基因重組和基因工程

關于基因重組和基因工程第一頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

掌握：基因重組和基因工程的概念，細菌基因轉移的接合作用、轉化作用和轉導作用，DNA克隆、限制性核酸內切酶、基因載體、cDNA文庫、基因組DNA文庫的概念，目的基因的來源，基因載體的類型，重組DNA技術的操作程序。熟悉：同源重組、特異位點的基因重組、轉座重組的概念和基本過程，重組DNA技術的操作步驟。了解：重組DNA技術與醫(yī)學的關系。目的要求第二頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日基因重組(generecombination)

是指DNA片段在細胞內、細胞間，甚至在不同物種之間進行交換，交換后的片段仍然具有復制和表達的功能?；蚬こ?geneticengineering）

是指采用人工方法將不同來源的DNA進行重組，并將重組后的DNA引入宿主細胞中進行增殖和表達的過程。

基本概念第三頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉移是經(jīng)常發(fā)生的

DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequentlyinNature第四頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日DNA重組位點特異的重組(site-specificrecombination)轉座重組(transpositionrecombination)接合作用(conjugation)轉導作用(transduction)同源重組(homologousrecombination)轉化作用(transformation)第五頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組（generalrecombination）。通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。一、同源重組是最基本的DNA重組方式第六頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日Holliday模型的4個關鍵步驟：兩個同源染色體DNA排列整齊；片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體；通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：第七頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日片段重組體（見模型圖右邊產(chǎn)物）：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體中間含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本DNA。

第八頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

內切酶

(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移

(recA)

內切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′第九頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內切酶(ruvC)內切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體第十頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日Hollidayintermediate的電鏡照片第十一頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日二、細菌的基因轉移與重組（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌）的DNA轉移稱為接合作用(conjugation)。有四種方式：接合、轉化、轉導和細胞融合。第十二頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日可接合質粒如F因子(Ffactor)細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。質粒第十三頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日（二）轉化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉化作用(transformation)。例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。第十四頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日（三）轉導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用(transduction)。第十五頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)第十六頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日三、位點特異重組，即特異位點間發(fā)生的整合位點特異重組(site-specificrecombination)是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。第十七頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉錄病毒cDNA的長末端重復序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌體DNA的整合第十八頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

噬菌體的重組位點attP與大腸桿菌的重組位點attB之間有15bp核心序列相同，在整合酶（Int）、整合酶宿主因子（IHF）作用下發(fā)生整合；切除還需要Xis蛋白的參與。第十九頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日（二）細菌的特異位點重組沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉變。第二十頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉變hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅動hin基因表達，另一正向時驅動H2和rH1基因表達，反向(倒位)時H2和rH1不表達。rH1為H1的阻遏蛋白基因。第二十一頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(和)，一個編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLV

D

JC第二十二頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側均存在保守的重組信號序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號序列基因片段第二十三頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日V片段J片段RSSRSS間插DNAOHOHVJ單鏈切開RAG1RAG2分子內轉酯反應單鏈切開轉移核苷酸修復、連接免疫球蛋白基因重排過程第二十四頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日四、轉座重組大多數(shù)基因在基因組內的位置是固定的，但有些基因從一個位置移動到另一位置。這些可移動的DNA序列包括插入序列和轉座子。由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座(transposition)。第二十五頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

插入序列(insertionsequences,IS)組成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列二個反向重復(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復序列一個轉座酶（transposase)編碼基因第二十六頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日插入序列發(fā)生轉座的形式：保守性轉座(conservativetransposition)復制性轉座(duplicativetransposition)

是插入序列從原位遷至新位。

是插入序列復制后，其中的一個復制本遷移至新位，另一個仍保留在原位。第二十七頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日插入序列的復制性轉座第二十八頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日轉座子(transposons)——從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉座子轉座轉座子組成：反向重復序列轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因第二十九頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

細菌的可流動性元件A插入序列：轉座酶編碼基因兩側連接反向末端重復序列(箭頭所示)B轉座子Tn3：含有轉座酶、β-內酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個相同的插入序列IS10L第三十頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日由轉座子介導的轉座第三十一頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone第二節(jié)重組DNA技術,又稱DNA克隆或分子克隆第三十二頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日重組DNA技術的發(fā)展史1865年的豌豆雜交試驗。1944年的肺炎球菌轉化實驗。1973年美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子。1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要藥物。1980年建造第一家應用重組DNA技術生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉。第三十三頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

轉基因豬進行人體器官移植由于豬的器官，如心臟與人的大小和活動能力類似，且豬的數(shù)量充足，容易繁殖，可以充分滿足臨床需要，被醫(yī)學界認為是人類器官移植的最佳提供者。在人體器官移植手術中，靈長類猿猴的內臟普遍為人們所看好。但醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，猿猴身上的一些病毒對人類十分有害。第三十四頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日圖：美國哈佛醫(yī)學院的研究人員正將一頭豬的肝臟取出來，為一位肝昏迷患者作替代肝臟。通過基因工程手段，將豬的一個能引發(fā)人體排斥反應的基因-GT基因被關閉，使豬的器官成功移植到人體內的可能性大大增加。

GT基因控制產(chǎn)生一種酶，這種酶使豬細胞表面產(chǎn)生一種蛋白質。當豬的器官移植進人體時，人類免疫系統(tǒng)能識別這種蛋白質，從而產(chǎn)生強烈的排異反應。第三十五頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日水母第三十六頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日利用乳腺生產(chǎn)藥用蛋白的轉基因羊把白蛋白基因轉入著乳腺中，這樣，轉入的白蛋白基因在羊乳腺中表達。通過其分泌不斷產(chǎn)生白蛋白。通過分離、純化，可以得到藥用白蛋白，解決臨床上病人對白蛋白的需求。第三十七頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日返回把大鼠生長因子轉入小鼠得到巨大型的轉基因小鼠。第三十八頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日轉基因抗凍西紅柿

transgenicanti-chillingtomatoes轉魚基因番茄是將美洲擬蝶魚的抗寒基因轉入番茄的染色體上，該品種具有耐寒（植株的致死溫度下降2℃）、高產(chǎn)（產(chǎn)量增加18％以上）、優(yōu)質（果實維生素C含量增加15．5％）、抗病等優(yōu)點。第三十九頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日延熟保鮮的轉基因番茄轉基因

（transgenicanti-ageingtomatoes）通過反義技術，封閉乙烯合成酶（ACC）基因的表達，沒有基因產(chǎn)物.第四十頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日轉抗蟲基因Bt煙草植株的抗蟲效果第四十一頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日Goldenrice（黃金米）vitaminA=retinol-producedbyanimalsinliver,milkandeggsplantsdonotproducevitA-butsomeproduce?-carotene,aprecursorforvitAincluding“yellowvegetables”,yellowendospermcornandsorghuminmanydevelopingcountries,vitAdeficiencyisamajorproblem:第四十二頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日基因工程與藥物研制我國生產(chǎn)的部分基因

工程疫苗和藥物許多藥品的生產(chǎn)是從生物組織中提取的。受材料來源限制產(chǎn)量有限，其價格往往十分昂貴。微生物生長迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。若將生物合成相應藥物成分的基因導入微生物細胞內，讓它們產(chǎn)生相應的藥物，不但能解決產(chǎn)量問題，還能大大降低生產(chǎn)成本。第四十三頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日胰島素從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價格之高可想而知。將合成的胰島素基因導入大腸桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g胰島素！使其價格降低了30%-50%!第四十四頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日第四十五頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日環(huán)境保護基因工程做成的“超級細菌”能吞食和分解多種污染環(huán)境的物質。通常一種細菌只能分解石油中的一種烴類，用基因工程培育成功的“超級細菌”卻能分解石油中的多種烴類化合物。有的還能吞食轉化汞、鎘等重金屬，分解DDT等毒害物質。第四十六頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

利用基因工程培育的“指示生物”能十分靈敏地反映環(huán)境污染的情況，卻不易因環(huán)境污染而大量死亡，甚至還可以吸收和轉化污染物。第四十七頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日相關概念

DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理及操作步驟本節(jié)主要內容：第四十八頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日一、重組DNA技術相關概念克隆(clone):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆第四十九頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。

DNA克隆第五十頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。第五十一頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日（二）工具酶

限制性核酸內切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉錄酶

T4DNA連接酶多聚核苷酸激酶

堿性磷酸酶

末端轉移酶基因工程的手術刀！第五十二頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第五十三頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease)限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點切割雙鏈DNA的一類內切酶。存在細菌體內。BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+定義：第五十四頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）分類：1800+種作用：

例如：EcoRI、BamHI等就屬于這類酶。第五十五頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第五十六頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日Ⅱ類酶識別序列特點——回文結構(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第五十七頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口第五十八頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶：第五十九頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAG

GATCCG++ATCTAG

GATCTA

同尾酶第六十頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日名稱識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’MboⅠ

5’…▼GATC...3’NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’

限制性內切核酸酶第六十一頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日（三）目的基因(targetgene)cDNA(complementaryDNA)

指經(jīng)反轉錄合成的、與RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互補的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應可合成雙鏈cDNA?；蚪MDNA(genomicDNA)

指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。第六十二頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日（四）基因載體

定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達蛋白質所采用的一些DNA分子。

載體按功能分為

克隆載體(cloningvector)

表達載體(expressionvector)第六十三頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。第六十四頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

常用載體質粒DNA噬菌體DNA病毒DNA第六十五頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日載體的選擇標準：能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。第六十六頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日1.質粒(plasmid):特點:

能在宿主細胞內自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。

是存在于細菌染色體外的具有自主復制能力的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。第六十七頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日最早使用的質粒DNA是人工構建的pBR322，該質粒分子大小為4.3kb，帶有抗四環(huán)素和抗氨芐青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等單一的限制酶切位點。

第六十八頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日第六十九頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日第七十頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日2.噬菌體(bacteriophage，phage)噬菌體是感染細菌的一類病毒，因其寄生在細菌中并能溶解細菌細胞，故稱為噬菌體。

噬菌體由頭和尾構成，感染時尾管將基因組DNA注入大腸桿菌，而將其蛋白質外殼留在菌外。具有溶菌性和溶原性兩種不同的繁殖方式。

第七十一頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型載體，適用cDNA克?。?/p>

EMBL系列（置換型載體，適用基因組克?。㎝13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列第七十二頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

由λ噬菌體的cos區(qū)與pBR322質粒組合的雜種載體。粘粒可克隆29-45kb的大片段，常用作建立真核基因組文庫的載體。

粘粒(cosmid)第七十三頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

3.病毒（virus）

病毒載體更多用于真核表達系統(tǒng)，如腺病毒，腺病毒相關病毒、痘病毒，逆轉錄病毒，猴空泡病毒等。第七十四頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)

細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)4.其他第七十五頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日二、重組DNA技術基本原理1.目的基因的獲取2.克隆載體的選擇和構建3.外源基因與載體的連接4.重組DNA導入受體細胞5.重組體的篩選6.克隆基因的表達第七十六頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

以質粒為載體的DNA

克隆過程第七十七頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日（一）目的基因的獲取化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)聚合酶鏈反應(PCR)第七十八頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。第七十九頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫獲取目的基因第八十頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫用隨機切割的真核生物染色體DNA片段構建基因文庫第八十一頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

將mRNA逆轉錄合成cDNA，再與載體連接成重組DNA，將其引入宿主細胞并進行擴增，所得分子克隆的混合體稱為cDNA文庫。從cDNA文庫獲取目的基因第八十二頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫

反轉錄酶載體受體菌復制從cDNA文庫獲取目的基因逆轉錄酶AAAATTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解TTTT第八十三頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日（二）克隆載體的選擇和構建目的不同，操作基因的性質不同，載體的選擇和改建方法也不同。第八十四頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日（三）外源基因與載體的連接第八十五頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

粘性末端連接方式：

(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接第八十六頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+載體DNA用

BamHⅠ切割目的基因用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接第八十七頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。第八十八頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日2.平端連接限制性內切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端適用于：第八十九頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連第九十頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日在末端轉移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。3.同聚物加尾連接第九十一頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′第九十二頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。4.人工接頭(linker)連接第九十三頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ第九十四頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)導入方式：轉化(transformation)轉染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導入受體菌第九十五頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日1、顯微注射法(Microinjectiontechnique)在顯微鏡下，用一根極細的玻璃針（直徑1-2微米）直接將DNA注射到胚胎的細胞核內，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內，使之發(fā)育成正常的幼仔。用這種方法生產(chǎn)的動物約有10%是整合外源基因的轉基因動物。第九十六頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日2、電穿孔法在高壓電場的短暫作用下，細胞膜上可出現(xiàn)可逆的孔洞，外源DNA可通過此孔洞進入胞內。方法適應不同細胞如細菌、酵母、植物及動物細胞。需電穿孔儀。第九十七頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日3、DNA-磷酸鈣共沉淀法

將DNA與CaCl溶液混合，再緩慢滴加入含有磷酸的HEPES溶液中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀顆粒。小心地將顆粒加入到培養(yǎng)的靶細胞表面，保溫數(shù)小時后，使DNA被靶細胞攝取。更換培養(yǎng)液使外源DNA在細胞中表達，篩選轉化細胞或分析外源基因的表達量。第九十八頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日4、DEAE-右旋糖苷法

該法先用來促進病毒DNA導入，后來發(fā)展為一種哺乳動物細胞的基因轉移方法。方法：用外源DNA和DEAE-右旋糖酶的混合物處理細胞。通常只用于克隆化基因的瞬間表達，不用于細胞的穩(wěn)定轉化。它對BSC-1，CV-1和COS細胞轉染較好，因此應用上有限制。第九十九頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日5、逆轉錄病毒載體逆轉錄病毒是一種RNA病毒，基因大小為3-10kb。不同于其它病毒，它具有二倍體基因，即含有兩個相同的RNA分子，有典型的真核mRNA結構（包括帽子和尾巴）。第一百頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日1.直接選擇法(1)抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法:原位雜交、Southern印跡等。2.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等（五）重組體的篩選第一百零一頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日(插入失活法)

抗藥性標記選擇帶有雙抗生素的質粒自身環(huán)化在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長，DNA重組體只能在其中一種抗生素培養(yǎng)基上生長。第一百零二頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標志補救第一百零三頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

α互補原理篩選重組體pUC18

如果無外源基因插入：則質粒lacZ基因正常表達和宿主菌的lacZ基因互補，產(chǎn)生有活性的β–半乳糖苷酶，經(jīng)IPTG誘導后，分解X-gal底物，產(chǎn)生blueclony。如果有外源基因插入：則質粒編碼的lacZ基因失活、菌體不可能互補產(chǎn)生β–半乳糖苷酶，產(chǎn)生whiteclony。第一百零四頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

原位雜交第一百零五頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日Southern印跡第一百零六頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學方法第一百零七頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日重組DNA技術操作過程可形象歸納為：小結分分離目的基因

切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉轉入受體細胞篩篩選重組體

第一百零八頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日重組DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因

連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交第一百零九頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日表達體系的建立：表達載體的構建受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達第一百一十頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

標準：選擇標志 強啟動子翻譯調控序列 多接頭克隆位點

E.coli表達體系的不足：不宜表達真核基因組DNA；不能加工表達的真核蛋白質；表達的蛋白質常形成不溶性包涵體；很難表達大量可溶性蛋白。1.原核表達體系(E.coli表達體系最常用)第一百一十一頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日大鼠胰島素原cDNA的表達和分泌 第一百一十二頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日第一百一十三頁，共一百二十六頁，2022年，8月28日

優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA

可適當修飾表達的蛋白質表達產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點：