸車(chē)車(chē)嗎？⑷目的基因有有沒(méi)有進(jìn)入受受體細(xì)胞，如如何去發(fā)現(xiàn)？？作為載體的必必要條件:Goback質(zhì)粒的特點(diǎn)：：是一種裸露的的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單單、獨(dú)立于細(xì)細(xì)菌擬核DNA分子外并能自我復(fù)制的小型雙鏈環(huán)狀DNA分子。能復(fù)制并帶著著插入的目的的基因一起復(fù)復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的的存在，將來(lái)來(lái)可用含青霉霉素的培養(yǎng)基基鑒別?；蚬こ痰墓ぞ呦拗泼钢饕嬖谟谠松镏芯哂袑?zhuān)一性(識(shí)別序列)切開(kāi)DNA分子的磷酸二二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯酯鍵種類(lèi)E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶載體具備的條件質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物物、動(dòng)植物病病毒種類(lèi)能自我復(fù)制有一個(gè)或多個(gè)個(gè)酶切割位點(diǎn)點(diǎn)有標(biāo)記基因?qū)κ荏w細(xì)胞無(wú)無(wú)害思考與探究P72、為什么限制酶酶不剪切細(xì)菌菌本身的DNA？通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)進(jìn)化，細(xì)菌中中含有某種限限制酶的細(xì)胞胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的的識(shí)別切割序列列；或者通過(guò)甲甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使使限制酶不能將將其切開(kāi)。這樣，盡管管細(xì)菌中含有有某種限制酶酶也不會(huì)使自自身的DNA被切斷，并且且可以防止外外源DNA的入侵。3、天然的DNA分子可以直接接用做基因工工程載體嗎？？為什么？提示：基因工程中作作為載體使用用的DNA分子很多都是是質(zhì)粒（plasmid），即獨(dú)立于于細(xì)菌擬核染染色體DNA之外的一種可可以自我復(fù)制制、雙鏈閉環(huán)環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒粒都可以作為為基因工程載載體使用呢？？不是，作為基基因工程使用用的載體必需需滿(mǎn)足以下條條件：思考與探究P71）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限限制酶的切割位點(diǎn)，，以便目的基基因可以插入入到載體上去去。這些供目目的基因插入入的限制酶的的切點(diǎn)所處的的位置，還必必須是在質(zhì)粒本身需需要的基因片片段之外，這樣才不至至于因目的基基因的插入而而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能能力，或整合到受受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)復(fù)制。3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因因，以便重組后后進(jìn)行重組子子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體體細(xì)胞有害，，或不能進(jìn)入入到除受體細(xì)細(xì)胞外的其他他生物細(xì)胞中中去。5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和和在體外進(jìn)行行操作，太大大就不便操作作。實(shí)際上自然存存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全全具備上述條條件，都要進(jìn)進(jìn)行人工改造造后才能用于于基因工程操操作。4、DNA連接酶有連接接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？迄今為止，所所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于于原因，現(xiàn)在在還不清楚，，也許將來(lái)會(huì)會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連連接單鏈DNA的酶。思考與探究P71)不屬于質(zhì)粒被被選為基因運(yùn)運(yùn)載體的理由由是A、能復(fù)制（（））B、有多個(gè)限制制酶切點(diǎn)C、具有標(biāo)記基基因D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)2）有關(guān)基因工工程的敘述中中，正確的是是（））A、所有的限制制酶只能識(shí)別別一種特定的的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因因工程中唯一一的載體C、載載體體必必須須具具備備的的條條件件之之一一是是：：具具有有多個(gè)個(gè)限限制制酶酶切切點(diǎn)點(diǎn)，，以以便便與與目目的的基基因因連連接接D、DNA連接接酶酶使使黏黏性性末末端端的的堿堿基基之之間間形成成氫氫鍵鍵C練習(xí)習(xí)3）同同一一種種限限制制酶酶切切割割成成的的黏黏性性末末端端是是A.①②②B.①③③C.①④④D.②③③A（10江蘇蘇卷卷））4.下表表中中列列出出了了幾幾種種限限制制酶酶識(shí)識(shí)別別序序列列及及其其切切割割位位點(diǎn)點(diǎn)，，圖圖l、圖圖2中箭箭頭頭表表示示相相關(guān)關(guān)限限制制酶酶的的酶酶切切位位點(diǎn)點(diǎn)。。請(qǐng)請(qǐng)回回答答下下列列問(wèn)問(wèn)題題：：（1）一一個(gè)個(gè)圖圖1所示示的的質(zhì)質(zhì)粒粒分分子子經(jīng)經(jīng)SmaⅠⅠ切割割前前后后，，分分別別含含有有▲個(gè)游游離離的的磷磷酸酸基基團(tuán)團(tuán)。。（2）若若對(duì)對(duì)圖圖中中質(zhì)質(zhì)粒粒進(jìn)進(jìn)行行改改造造，，插插入入的的SmaⅠⅠ酶切切位位點(diǎn)點(diǎn)越越多多，，質(zhì)質(zhì)粒粒的的熱熱穩(wěn)穩(wěn)定定性性越越▲。（1）0、2（2）高高（3）用用圖圖中中的的質(zhì)質(zhì)粒粒和和外外源源DNA構(gòu)建建重重組組質(zhì)質(zhì)粒粒，，不不能能使使用用SmaⅠⅠ切割割，，原原因因是是▲。（4）與與只只使使用用EcoRI相比比較較，，使