ATCC菌種傳代課件

金葡菌在實際檢測中

常見問題的講解

微球菌科

（Micrococcaceae）

葡萄球菌屬

微球菌屬

口腔球菌屬

游動球菌屬

病原性球菌又稱為化膿性球菌根據(jù)革蘭染色性的不同可分成革蘭陽性：葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌等革蘭陰性：腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等。

伯杰鑒定細(xì)菌學(xué)手冊第9版（1994），葡萄球?qū)倌壳胺譃?2個種及亞種。

葡萄球菌最先由Koch1878）在膿汁中發(fā)現(xiàn)。概述分布廣泛葡萄球菌廣泛分布于自然界，如空氣、土壤及各類物品上。人類和動物是葡萄球菌寄居的場所，主要存在于人的鼻腔和皮膚，在皮膚的毛囊、汗腺及皮脂腺內(nèi)可存活很久。在家畜的皮膚及乳腺等處也常分離到。葡萄球菌可通過這些部位播散到空氣、塵埃及各類物品上。所致疾?。ǔＲ姟⑻厥猓?/p>

金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至賬血癥、膿毒癥等全身感染。近年來，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒越來越多，在美國，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。葡萄球菌與食物的關(guān)系：對于食物的污染主要來自人的鼻腔及患有癤腫的人用手去觸摸食品所致。調(diào)查結(jié)果表明，金葡菌對乳制品、肉類、家禽、蔬菜等各類食品，均可造成不同程度的污染。這些污染除來自人體外，也可來自動物體。但動物源性的葡萄球菌一般不造成人類的感染。如生肉上分離的菌株多來源于動物體，加工后產(chǎn)品所帶菌株多來源于人體。葡萄球菌與食物的關(guān)系：近年，按照生態(tài)學(xué)及致病性特征將葡萄球菌分為三大類：寄生于人體（腐生葡萄球菌、頭葡萄球菌、人型葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌）、寄生于動物體（家畜葡萄球菌、中間型葡萄球菌）、寄生于人及動物（金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌等）一、生物學(xué)性狀

形態(tài)與染色

葡萄球菌球形或橢圓形，典型排列呈葡萄串狀無鞭毛，無芽胞，體外培養(yǎng)時一般不形成莢膜易被常用的堿性染料著色，革蘭染色為陽性鏈球菌球形或橢圓形，呈鏈狀排列無芽胞。無鞭毛。培養(yǎng)早期（2~4h）形成透明質(zhì)酸的莢膜，有菌毛，含型特異的M蛋白易被普通的堿性染料著色，革蘭染色陽性金黃色葡萄球菌普平板抗原構(gòu)造葡萄球菌A蛋白（staphylococcalproteinA,SPA）莢膜多糖抗原二、致病性金葡感染致病物質(zhì)酶凝固酶、纖維蛋白溶酶、耐熱核酸酶、透明質(zhì)酸酶、脂酶等毒素：細(xì)胞毒素（、、、、殺白細(xì)胞素）、表皮剝脫毒素、毒性休克綜合征毒素-1、腸毒素等其他：粘附素、莢膜、胞壁肽聚糖等凝固酶（coagulase）概念使含有枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑的人或兔血漿發(fā)生凝固的酶類物質(zhì)意義：鑒別有無致病性的重要指標(biāo)致病機理：抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬保護(hù)病菌不受血清中殺菌物質(zhì)的破壞使感染局限化和形成血栓腸毒素（enterotoxin）約1/3臨床分離的金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生腸毒素引起急性胃腸炎即食物中毒作用機制：到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)后刺激嘔吐中樞而導(dǎo)致以嘔吐為主要癥狀的食物中毒表皮剝脫毒素（exfoliativetoxin）表皮剝脫毒素引起的燙傷樣皮膚綜合征（staphylococcalscaldedskinsyndrome,SSSS），又稱剝脫性皮炎，多見于新生兒、幼兒和免疫功能低下的成人具有抗原性，可被甲醛液脫毒成類毒素毒性休克綜合征毒素-1（TSST-1）

TSST-1可引起機體發(fā)熱，增加對內(nèi)毒素的敏感性感染產(chǎn)毒菌株后可引起機體多個器官系統(tǒng)的功能紊亂或毒性休克綜合征（TSS）TSST-1可能不是引起TSS的唯一病因，革蘭陰性桿菌內(nèi)毒素、葡萄球菌腸毒素和溶血素等與TSS的發(fā)病也有密切關(guān)系葡萄球菌對人體的致病作用：葡萄球菌的主要致病物質(zhì)是葡萄球菌腸毒素，它是葡萄球菌的某些菌株在適宜的條件下產(chǎn)生的一種堿性蛋白質(zhì)。到目前為止，已確定有5個血清學(xué)構(gòu)造完全不同的腸毒素：A、B、C、D、E。金葡菌中約有1/3～1/2的菌株具有產(chǎn)生一種或多種型別腸毒素的特性。產(chǎn)毒株在含碳水化合物及蛋白質(zhì)的食品中易產(chǎn)生腸毒素，一般認(rèn)為在37～40℃，pH6.0～8.0等條件下有助于腸毒素產(chǎn)生，如果溫度低于15℃，則不能形成腸毒素。葡萄球菌對人體的致病作用：葡萄球菌腸毒素幾乎是細(xì)菌蛋白質(zhì)類毒素中唯一耐熱者。有實驗證明，金葡菌腸毒素經(jīng)煮沸30～40分鐘后，并未完全破壞，仍能引發(fā)嘔吐。由于該菌的耐熱性，如果食品中原已有大量金葡菌繁殖，并產(chǎn)生了足量的毒素，在加熱處理后，金葡菌已被殺滅，而耐熱腸毒素仍能保持其生物活性。葡萄球菌對人體的致病作用：

實驗證實產(chǎn)生高度核糖核酸酶（RDase)的葡萄球菌80%的菌株產(chǎn)生A型和B型腸毒素。由于核酸酶的檢測方法簡單、快速，具有一定的特異性，故可做為產(chǎn)葡萄球菌腸毒素的間接指標(biāo)。葡萄球菌對人體的致病作用：

在食品中如果有大量產(chǎn)生腸毒素的葡萄球菌生長，就會生成足夠量的腸毒素。當(dāng)人們食入這種食品，就會造成食物中毒。引起食物中毒的多為奶制品、熟肉類以及含淀粉較高的米飯、糕點等。葡萄球菌對人體的致病作用：

關(guān)于嘔吐產(chǎn)生的機制，曾有學(xué)者用猴子進(jìn)行過研究。結(jié)果表明，對猴子催吐作用的部位是在腹部內(nèi)臟感受器，然后將刺激經(jīng)迷走神經(jīng)及交感神經(jīng)傳到嘔吐中樞引起嘔吐。葡萄球菌對人體的致病作用：

B型腸毒素除可引起食物中毒外，已是標(biāo)準(zhǔn)化的失能性生物戰(zhàn)劑。美國學(xué)者曾用B型腸毒素給猴子靜脈注射，動物在5分鐘內(nèi)，心電圖呈現(xiàn)早搏或心律不齊，甚至造成死亡。四、微生物學(xué)檢查法標(biāo)本直接涂片鏡檢分離培養(yǎng)和鑒定葡萄球菌腸毒素檢查1、BP培養(yǎng)基胰蛋白胨10.0g氮源和氨基酸

牛肉粉5.0g氮源和氨基酸

酵母粉1.0gB族維生素

丙酮酸鈉10.0g生長促進(jìn)劑

甘氨酸12.0g生長促進(jìn)劑

氯化鋰5.0g抑制革蘭氏陰性菌生長

瓊脂15.0g凝固劑

蒸餾水950.0mL亞碲酸鉀卵黃增菌液50ml

最終pH7.0±0.2

將各成分加于蒸餾水中,加熱煮沸使完全溶解,冷至25℃,調(diào)至pH7.0±0.2,分裝每瓶95mL,121℃高壓滅菌15min,臨用時加熱溶化瓊脂,冷至50℃左右,于每95mL加入預(yù)熱至50℃的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL,搖勻后傾注平皿培養(yǎng)基,應(yīng)是致密不透明的,使用前在冰箱貯存不得超過48h。

亞碲酸鉀抑制除金黃色葡萄球外的革蘭氏陽性菌生長。卵黃提供營養(yǎng)和有利于觀察卵磷脂環(huán)。卵磷脂酶陽性的金黃色葡萄球菌分解亞碲酸鉀形成黒色菌落，并分解卵磷脂形成一個透明環(huán)。金黃色葡萄球菌的典型特征：

在B-P平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤,直徑2～3mm?；液谏梁谏?有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰帶(卵磷脂環(huán))。當(dāng)用接種針觸及菌落時具有黃油樣粘稠感。有時可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈和清晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺些,且外觀可能較粗糙,質(zhì)地較干燥。

在BP平板上的典型菌落致病性葡萄球菌的鑒定凝固酶（+）：取培養(yǎng)后肉浸液肉湯培養(yǎng)基及空白肉浸液肉湯培養(yǎng)基各0.5ml加入溶解后凍干兔血漿0.5ml的小試管中，振蕩搖勻，置37℃溫箱內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6小時，如出現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽性結(jié)果。陽性、陰性對照。觸酶試驗（+）：取營養(yǎng)瓊脂平板上單個菌落于干凈的玻片上，滴加8%H2O2溶液1滴，有氣泡出現(xiàn)。致病性葡萄球菌的鑒定耐熱核酸酶（+）：將檢測菌的過夜培養(yǎng)肉湯沸水浴15分鐘后，加進(jìn)甲苯胺藍(lán)核酸瓊脂上已打好的直徑為2-5mm的孔內(nèi)，置35℃孵育，每一小時觀察結(jié)果。環(huán)繞孔周的蘭色瓊脂轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色為陽性。金黃色色素（+）溶血性（+）：金黃色或白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。發(fā)酵甘露醇（+）：凝固酶陽性葡萄球菌的鑒別

金黃色中間型希氏葡萄球菌葡萄球菌葡萄球菌

結(jié)合型血漿凝固酶+-+游離型血漿凝固酶++-PYR試驗*-++耐熱核酸酶+++V-P試驗+-+鳥氨酸脫羧酶試驗---PYR試驗：鑒定產(chǎn)生吡咯烷酮芳基酰胺酶的細(xì)菌三種葡萄球菌的主要生物學(xué)性狀葡萄球菌的鑒定半自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，是由微量生化檢測系統(tǒng)發(fā)展而來。其原理也是將各種不同的生化反應(yīng)組成專一鑒定試劑條(或板)。經(jīng)培養(yǎng)后用光電讀數(shù)器自動讀數(shù)，將數(shù)據(jù)自動傳送到計算機，由計算機分析處理，并打印結(jié)果分析報告。這一類的鑒定系統(tǒng)主要有：ATB(法國梅里埃公司)、BIOLOG(美國BIOLOG)等，半自動微生物鑒定系統(tǒng)除了鑒定微生物外，也可進(jìn)行藥敏試驗。每一系統(tǒng)都有其分析特點，用戶可根據(jù)需要選用。金黃色葡萄球菌2．流行病學(xué)分型技術(shù)血清學(xué)分型：絕大多數(shù)金黃色葡萄球菌含A型多糖抗原，漿凝固酶陰性的菌株含B型多糖抗原，而致病與非致病的菌株均含有C型多糖抗原。噬菌體分型：根據(jù)國際小組第6次會議通過的金黃色葡萄球菌噬菌體分為4個群23個型，生產(chǎn)腸毒素引起食源性疾病的菌株主要是Ⅲ群與Ⅳ群。腸毒素分型：將分離獲得的菌株使用產(chǎn)毒培養(yǎng)基，采用透析膜培養(yǎng)方法進(jìn)行產(chǎn)毒培養(yǎng)，并將獲得的培養(yǎng)液進(jìn)行濃縮提純后可按《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗GB/T4789.10-2003》方法進(jìn)行腸毒素的測定。脈沖場電泳（PFGE）分子分型：Hennekinne等（2003年）對73株不同來源的金黃色葡萄球菌（屬于八個生物型），進(jìn)行Smal-PFGE分型，結(jié)果有61個PFGE分型模式。PFGE對辨別金黃色葡萄球菌是有效的，并且比生化分型法有更強的辨別力。1在一些檢測試驗中，會有溶血試驗，

β-溶血環(huán)的現(xiàn)象是什么？甲型溶血性鏈球菌：稱甲型溶血或溶血，溶血環(huán)中的紅細(xì)胞并未完全溶解。多為條件致病菌。（肺炎鏈球菌）乙型溶血性鏈球菌：稱乙型溶血或溶血，溶血環(huán)中的紅細(xì)胞完全溶解，致病力強。丙型鏈球菌：無溶血環(huán)，一般不致病。鏈球菌按多糖抗原，可分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S和T群，近年又增加U、V群，共20群。對人致病的鏈球菌菌株，90%左右屬A群。鏈球菌的群別與溶血性間無平行關(guān)系，但對人類致病的A群鏈球菌多數(shù)呈現(xiàn)乙型溶血2對于副溶血型弧菌的檢測，如果只要求檢測是否存在，而不要求得出MPN值的話，可否象沙門氏菌的檢測一樣，直接進(jìn)行前增菌和選擇性增菌？如果可以，是否有規(guī)可依？可有參考步驟？

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗副溶血性弧菌檢驗GB/T4789.0