煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院全日制普通本科生畢業(yè)論文煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立Genetictransformationsystemfortobacco學(xué)生姓名：索尼克學(xué)號(hào)：200741632年級(jí)專業(yè)及班級(jí)：2007級(jí)動(dòng)植物檢疫（3）班指導(dǎo)老師及職稱：譚新球博士生導(dǎo)師學(xué)院：生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院湖南·長(zhǎng)沙提交日期：2011年6月湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院全日制普通本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）誠(chéng)信聲明本人鄭重聲明：所呈交的本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）是本人在指導(dǎo)老師的指導(dǎo)下，進(jìn)行研究工作所取得的成果，成果不存在知識(shí)產(chǎn)權(quán)爭(zhēng)議。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文（設(shè)計(jì)）不含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體在文中均作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）作者簽名：年月日煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立學(xué)生：指導(dǎo)老師：(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，長(zhǎng)沙410128)摘要：煙草是植物轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)最成熟的植物之一。而農(nóng)桿菌介導(dǎo)(AgrobacteriunOmediated)的間接轉(zhuǎn)化方法已成為目前主要的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，煙草也成為植物遺傳轉(zhuǎn)化研究的模式植物。關(guān)鍵詞：煙草；轉(zhuǎn)化；農(nóng)桿菌；體系；前言煙草與植物轉(zhuǎn)基因的概念煙草是植物轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)最成熟的植物之一。1985年，Horsch等[1]用煙草葉片作為根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染對(duì)象，獲得轉(zhuǎn)基因的煙草植株，并首創(chuàng)了簡(jiǎn)單高效，且易于采納的葉盤(pán)法。而農(nóng)桿菌介導(dǎo)(AgrobacteriunOmediated)的間接轉(zhuǎn)化方法已成為目前主要的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，煙草也成為植物遺傳轉(zhuǎn)化研究的模式植物[2]。轉(zhuǎn)基因植物的研究主要在于改進(jìn)植物的品質(zhì)，改變生長(zhǎng)周期或花期等提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值或觀賞價(jià)值；作為某些蛋白質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物的生物反應(yīng)器，進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)；研究基因在植物個(gè)體發(fā)育中，以及正常生理代謝過(guò)程中的功能。以植物作為生物技術(shù)的實(shí)驗(yàn)材料有其特定的優(yōu)點(diǎn)，那就是植物細(xì)胞大部分都有全能性(t-otipotency)，可以用單個(gè)細(xì)胞分化發(fā)育出整個(gè)植株。這樣，經(jīng)過(guò)基因工程改造的單個(gè)植物細(xì)胞有可能再生成一棵完整的轉(zhuǎn)基因植株。這些植株還可通過(guò)有性生殖過(guò)程把改變了的性狀遺傳給下一代。植物基因工程用作外源基因的轉(zhuǎn)化受體有許多種，包括胚性愈傷組織(cai-lus)、分生細(xì)胞、幼胚、成熟胚、受精胚珠、種子和原生質(zhì)體等。從這些受體細(xì)胞都可獲得再生的轉(zhuǎn)基植株。而植物基因轉(zhuǎn)化方法主要有：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、直接轉(zhuǎn)入法、原生質(zhì)體融合、花粉管通道法等。本文主要是以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法來(lái)轉(zhuǎn)化煙草。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)?？梢宰鳛檩d體。在Ti質(zhì)粒上有兩個(gè)區(qū)域，一個(gè)是T-DNA區(qū)，這是能夠轉(zhuǎn)移并整合進(jìn)植物受體的區(qū)段；另一個(gè)是Vir區(qū)，它編碼實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移所需的蛋白質(zhì)。將待轉(zhuǎn)化的外源基因先克隆在大腸桿菌質(zhì)粒上，然后將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入不會(huì)引起冠癭瘤的農(nóng)桿菌(這種菌的Ti質(zhì)粒已除去了T-DNA)，使外源基因通過(guò)同源重組整合在Ti質(zhì)粒上；然后用帶有外源基因的這種農(nóng)桿菌去轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，將外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的基因組。近代中國(guó)轉(zhuǎn)基因植物研究與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展迅速，在國(guó)家“863”高新技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃及國(guó)家科技攻關(guān)計(jì)劃的資助下，我國(guó)轉(zhuǎn)基因植物的研究和開(kāi)發(fā)取得了顯著的進(jìn)展，有些研究已經(jīng)達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。據(jù)1996年國(guó)生物技術(shù)學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)投入研究和開(kāi)發(fā)的轉(zhuǎn)基因植物達(dá)47種，涉及各類基因103種。近年來(lái)有近20種轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入了田間試驗(yàn)或環(huán)境釋放階段。至1999年，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)可進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)的國(guó)內(nèi)研制的轉(zhuǎn)基因植物有5種，它們分別是：抗蟲(chóng)棉花、改變花色的矮牽牛、延熟番茄、抗病毒的甜椒和番茄。在植物抗蟲(chóng)基因工程方面：在國(guó)家“863”計(jì)劃的支持下，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所成功地人工合成和改造了植物抗蟲(chóng)害的Bt基因，獲得了高抗棉鈴蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因棉花品種和品系。此外，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花所、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)和山西省農(nóng)科院棉花所等單位還以轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉為親本，育成了一批抗蟲(chóng)能力在80％以上，單產(chǎn)比主栽品種高15％以上的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)雜交棉組合。擁有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗蟲(chóng)棉花的育成和大面積推廣應(yīng)用，標(biāo)志著我國(guó)轉(zhuǎn)基因植物研究開(kāi)始進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化發(fā)展階段。為了有效控制水稻害蟲(chóng)的危害，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)合作成功地獲得了轉(zhuǎn)Bt基因雜交水稻，對(duì)二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟的毒殺效果達(dá)到95％。浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)（現(xiàn)已并入浙江大學(xué)）也成功地將Bt基因?qū)胨驹绲酒贩N。目前轉(zhuǎn)Bt基因抗螟蟲(chóng)水稻已進(jìn)入環(huán)境釋放階段。中國(guó)科學(xué)院遺傳所研制成功的轉(zhuǎn)ＣpTI基因抗蟲(chóng)水稻也分別獲準(zhǔn)在北京、福建和山西進(jìn)入中間試驗(yàn)和環(huán)境釋放。此外，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)研制的轉(zhuǎn)基因抗玉米螟玉米、復(fù)旦大學(xué)遺傳所研制的轉(zhuǎn)基因抗褐習(xí)虱水稻、中國(guó)科學(xué)院微生物研究所和中國(guó)林業(yè)科學(xué)院林研所研制的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)也都進(jìn)入環(huán)境釋放階段。在抗病基因工程方面：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所已成功地人工合成和改造了來(lái)自天蠶蛾的抗菌肽基因，并導(dǎo)入我國(guó)馬鈴薯主栽品種米拉，獲得抗病性提高Ⅰ—Ⅲ級(jí)的抗青枯病的轉(zhuǎn)基因株系，現(xiàn)已經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)在四川省進(jìn)行環(huán)境釋放。目前抗菌肽基因已經(jīng)供給國(guó)內(nèi)10多家研究單位，進(jìn)行抗水稻白葉枯病、馬鈴薯軟腐病、花生和番茄的青枯病、大白菜軟腐病、柑桔細(xì)菌性潰瘍病、桑樹(shù)和桉樹(shù)青枯病、櫻桃根腫病等抗細(xì)菌病基因工程研究。白葉枯病也是危害水稻生產(chǎn)的最為嚴(yán)重的病害之一。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所與國(guó)外合作研制成功的轉(zhuǎn)Xa21基因抗白葉枯病水稻明恢63株系已分別在安徽省和海南省進(jìn)行環(huán)境釋放；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院遺傳所研制的轉(zhuǎn)Xa21基因抗白葉枯病水稻也分別進(jìn)入中試階段。真菌病也是嚴(yán)重影響農(nóng)作物生產(chǎn)的一類病害。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所與中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所等單位合作，成功地克隆和修飾了植物來(lái)源的幾丁質(zhì)酶基因和葡萄糖氧化酶基因，通過(guò)花粉管通道法分別將這兩個(gè)基因?qū)朊藁?，獲得了抗黃萎病和枯萎病和枯萎的轉(zhuǎn)基因棉花，這些株系在病圃中表現(xiàn)良好，現(xiàn)已進(jìn)入中試階段。在抗病毒的基因工程方面:國(guó)內(nèi)也取得了很好的進(jìn)展。北京大學(xué)克隆了煙草花葉病毒CMV、黃瓜花葉病毒CMV、馬鈴薯X病毒等中國(guó)株系以及水稻矮縮病毒的外殼蛋白基因，研制成功的抗黃瓜花葉病毒甜椒和番茄都已經(jīng)分別在云南和福建進(jìn)入中試或環(huán)境釋放。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料研究所研制的轉(zhuǎn)基因抗條紋病毒花生、北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心育成的抗蕪菁花葉病毒白菜和新疆農(nóng)科院核技術(shù)生物技術(shù)所獲得的抗黃瓜花葉病毒轉(zhuǎn)基因甜瓜都已分別進(jìn)入中試。此外，國(guó)內(nèi)一些研究單位還獲得了抗環(huán)斑病毒（PRSV）的番木瓜，抗黃矮病和黃花葉病毒的小麥等抗病毒病的基因工程植株。植物抗逆基因工程我國(guó)在抗鹽基因工程上已取得了一些進(jìn)展，先后克隆了脯氨酸合成酶（proA），山菠菜堿脫氫酶（BADH），磷酸甘露醇脫氫酶（mtl）及磷酸山梨醇脫氫酶（gutD）等與耐鹽相關(guān)基因，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得了而1％NACL的苜蓿、耐0.8％NACL的草莓及耐2％NACL的煙草，這些轉(zhuǎn)基因植物已進(jìn)入田間試驗(yàn)階段。中國(guó)科學(xué)院遺傳所將BADH基因?qū)胨荆@得的轉(zhuǎn)基因水稻有交較高的耐鹽性，并能在鹽田中結(jié)實(shí)。植物品質(zhì)改良的基因工程北京大學(xué)已將編碼必需氨基酸的基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，獲得含高必需氨基酸的馬鈴薯品系，這些品系已在內(nèi)蒙試種，正準(zhǔn)備進(jìn)入中試開(kāi)發(fā)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)成功地將高賴氨酸基因?qū)胗衩?，獲得的轉(zhuǎn)基因玉米中賴氨酸含量比對(duì)照提高10％。在控制植物發(fā)育的基因工程中，較為成熟的技術(shù)延遲成熟番茄的研究。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國(guó)科學(xué)院植物所分別獲得了這種轉(zhuǎn)基因番，貯存時(shí)間可延長(zhǎng)1-2個(gè)月，有的可達(dá)80多天。1997年農(nóng)業(yè)部基因工程安全委員會(huì)已批準(zhǔn)這種耐儲(chǔ)存番茄進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)利用反義基因技術(shù)培育的耐儲(chǔ)存番茄新品種已進(jìn)行環(huán)境釋放。北京大學(xué)成功地將與植物花青素代謝有關(guān)的查而酮合酶基因?qū)牖ɑ苤参锇珷颗?，轉(zhuǎn)基因矮牽牛的花色呈現(xiàn)自然界沒(méi)有的變異，提高了花卉的觀賞價(jià)值。轉(zhuǎn)基因蘭花和轉(zhuǎn)基因非洲菊的研究工作正在進(jìn)行中。植物葉綠體基因工程中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所在國(guó)內(nèi)較早開(kāi)始進(jìn)行植物葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化研究。1996年建立了煙草葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化體系，并成功地將Ｂt基因?qū)霟煵萑~綠體中，轉(zhuǎn)基因植物殺蟲(chóng)效果顯著。他們還將固氮酶基因（nifH和nifM）、抗劑基因（bar基因）和綠色熒光蛋白（GFP）基因?qū)肓藷煵萑~綠體。植物生物反應(yīng)器利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白的研究逐漸受到各國(guó)的重視，研究探索的熱點(diǎn)之一是利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所的科研人員將乙型肝炎病毒表面抗原基因?qū)腭R鈴薯和蕃茄，飼喂小鼠試驗(yàn)檢測(cè)到較高的保護(hù)性抗體，濃度足以對(duì)人類產(chǎn)生保護(hù)作用。該所還進(jìn)行了利用植物葉綠體作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白的探索，目前已將丙肝病毒（HCV）抗原基因?qū)胍略迦~綠體。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗可以大大降低疫苗的生產(chǎn)成本，在發(fā)展中國(guó)家更有良好的發(fā)展前景。材料及原理材料實(shí)驗(yàn)菌種及材料根癌農(nóng)桿菌，本氏煙，三生煙實(shí)驗(yàn)試劑電泳緩沖液，KT激動(dòng)素，潮霉素，頭孢霉素，NAA，電泳緩沖液實(shí)驗(yàn)儀器壓力蒸汽滅菌器LDZX-50FB上海申安醫(yī)療器械廠上皿電子天平JA3003上海精科天平凈化工作臺(tái)SWCJ-A上海新苗醫(yī)療器械制造恒溫培養(yǎng)振蕩器ZHWY-211B上海智城分析儀器制造精密型酸度計(jì)PHS-818貴陽(yáng)學(xué)通儀器儀表電泳儀JY600C北京君意東方電泳設(shè)備凝膠成像分析系統(tǒng)GIS-2008天龍科技（上海）雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)TU-1901北京普析通用儀器培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基（固體）：蔗糖30g/L、PlantAgar0.7%/L、MurashigeandSkoog(MS)4.47g/L，用KOH調(diào)PH至5.7-5.9,121℃滅菌20min.MS培養(yǎng)基（液體）：蔗糖30g/L、MurashigeandSkoog(MS)4.47g/L，PH調(diào)至5.7-5.9,121℃滅菌20min.YEP培養(yǎng)基：酵母提取物10g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCL5g/L，用NaOH調(diào)PH至7.0-7.2，121℃滅菌30min.生根培養(yǎng)基配方：MS固體培養(yǎng)基+Kan100ug/ml+cef/ml.原理感受態(tài)原理：在利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化中，首先要獲得含有目的基因的農(nóng)桿菌工程菌株。在基因工程操作中，感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是一項(xiàng)基本技術(shù)。感受態(tài)是細(xì)菌細(xì)胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態(tài)。農(nóng)桿菌的感受態(tài)可用CaCl2處理而誘導(dǎo)產(chǎn)生。將正在生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌細(xì)胞在加入到低滲的氯化鈣溶液中，0℃下處理便會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，此時(shí)的細(xì)胞呈現(xiàn)出感受態(tài)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理：就是把基因分離克隆出來(lái)，在生物體外進(jìn)行操作，并把它轉(zhuǎn)到一個(gè)目標(biāo)植物中，使這個(gè)目標(biāo)植物獲得新的性狀。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法就是用農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒作為載體。將待轉(zhuǎn)化的外源基因先克隆在大腸桿菌質(zhì)粒上，然后將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入進(jìn)去，使外源基因通過(guò)同源重組整合在Ti質(zhì)粒上。然后用帶有外源基因的這種農(nóng)桿菌去轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，將外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的基因組。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1）農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

（1）挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于3ml的YEB液體培養(yǎng)基（含鏈霉素Sm100ug/ml）中，28°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；

（2）取過(guò)夜培養(yǎng)菌液500ml接種于50mlYEB(Sm100ug/ml)液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5；

（3）5,000rpm,離心5min；

（4）加10ml0.15MNaCl懸浮農(nóng)桿菌細(xì)胞，5,000rpm,離心5min；

（5）1ml預(yù)冷的20mMCaCl2懸浮細(xì)胞，冰浴，分裝成100