制備色譜-課件

第二章制備色譜基礎(chǔ)PreparativeChromatographyLujiangYuan第二章制備色譜基礎(chǔ)PreparativeChromato1制備色譜

任何一種分離方式均可用于制備目的，色譜和電泳也不例外（注意實(shí)際效果?。?。制備色譜是指采用色譜技術(shù)制備純物質(zhì)，即分離、收集一種或多種色譜純物質(zhì)。制備色譜中的“制備”這一概念指獲得足夠量的單一化合物，以滿足研究和其它用途。制備色譜的出現(xiàn)，使色譜技術(shù)與經(jīng)濟(jì)利益建立了聯(lián)系。制備量大小和成本高低是制備色譜的兩個(gè)重要指標(biāo)。氣相制備色譜主要用于石油化工產(chǎn)品和揮發(fā)性天然產(chǎn)物的色譜純樣品制備。制備色譜任何一種分離方式均可用于制備目的，色譜和電泳也不例2

儀器分析所需純樣品量

儀器樣品量（mg）NMR1-10FT-IR0.1-1IR1UV-Vis<1元素分析1-10MS0.01-1全面鑒定一樣品結(jié)構(gòu)10-50儀器分析所需純樣品量?jī)x器樣品量（mg）NMR1-10FT3分離度分析速度分離樣品量思考：這三個(gè)指標(biāo)是相互制約達(dá)的，不同分離目的有不同要求。請(qǐng)具體分析：

1）分離分析2）制備分離

評(píng)價(jià)制備色譜效率的主要指標(biāo)是單位時(shí)間內(nèi)分離純物質(zhì)的量，以純組分量和該組分保留時(shí)間之比表示，定義為產(chǎn)率。另一指標(biāo)是最大允許分離樣品體積，它決定于固定相的負(fù)荷和色譜柱尺寸。分離度分析速度分離樣品量思考：這三個(gè)指標(biāo)是相互制約達(dá)的，不同4

制備色譜和分析色譜的比較

制備色譜分析色譜分離目的單位時(shí)間內(nèi)獲得符合純度的物質(zhì)量獲得混合物中各組分的信息（定性定量）色譜模型非線性色譜線性色譜儀器設(shè)備制備柱、高流量、大進(jìn)樣、低檢測(cè)（高通量）高壓穩(wěn)流、高精度進(jìn)樣、高靈敏檢測(cè)（高重現(xiàn)性）

液相色譜制備純物質(zhì)的目的：結(jié)構(gòu)鑒定，生物和毒理試驗(yàn)，以及某些珍貴或難分離單組分物質(zhì)的生產(chǎn)。制備色譜和分析色譜的比較制備色譜分析色譜分離目的單位時(shí)間5Introduction一、線性色譜組分在固定相和流動(dòng)相中的平衡濃度呈正比例關(guān)系，也即吸附分配等溫線為一條直線。分析色譜進(jìn)樣量小，樣品在固定相＆流動(dòng)相中的分配關(guān)系大多為直線，因此分析色譜大多為線性色譜，其色譜峰符合高斯分布。Introduction一、線性色譜6二、非線性色譜二、非線性色譜7圖三種吸附等溫線和對(duì)應(yīng)的色譜峰形狀

流動(dòng)相CSCmCmCmCSCS圖三種吸附等溫線和對(duì)應(yīng)的色譜峰形狀

流動(dòng)相CSCmCm81、色譜峰不對(duì)稱1、色譜峰不對(duì)稱92、保留時(shí)間隨樣品量大小而變2、保留時(shí)間隨樣品量大小而變103、色譜峰高度與樣品量不成正比例關(guān)系此時(shí)，如果用峰高來(lái)定量是不準(zhǔn)確的制備色譜3、色譜峰高度與樣品量不成正比例關(guān)系此時(shí)，如果用峰高來(lái)定量是11二、制備分離的目標(biāo)和策略1、目標(biāo)A樣品的性質(zhì):組成，基體，理化性質(zhì)，相態(tài)，濃度，價(jià)值；B產(chǎn)品的純度：要求達(dá)到的純度，濃度很低的天然產(chǎn)物達(dá)70％，核磁和紅外95％，化學(xué)分析標(biāo)品95％；生物制品可用活力來(lái)表示；C制備量：D時(shí)間E成本：制備分離成本很高，有時(shí)占整個(gè)成本的80％二、制備分離的目標(biāo)和策略1、目標(biāo)122、分離策略A分離因子：兩組分質(zhì)量分配比之比；B柱效：N=L/H,VanDeemter方程；C容量因子：調(diào)整保留時(shí)間與死時(shí)間之比；D條件優(yōu)化：用液相或薄層色譜在分析型規(guī)模下優(yōu)化，然后放大到制備規(guī)模；2、分離策略A分離因子：兩組分質(zhì)量分配比之比；13制備色譜-課件14制備色譜-課件15分離因子

分離因子是兩種物資質(zhì)量分配比之比，一般由兩物資調(diào)整保留時(shí)間之比而求得，也可由兩物質(zhì)容量因子之比來(lái)計(jì)算。分離因子越大，兩組分峰的距離越遠(yuǎn)。當(dāng)樣品固定時(shí)，分離因子取決于固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)。因此，選擇固定相＆流動(dòng)相是獲得大的分離因子的關(guān)鍵。How?

分離因子分離因子是兩種物資質(zhì)量分配比之比，一16固定相的選擇首先考慮樣品的性質(zhì)

疏水樣品選擇反相固定相親水樣品選擇正相固定相大分子選擇離子交換色譜固定相碳水化合物選擇疏水色譜固定相無(wú)幾離子選離子色譜固定相合成聚合物選凝膠色譜固定相立體異構(gòu)樣品選環(huán)糊精固定相外消旋樣品選手性固定相固定相的選擇首先考慮樣品的性質(zhì)17固定相組成極性品牌應(yīng)用SE-30、OV-1、OV-101二甲基硅氧烷非極性DB-1、HP-1、CP-Sil5CB、SPB-1、007-1、Rtx-1、BP-1烴類、胺類、酚類、農(nóng)藥、PCBs、揮發(fā)油、硫化物等SE-54、SE-525%苯基，1%乙烯基甲基硅氧烷非極性DB-5、HP-5、CPSil8CB、SPB-5、、Rtx-5、BP-5藥物、芳烴類、酚、酯、生物堿、鹵代烴OV-17017%氰甲基，7%苯基甲基硅氧烷中等極性DB-1701、HP-1701、BP-10、CPSil19CB、Rtx-1701、SPB-1701藥物、農(nóng)藥、除草劑、TMS糖

OV-1750%苯基甲基硅氧烷中等極DB-17、HP-50、SP2250、CP-Sil19、Rtx-50、SPB-50藥物、農(nóng)藥、甾類等PEG-20M聚乙二醇20M極性DB-WAX、HP-Wax、CarbowaxSUPELCOWAX10、CPWAX52CB醇類、酯、醛類、溶劑、單芳、精油等

OV-21050%三氟丙基硅氧烷極性DB210、Rtx200極性化合物、有機(jī)氯化合物更多的數(shù)據(jù)可以從色譜分析手冊(cè)上查到固定相組成極性品牌應(yīng)用SE-30、OV-1、OV-101二18固定相選擇的原則相似性原則極性化合物：極性固定液，極性小的先出峰；非極性化合物：非極性固定液，沸點(diǎn)低的先出峰；非＋極性混合物：極性固定液，非極性先出峰；能成氫鍵的樣品（醇、酚、胺）：極性固定液或氫鍵固定液如PEG－20M;固定相選擇的原則相似性原則19

確定了固定相的類別后，還有必要對(duì)固定相的具體種類進(jìn)行篩選，如常規(guī)的反相色譜固定相就多達(dá)10多種。

具體的結(jié)果只有通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確證。甚至還可以考慮使用混合固定相。

流動(dòng)相的選擇

選擇流動(dòng)相必須根據(jù)確定的固定相來(lái)決定反相固定相：極性有機(jī)溶劑＋水正相：非極性溶劑＋極性溶劑確定了固定相的類別后，還有必要對(duì)固定相的具體種類進(jìn)行篩20流動(dòng)相的性質(zhì)要求

①流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)：堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。離子交換樹(shù)脂＆排阻色譜遇到某些有機(jī)溶劑會(huì)膨脹或收縮，從而改變柱床的性質(zhì)。②純度。③必須與檢測(cè)器匹配。④粘度要低（應(yīng)<2cp）。沸點(diǎn)100°以下最好。⑤對(duì)樣品的溶解度要適宜。⑥樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。

流動(dòng)相的性質(zhì)要求

①流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)：堿性流動(dòng)相21流動(dòng)相的pH值采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。

流動(dòng)相的pH值采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿22洗脫能力在化學(xué)鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關(guān)。在正相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而增加；在反相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而減弱。

正相色譜的流動(dòng)相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。反相色譜的流動(dòng)相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。

乙腈-水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)。乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。價(jià)格是甲醇的6~7倍。

洗脫能力在化學(xué)鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相23在通常情況下，首先要考慮的是溶劑的極性。但是對(duì)于缺乏經(jīng)驗(yàn)的新手不防用下面的方法來(lái)的快：1由強(qiáng)到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

2三倍規(guī)則：每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過(guò)程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。

3粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)：當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。

在通常情況下，首先要考慮的是溶劑的極性。但是對(duì)于缺乏經(jīng)驗(yàn)的新24如果做液相色譜分析還要注意!水：超純水電阻率（MΩ?cm），25℃，最小10.0-18.0

硅酸鹽（mg/L），最大0.05-0.003

微粒（micro－m）濾器0.22-0.2流動(dòng)相脫氣＆過(guò)濾o.2uM或0.45uM流動(dòng)相要現(xiàn)配現(xiàn)用。樣品要過(guò)濾:樣品用流動(dòng)相溶解：如果做液相色譜分析還要注意!水：超純水電阻率（MΩ?cm），25柱效樣品對(duì)柱效的影響為了最大效率地得到目標(biāo)產(chǎn)物，制備色譜總是在過(guò)載的情況下操作，嚴(yán)重的過(guò)載會(huì)使N很快下降，一學(xué)者建議控制在組分峰的容量因子下降10％左右。樣品的理化性質(zhì)，濃度大小，分配比，擴(kuò)散系數(shù)及容量因子等都有影響。H=L/N柱效樣品對(duì)柱效的影響H=L/N26固定相對(duì)柱效的影響顆粒大小，分配范圍；形狀，孔徑大?。槐砻娣e或比表面積；表面化學(xué)性質(zhì)；固定相對(duì)柱效的影響顆粒大小，分配范圍；27流動(dòng)相的影響包括流動(dòng)相的化學(xué)性質(zhì)；組成；黏度：擴(kuò)散性質(zhì)以及線速度；流動(dòng)相的影響包括流動(dòng)相的化學(xué)性質(zhì)；28色譜柱的影響柱結(jié)構(gòu)是否合理；填充是否合理：有否很大的死體積，填充是否均勻，緊密度是否適中等；色譜柱的影響柱結(jié)構(gòu)是否合理；29容量因子Κ＝（tR-tM)/tM=t’R/tM如右可見(jiàn)，當(dāng)容量因子達(dá)到一定值后，對(duì)分離度的影響并不是很大。因此，在制備分離過(guò)程中我們不是無(wú)限制地增加K值，因?yàn)镵值的增加是以時(shí)間和大量的溶劑為代價(jià)的。除非收集的物質(zhì)是很昂貴的物質(zhì)。k:1-5比較合適；α>2分離容易；2>α>1.5能進(jìn)行制備分離1.5>α>1.3分離困難α<1.3制備分離非常困難容量因子Κ＝（tR-tM)/tM=t’R/tM30條件優(yōu)化一般步驟選擇最佳薄層色譜或HPLC分離條件在分析的條件下進(jìn)行制備分離放大到制備規(guī)模進(jìn)行制備分離收集分析純度,如不和要求,重新在分析設(shè)備上改進(jìn)分離條件合并相同組分如果需要可進(jìn)一步提純產(chǎn)品目標(biāo)物質(zhì)條件優(yōu)化一般步驟選擇最佳薄層色譜或HPLC分離條件在分析的條31制備色譜過(guò)程制備色譜過(guò)程32制備色譜過(guò)程制備色譜過(guò)程33第三章制備薄層色譜1938年，NA.lzmailovandMS.Schraiber在顯微鏡的玻片上涂上氧化鋁分離酊劑，但沒(méi)有多大進(jìn)展；1949年，JE.MeinhardandNF.Hall用淀粉為黏合劑制成了氧化鋁及硅藻土板，分離無(wú)機(jī)離子；1956年，E.Stahl對(duì)吸附硅膠的規(guī)格，性能，厚度進(jìn)行了系統(tǒng)研究，于1965年出版了《薄層色譜手冊(cè)》；第三章制備薄層色譜1938年，NA.lzmailovan34DefinitionofTLC

Atechniquethatusesasorbentappliedtoaplanarsupport,calledaplate,forseparation.Thesampleisappliedtothesorbentthatiscontainedinasealedcontainercalledadevelopingtank.Thesolventmovesupthesupportthroughcapillaryactionandcausestheanalytestomigrateupthesorbentbasedinthedifferentialaffinitybetweenthesolventandthesorbent.StandardTLCusesasorbentthatispreparedfrom10-to60-umparticlesthatisappliedtotheplateinathicknessof~250um.Thestandardplatedimensionsareinthe10cm×10cmto20cm×20cmrange.DefinitionofTLCAtec35Interpretation

CalculatingtheRfvalueCalculatingtheRfvalueInterpretationCalculatingthe36CalculateRfValueCalculateRfValue37RfValue

TheRfvalueneedstobebetween0.0and1.0Ifthevalueisover1.0orlessthan0.0,thecalculationiswrongIftheRfvalueisgreaterthan0.8orlowerthan0.2thevaluesarehardtointerpret,thuscreatingalargererrorThebestRfvaluesare0.3to0.6RfValueTheRfvalueneedsto38RfValue

WhataffectstheRfvalue?TemperatureSolventThicknessandamountofspotOthercompoundsRfValue39第一節(jié)實(shí)驗(yàn)材料與裝置一、薄層板10x20cm,50片/包F25410x10cm25片/包F25410x20cm50片/包第一節(jié)實(shí)驗(yàn)材料與裝置一、薄層板10x20cm,50片/包40薄層層析的支持劑薄層層析的支持劑較常用的是硅膠、氧化鋁、硅藻土、纖維素、聚酰胺及DEAE—纖維素。無(wú)機(jī)類支持劑的顆粒以150～200目(直徑為0．07～0．1mm)、薄層厚度為0．25～1mm較合適。有機(jī)吸附劑如纖維素等的顆粒為70～140目(直徑0．1～0．2mm)、薄層厚度為1～2mm最恰當(dāng)。薄層層析的支持劑薄層層析的支持劑較常用的是硅膠、氧化鋁、硅藻41自制薄層板玻板：5x20，10x20，20x20，20x40，20x100cm硅膠：表面積300－500m2/g,孔徑100nm,粒度10-40um,高效薄層用5－10um.商品硅膠字母的意義：H

表示不含黏合劑；F

表示含熒光物質(zhì)；G

表示含鍛石膏黏合劑；F254表示在紫外254nm照射下發(fā)熒光；F365表示用365nm激發(fā)；P

表示制備用硅膠；自制薄層板玻板：5x20，10x20，20x20，2042板的大小板寬可增加制備量；長(zhǎng)度不宜太長(zhǎng)，太長(zhǎng)展開(kāi)慢，且由于擴(kuò)散的原因，太長(zhǎng)對(duì)分離沒(méi)有多大改進(jìn)，長(zhǎng)度一般20厘米；制備板的方法有干法＆濕法兩種，但濕法用的更廣泛些。板的大小板寬可增加制備量；43干法制板干法制備薄板可達(dá)7mm，不需要黏合劑.制備方法也簡(jiǎn)單：在長(zhǎng)方形的金屬或玻璃淺盤中松散地裝上吸附劑就可以了，可以用玻棒或相應(yīng)的工具把表面刮平。干法制板干法制備薄板可達(dá)7mm，不需要黏合劑.制備方法也簡(jiǎn)單44濕法制板濕法制板可分為平鋪法＆涂鋪法。平鋪法：待鋪玻璃板兩邊用玻璃做邊框，將調(diào)配好的吸附劑倒在玻璃板上，然后用玻璃棒刮平，去掉邊框即可。涂鋪法：一般用涂鋪器涂鋪的方法。常用的黏合劑：10－15％的鍛石膏，0.2-10%的羧甲基纖維素鈉，5％聚丙烯酸或5％的淀粉。濕法制板濕法制板可分為平鋪法＆涂鋪法。45鋪板器TD－II型全自動(dòng)薄層鋪板機(jī)

薄層板干燥架

薄層色譜玻璃板

CAMAG手動(dòng)鋪板器

自動(dòng)鋪板器

TLC薄層板存儲(chǔ)盒

鋪板器TD－II型全自動(dòng)薄層鋪板機(jī)

薄層板干燥架

薄層色譜46板的厚度分析薄板：0.25mm;制備薄板：0.5-3mm;由此可計(jì)算制備1mm厚，20x20mm的板需要20－25g硅膠。也有人用高比例的黏合劑制備5－10mm厚的板，但分離能力差，一般用于初步分離；板的厚度分析薄板：0.25mm;47常見(jiàn)的三種薄層斑點(diǎn)圖薄層色譜理論踏板數(shù)：N=16（d/w)D為原定到斑點(diǎn)中心距離，w斑點(diǎn)寬度。常見(jiàn)的三種薄層斑點(diǎn)圖薄層色譜理論踏板數(shù)：N=16（d/w48二、展開(kāi)槽二、展開(kāi)槽49第二節(jié)實(shí)驗(yàn)方法制備好的薄板在自然條件下干燥12－24h,然后在120度活化30min-4h,活化好的板應(yīng)保存在干燥器中?；罨瘻囟瘸^(guò)130度，有可能使石膏脫水。第二節(jié)實(shí)驗(yàn)方法制備好的薄板在自然條件下干燥12－24h,然50上樣前對(duì)薄板預(yù)展開(kāi)目的：除去吸附劑中的雜質(zhì)。方法：用氯仿－甲醇（1：1）或者乙醚（含1％氨水或1％乙酸，根據(jù)后面的展開(kāi)劑含酸或堿來(lái)選擇）在展開(kāi)槽中展開(kāi)，然后取出真空干燥備用。上樣前對(duì)薄板預(yù)展開(kāi)目的：除去吸附劑中的雜質(zhì)。51樣品配制樣品盡可能溶解在揮發(fā)性大的溶劑中，溶劑的極性要盡量??；樣品的濃度控制在上樣厚能均勻鋪開(kāi)，而不在吸附劑表面結(jié)晶，制備薄層色譜上樣濃度一般為2－10％；樣品配制樣品盡可能溶解在揮發(fā)性大的溶劑中，溶劑的極性要盡量小52鋪板用的勻漿不宜過(guò)稠或過(guò)?。哼^(guò)稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)或停頓造成的層紋；過(guò)稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G:水=1：2～3，硅膠G:羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。

鋪板用的勻漿不宜過(guò)稠或過(guò)?。哼^(guò)稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)或停頓造成的53一、上樣

上樣量：薄板的容量與薄板的厚度的平方根成正比，如2.5mm厚的板的上樣量是1mm厚的兩倍。實(shí)驗(yàn)表明：20x20cm分析板5mg1mm厚20x20cm制備板5-25mg判斷是否過(guò)載：看斑點(diǎn)有無(wú)拖尾或伸舌或變形。實(shí)驗(yàn)前，反復(fù)實(shí)驗(yàn)?zāi)愁惐“鍖?duì)具體樣品的容量。一、上樣上樣量：薄板的容量與薄板的厚度的平方根成正比，如54上樣位置距離薄板一端約2.5cm，3-5mm條形，條的長(zhǎng)度以兩邊距離板的邊緣1-3mm上樣位置距離薄板一端約2.5cm，3-5mm條形，條的長(zhǎng)度以55上樣時(shí)可以重復(fù)上，但需溶劑揮發(fā)干再上。用強(qiáng)極性溶劑（如甲醇）展開(kāi)1-2cm可壓縮條帶，然后取出揮發(fā)干；上樣不能破壞薄板表面；可在上樣的地方挖一V型槽，槽的上端1-2mm寬，深度為吸附劑的一半；上樣處的吸附劑挖去，用拌有樣品的吸附劑填平；上樣時(shí)可以重復(fù)上，但需溶劑揮發(fā)干再上。用強(qiáng)極性溶劑（如甲醇）56點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣儀57二、展開(kāi)找合適溶劑的方法微量源盤技術(shù)尋找合適的溶劑：將試樣點(diǎn)于薄層板上干燥使其成一圓點(diǎn)，在圓點(diǎn)上滴溶劑，如果被試物留在圓點(diǎn)不動(dòng)，需增加溶劑的極性或增大洗脫量；如被試物隨溶劑跑德太快甚至達(dá)到前沿，則需用更低極性的溶劑。微型薄板：實(shí)驗(yàn)室常用顯微鏡的載玻片來(lái)制薄板，手工涂鋪，一次分離只有幾分鐘。二、展開(kāi)找合適溶劑的方法58StahlE.ThinLayerChromatography.2ndEd,SpringerVerlag/Academicpress.1969被分離物質(zhì)為非極性：用非極性展開(kāi)劑，吸附劑的活性要高。被分離物質(zhì)為強(qiáng)極性：用強(qiáng)極性展開(kāi)劑，選擇強(qiáng)極性吸附劑，此時(shí)吸附劑的活性較低。被分離物質(zhì)為中等極性：選中等極性展開(kāi)劑，用中等活性的吸附劑。選擇展開(kāi)劑，要依據(jù)溶劑極性和他們的混溶性，溶劑對(duì)被分析物的溶解性，以及被分析物的結(jié)構(gòu)。StahlE.ThinLayerChromatogr59化合物極性化合物極性環(huán)已烷-0.2氯仿4.1石油醚（Ⅰ類，30~60℃）、石油醚（Ⅱ類，60~90℃）、正已烷0乙醇4.3甲苯2.4乙酸乙酯4.4二甲苯2.5甲醇5.1苯2.7丙酮5.1二氯甲烷3.1乙腈5.8異丙醇3.9乙酸6.0正丁醇3.9水10.2四氫呋喃4.0化合物極性化合物極性環(huán)已烷-0.2氯仿4.1石油醚（Ⅰ類，360展開(kāi)劑展開(kāi)劑吸附劑被分離組分非極性極性非極性極性I級(jí)V級(jí)展開(kāi)劑、吸附劑和被分離組分關(guān)系示意圖展開(kāi)劑展開(kāi)劑吸附劑被分離組分非極性極性非極性極性I級(jí)V級(jí)61混合溶劑展開(kāi)被分離物質(zhì)展開(kāi)劑冰片石油醚(30～60℃)—醋酸乙酯(17:3)、厚樸酚苯－醋酸乙酯(9:1.5)、α-香附酮苯－醋酯乙酯－冰醋酸(92:5:5)、熊果酸甲苯－醋酸乙酯－冰醋酸(12:4:0.5)、齊墩果酸氯仿－甲醇(40:1)、大黃素苯—醋酸乙酯—甲醇(15:2:0.2)或者苯—乙醇(8:1)人參皂苷氯仿－甲醇－水(65:35:10)10℃以下放置的下層溶液或正丁醇－醋酸乙酯－水(4:1:5)的上層溶液或氯仿－醋酸乙酯－甲醇－水(15:40:22:10)10℃以下放置的下層溶液沒(méi)食子酸氯仿－醋酸乙酯－甲酸(5:4:1)、麻黃堿氯仿－甲醇－濃氨試液(20:5:0.5)或正丁醇－冰醋酸－水(8:2:1)、混合溶劑展開(kāi)被分離物質(zhì)展開(kāi)劑冰片石油醚(30～60℃)62展開(kāi)方法上行法：最常用的方法多次展開(kāi)：由極性小到極性大的順序（每次要揮干后才換第二種展開(kāi)劑）；收集后，再次點(diǎn)樣，展開(kāi)。注意：A展開(kāi)溶劑要求分析純；

B展開(kāi)槽中溶劑不夠，可以添加，但不能攪動(dòng)展開(kāi)槽里的溶劑（小心）；展開(kāi)方法上行法：最常用的方法63三、檢測(cè)有色化合物的檢測(cè)：具有熒光的化合物的檢測(cè)：254nm,365nm薄板有熒光：254nm,365nm下樣品為黑斑或帶；其它化合物則需要顯色：顯色劑碘蒸汽，物理吸附，不破壞樣品.

水，樣品為不透明的暗斑或帶如果上面兩種顯色劑不起作用的話，只能按照分析薄層的顯色方法了，方法見(jiàn)后；三、檢測(cè)有色化合物的檢測(cè)：64制備色譜-課件65掃描儀掃描儀66四、收集用刀片將需要的斑點(diǎn)或條帶刮下，裝入玻砂漏斗種，然后用溶劑適當(dāng)溶劑將收集組分從吸附劑上洗脫下來(lái)。操作要小心，不要將非收集組分混入。洗脫的溶劑一般為丙酮、乙醇、氯仿＆一些好的展開(kāi)劑系統(tǒng)；一般不用水＆甲醇，水的沸點(diǎn)高，而甲醇洗脫能力太強(qiáng)。洗脫體積＝（1－Rf)x10x刮下的吸附劑體積四、收集用刀片將需要的斑點(diǎn)或條帶刮下，裝入玻砂漏斗種，然后用67制備色譜-課件68產(chǎn)品鑒定減壓蒸餾得產(chǎn)品鑒定是否是你的目標(biāo)產(chǎn)品（定性），純度是否符合要求？如否，可執(zhí)行下面步驟：重結(jié)晶技術(shù)再次用薄層色譜純化產(chǎn)品鑒定減壓蒸餾得產(chǎn)品69第三節(jié)、離心薄層色譜對(duì)于復(fù)雜混合體系如天然產(chǎn)物或有機(jī)合成反應(yīng)產(chǎn)物，可使用制備高壓液相色譜進(jìn)行分離，但費(fèi)用很高。而使用制備薄層色譜中，不足之處是需將被分開(kāi)的化合物從薄板刮下，而且分離時(shí)間較長(zhǎng)。為克服這些缺點(diǎn)，人們發(fā)明了離心薄層色譜，使用離心力強(qiáng)迫流動(dòng)相流動(dòng)，起到加壓色譜的效果，有突出的優(yōu)點(diǎn)。第三節(jié)、離心薄層色譜對(duì)于復(fù)雜混合體系如天然產(chǎn)物或有機(jī)合成反應(yīng)70離心薄層色譜原理樣品吸附劑旋轉(zhuǎn)方向離心薄層色譜原理樣品吸附劑旋轉(zhuǎn)方向71主要特點(diǎn)

（1）分離速度快，一般少于30分鐘，敏感物質(zhì)的氧化少

（2）操作簡(jiǎn)單，占用空間小，性能穩(wěn)定

（3）使用溶劑少，經(jīng)濟(jì)環(huán)保

（4）色譜板可以反復(fù)得用，不需刮離吸附劑

（5）可進(jìn)行梯度洗脫，條件更優(yōu)化

（6）進(jìn)樣量大，一次分離量100mg到2g

主要特點(diǎn)（1）分離速度快，一般少于30分鐘，敏感物質(zhì)的72KH-CTLC型制備離心薄層色譜儀主機(jī)、專用紫外燈、制板器、離心薄層板

主機(jī)轉(zhuǎn)速為400~1400轉(zhuǎn)/分,速度可調(diào)

紫外燈波長(zhǎng)為254nm或365nm

薄板吸附劑厚度有1、2、4、6、8mm

KH-CTLC型制備離心薄層色譜儀主機(jī)、專用紫外燈、制板器、73制備色譜-課件74制備色譜-課件75薄層層析法的近代發(fā)展

高效薄層層析法(highperformancethin—layer

chromatography，HPTLC)，也稱現(xiàn)代薄層層析法(modern

TLC)。①親水性固定相，多數(shù)用甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙二醇和不同相對(duì)分子質(zhì)量的聚乙二醇或不同種類的鹽溶液浸漬②親脂性固定相，一般作反向?qū)游鲇茫鄶?shù)用液體石蠟、十一烷、十四烷、礦物油、硅酮油或乙基油酸鹽等浸漬。也有利用與浸漬劑形成絡(luò)合物或加成物得以分離的，如經(jīng)三硝基苯或苦味酸浸漬的，可利用絡(luò)合反應(yīng)分離多環(huán)化合物。用NaHSO2浸漬，可與含有羰基化合物生成加成物而得以分離。薄層層析法的近代發(fā)展高效薄層層析法(highperfor76思考題1.如何利用Rf值來(lái)鑒定化合物?2.在混合物薄層色譜中,如何判定各組分在薄層上的位置?能不能定量？3.展開(kāi)劑的高度若超過(guò)了點(diǎn)樣線,對(duì)薄層色譜有何影響?4.薄層色譜屬于吸附色譜還是分配色譜?舉例說(shuō)明。5.制備薄層色譜和分析薄層色譜的區(qū)別？思考題1.如何利用Rf值來(lái)鑒定化合物?77第二章制備色譜基礎(chǔ)PreparativeChromatographyLujiangYuan第二章制備色譜基礎(chǔ)PreparativeChromato78制備色譜

任何一種分離方式均可用于制備目的，色譜和電泳也不例外（注意實(shí)際效果?。?。制備色譜是指采用色譜技術(shù)制備純物質(zhì)，即分離、收集一種或多種色譜純物質(zhì)。制備色譜中的“制備”這一概念指獲得足夠量的單一化合物，以滿足研究和其它用途。制備色譜的出現(xiàn)，使色譜技術(shù)與經(jīng)濟(jì)利益建立了聯(lián)系。制備量大小和成本高低是制備色譜的兩個(gè)重要指標(biāo)。氣相制備色譜主要用于石油化工產(chǎn)品和揮發(fā)性天然產(chǎn)物的色譜純樣品制備。制備色譜任何一種分離方式均可用于制備目的，色譜和電泳也不例79

儀器分析所需純樣品量

儀器樣品量（mg）NMR1-10FT-IR0.1-1IR1UV-Vis<1元素分析1-10MS0.01-1全面鑒定一樣品結(jié)構(gòu)10-50儀器分析所需純樣品量?jī)x器樣品量（mg）NMR1-10FT80分離度分析速度分離樣品量思考：這三個(gè)指標(biāo)是相互制約達(dá)的，不同分離目的有不同要求。請(qǐng)具體分析：

1）分離分析2）制備分離

評(píng)價(jià)制備色譜效率的主要指標(biāo)是單位時(shí)間內(nèi)分離純物質(zhì)的量，以純組分量和該組分保留時(shí)間之比表示，定義為產(chǎn)率。另一指標(biāo)是最大允許分離樣品體積，它決定于固定相的負(fù)荷和色譜柱尺寸。分離度分析速度分離樣品量思考：這三個(gè)指標(biāo)是相互制約達(dá)的，不同81

制備色譜和分析色譜的比較

制備色譜分析色譜分離目的單位時(shí)間內(nèi)獲得符合純度的物質(zhì)量獲得混合物中各組分的信息（定性定量）色譜模型非線性色譜線性色譜儀器設(shè)備制備柱、高流量、大進(jìn)樣、低檢測(cè)（高通量）高壓穩(wěn)流、高精度進(jìn)樣、高靈敏檢測(cè)（高重現(xiàn)性）

液相色譜制備純物質(zhì)的目的：結(jié)構(gòu)鑒定，生物和毒理試驗(yàn)，以及某些珍貴或難分離單組分物質(zhì)的生產(chǎn)。制備色譜和分析色譜的比較制備色譜分析色譜分離目的單位時(shí)間82Introduction一、線性色譜組分在固定相和流動(dòng)相中的平衡濃度呈正比例關(guān)系，也即吸附分配等溫線為一條直線。分析色譜進(jìn)樣量小，樣品在固定相＆流動(dòng)相中的分配關(guān)系大多為直線，因此分析色譜大多為線性色譜，其色譜峰符合高斯分布。Introduction一、線性色譜83二、非線性色譜二、非線性色譜84圖三種吸附等溫線和對(duì)應(yīng)的色譜峰形狀

流動(dòng)相CSCmCmCmCSCS圖三種吸附等溫線和對(duì)應(yīng)的色譜峰形狀

流動(dòng)相CSCmCm851、色譜峰不對(duì)稱1、色譜峰不對(duì)稱862、保留時(shí)間隨樣品量大小而變2、保留時(shí)間隨樣品量大小而變873、色譜峰高度與樣品量不成正比例關(guān)系此時(shí)，如果用峰高來(lái)定量是不準(zhǔn)確的制備色譜3、色譜峰高度與樣品量不成正比例關(guān)系此時(shí)，如果用峰高來(lái)定量是88二、制備分離的目標(biāo)和策略1、目標(biāo)A樣品的性質(zhì):組成，基體，理化性質(zhì)，相態(tài)，濃度，價(jià)值；B產(chǎn)品的純度：要求達(dá)到的純度，濃度很低的天然產(chǎn)物達(dá)70％，核磁和紅外95％，化學(xué)分析標(biāo)品95％；生物制品可用活力來(lái)表示；C制備量：D時(shí)間E成本：制備分離成本很高，有時(shí)占整個(gè)成本的80％二、制備分離的目標(biāo)和策略1、目標(biāo)892、分離策略A分離因子：兩組分質(zhì)量分配比之比；B柱效：N=L/H,VanDeemter方程；C容量因子：調(diào)整保留時(shí)間與死時(shí)間之比；D條件優(yōu)化：用液相或薄層色譜在分析型規(guī)模下優(yōu)化，然后放大到制備規(guī)模；2、分離策略A分離因子：兩組分質(zhì)量分配比之比；90制備色譜-課件91制備色譜-課件92分離因子

分離因子是兩種物資質(zhì)量分配比之比，一般由兩物資調(diào)整保留時(shí)間之比而求得，也可由兩物質(zhì)容量因子之比來(lái)計(jì)算。分離因子越大，兩組分峰的距離越遠(yuǎn)。當(dāng)樣品固定時(shí)，分離因子取決于固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)。因此，選擇固定相＆流動(dòng)相是獲得大的分離因子的關(guān)鍵。How?

分離因子分離因子是兩種物資質(zhì)量分配比之比，一93固定相的選擇首先考慮樣品的性質(zhì)

疏水樣品選擇反相固定相親水樣品選擇正相固定相大分子選擇離子交換色譜固定相碳水化合物選擇疏水色譜固定相無(wú)幾離子選離子色譜固定相合成聚合物選凝膠色譜固定相立體異構(gòu)樣品選環(huán)糊精固定相外消旋樣品選手性固定相固定相的選擇首先考慮樣品的性質(zhì)94固定相組成極性品牌應(yīng)用SE-30、OV-1、OV-101二甲基硅氧烷非極性DB-1、HP-1、CP-Sil5CB、SPB-1、007-1、Rtx-1、BP-1烴類、胺類、酚類、農(nóng)藥、PCBs、揮發(fā)油、硫化物等SE-54、SE-525%苯基，1%乙烯基甲基硅氧烷非極性DB-5、HP-5、CPSil8CB、SPB-5、、Rtx-5、BP-5藥物、芳烴類、酚、酯、生物堿、鹵代烴OV-17017%氰甲基，7%苯基甲基硅氧烷中等極性DB-1701、HP-1701、BP-10、CPSil19CB、Rtx-1701、SPB-1701藥物、農(nóng)藥、除草劑、TMS糖

OV-1750%苯基甲基硅氧烷中等極DB-17、HP-50、SP2250、CP-Sil19、Rtx-50、SPB-50藥物、農(nóng)藥、甾類等PEG-20M聚乙二醇20M極性DB-WAX、HP-Wax、CarbowaxSUPELCOWAX10、CPWAX52CB醇類、酯、醛類、溶劑、單芳、精油等

OV-21050%三氟丙基硅氧烷極性DB210、Rtx200極性化合物、有機(jī)氯化合物更多的數(shù)據(jù)可以從色譜分析手冊(cè)上查到固定相組成極性品牌應(yīng)用SE-30、OV-1、OV-101二95固定相選擇的原則相似性原則極性化合物：極性固定液，極性小的先出峰；非極性化合物：非極性固定液，沸點(diǎn)低的先出峰；非＋極性混合物：極性固定液，非極性先出峰；能成氫鍵的樣品（醇、酚、胺）：極性固定液或氫鍵固定液如PEG－20M;固定相選擇的原則相似性原則96

確定了固定相的類別后，還有必要對(duì)固定相的具體種類進(jìn)行篩選，如常規(guī)的反相色譜固定相就多達(dá)10多種。

具體的結(jié)果只有通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確證。甚至還可以考慮使用混合固定相。

流動(dòng)相的選擇

選擇流動(dòng)相必須根據(jù)確定的固定相來(lái)決定反相固定相：極性有機(jī)溶劑＋水正相：非極性溶劑＋極性溶劑確定了固定相的類別后，還有必要對(duì)固定相的具體種類進(jìn)行篩97流動(dòng)相的性質(zhì)要求

①流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)：堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。離子交換樹(shù)脂＆排阻色譜遇到某些有機(jī)溶劑會(huì)膨脹或收縮，從而改變柱床的性質(zhì)。②純度。③必須與檢測(cè)器匹配。④粘度要低（應(yīng)<2cp）。沸點(diǎn)100°以下最好。⑤對(duì)樣品的溶解度要適宜。⑥樣品易于回收。應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。

流動(dòng)相的性質(zhì)要求

①流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)：堿性流動(dòng)相98流動(dòng)相的pH值采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，組分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。

流動(dòng)相的pH值采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿99洗脫能力在化學(xué)鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關(guān)。在正相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而增加；在反相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨極性的增強(qiáng)而減弱。

正相色譜的流動(dòng)相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。反相色譜的流動(dòng)相通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。

乙腈-水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)。乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。價(jià)格是甲醇的6~7倍。

洗脫能力在化學(xué)鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相100在通常情況下，首先要考慮的是溶劑的極性。但是對(duì)于缺乏經(jīng)驗(yàn)的新手不防用下面的方法來(lái)的快：1由強(qiáng)到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

2三倍規(guī)則：每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過(guò)程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。

3粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)：當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。

在通常情況下，首先要考慮的是溶劑的極性。但是對(duì)于缺乏經(jīng)驗(yàn)的新101如果做液相色譜分析還要注意!水：超純水電阻率（MΩ?cm），25℃，最小10.0-18.0

硅酸鹽（mg/L），最大0.05-0.003

微粒（micro－m）濾器0.22-0.2流動(dòng)相脫氣＆過(guò)濾o.2uM或0.45uM流動(dòng)相要現(xiàn)配現(xiàn)用。樣品要過(guò)濾:樣品用流動(dòng)相溶解：如果做液相色譜分析還要注意!水：超純水電阻率（MΩ?cm），102柱效樣品對(duì)柱效的影響為了最大效率地得到目標(biāo)產(chǎn)物，制備色譜總是在過(guò)載的情況下操作，嚴(yán)重的過(guò)載會(huì)使N很快下降，一學(xué)者建議控制在組分峰的容量因子下降10％左右。樣品的理化性質(zhì)，濃度大小，分配比，擴(kuò)散系數(shù)及容量因子等都有影響。H=L/N柱效樣品對(duì)柱效的影響H=L/N103固定相對(duì)柱效的影響顆粒大小，分配范圍；形狀，孔徑大小；表面積或比表面積；表面化學(xué)性質(zhì)；固定相對(duì)柱效的影響顆粒大小，分配范圍；104流動(dòng)相的影響包括流動(dòng)相的化學(xué)性質(zhì)；組成；黏度：擴(kuò)散性質(zhì)以及線速度；流動(dòng)相的影響包括流動(dòng)相的化學(xué)性質(zhì)；105色譜柱的影響柱結(jié)構(gòu)是否合理；填充是否合理：有否很大的死體積，填充是否均勻，緊密度是否適中等；色譜柱的影響柱結(jié)構(gòu)是否合理；106容量因子Κ＝（tR-tM)/tM=t’R/tM如右可見(jiàn)，當(dāng)容量因子達(dá)到一定值后，對(duì)分離度的影響并不是很大。因此，在制備分離過(guò)程中我們不是無(wú)限制地增加K值，因?yàn)镵值的增加是以時(shí)間和大量的溶劑為代價(jià)的。除非收集的物質(zhì)是很昂貴的物質(zhì)。k:1-5比較合適；α>2分離容易；2>α>1.5能進(jìn)行制備分離1.5>α>1.3分離困難α<1.3制備分離非常困難容量因子Κ＝（tR-tM)/tM=t’R/tM107條件優(yōu)化一般步驟選擇最佳薄層色譜或HPLC分離條件在分析的條件下進(jìn)行制備分離放大到制備規(guī)模進(jìn)行制備分離收集分析純度,如不和要求,重新在分析設(shè)備上改進(jìn)分離條件合并相同組分如果需要可進(jìn)一步提純產(chǎn)品目標(biāo)物質(zhì)條件優(yōu)化一般步驟選擇最佳薄層色譜或HPLC分離條件在分析的條108制備色譜過(guò)程制備色譜過(guò)程109制備色譜過(guò)程制備色譜過(guò)程110第三章制備薄層色譜1938年，NA.lzmailovandMS.Schraiber在顯微鏡的玻片上涂上氧化鋁分離酊劑，但沒(méi)有多大進(jìn)展；1949年，JE.MeinhardandNF.Hall用淀粉為黏合劑制成了氧化鋁及硅藻土板，分離無(wú)機(jī)離子；1956年，E.Stahl對(duì)吸附硅膠的規(guī)格，性能，厚度進(jìn)行了系統(tǒng)研究，于1965年出版了《薄層色譜手冊(cè)》；第三章制備薄層色譜1938年，NA.lzmailovan111DefinitionofTLC

Atechniquethatusesasorbentappliedtoaplanarsupport,calledaplate,forseparation.Thesampleisappliedtothesorbentthatiscontainedinasealedcontainercalledadevelopingtank.Thesolventmovesupthesupportthroughcapillaryactionandcausestheanalytestomigrateupthesorbentbasedinthedifferentialaffinitybetweenthesolventandthesorbent.StandardTLCusesasorbentthatispreparedfrom10-to60-umparticlesthatisappliedtotheplateinathicknessof~250um.Thestandardplatedimensionsareinthe10cm×10cmto20cm×20cmrange.DefinitionofTLCAtec112Interpretation

CalculatingtheRfvalueCalculatingtheRfvalueInterpretationCalculatingthe113CalculateRfValueCalculateRfValue114RfValue

TheRfvalueneedstobebetween0.0and1.0Ifthevalueisover1.0orlessthan0.0,thecalculationiswrongIftheRfvalueisgreaterthan0.8orlowerthan0.2thevaluesarehardtointerpret,thuscreatingalargererrorThebestRfvaluesare0.3to0.6RfValueTheRfvalueneedsto115RfValue

WhataffectstheRfvalue?TemperatureSolventThicknessandamountofspotOthercompoundsRfValue116第一節(jié)實(shí)驗(yàn)材料與裝置一、薄層板10x20cm,50片/包F25410x10cm25片/包F25410x20cm50片/包第一節(jié)實(shí)驗(yàn)材料與裝置一、薄層板10x20cm,50片/包117薄層層析的支持劑薄層層析的支持劑較常用的是硅膠、氧化鋁、硅藻土、纖維素、聚酰胺及DEAE—纖維素。無(wú)機(jī)類支持劑的顆粒以150～200目(直徑為0．07～0．1mm)、薄層厚度為0．25～1mm較合適。有機(jī)吸附劑如纖維素等的顆粒為70～140目(直徑0．1～0．2mm)、薄層厚度為1～2mm最恰當(dāng)。薄層層析的支持劑薄層層析的支持劑較常用的是硅膠、氧化鋁、硅藻118自制薄層板玻板：5x20，10x20，20x20，20x40，20x100cm硅膠：表面積300－500m2/g,孔徑100nm,粒度10-40um,高效薄層用5－10um.商品硅膠字母的意義：H

表示不含黏合劑；F

表示含熒光物質(zhì)；G

表示含鍛石膏黏合劑；F254表示在紫外254nm照射下發(fā)熒光；F365表示用365nm激發(fā)；P

表示制備用硅膠；自制薄層板玻板：5x20，10x20，20x20，20119板的大小板寬可增加制備量；長(zhǎng)度不宜太長(zhǎng)，太長(zhǎng)展開(kāi)慢，且由于擴(kuò)散的原因，太長(zhǎng)對(duì)分離沒(méi)有多大改進(jìn)，長(zhǎng)度一般20厘米；制備板的方法有干法＆濕法兩種，但濕法用的更廣泛些。板的大小板寬可增加制備量；120干法制板干法制備薄板可達(dá)7mm，不需要黏合劑.制備方法也簡(jiǎn)單：在長(zhǎng)方形的金屬或玻璃淺盤中松散地裝上吸附劑就可以了，可以用玻棒或相應(yīng)的工具把表面刮平。干法制板干法制備薄板可達(dá)7mm，不需要黏合劑.制備方法也簡(jiǎn)單121濕法制板濕法制板可分為平鋪法＆涂鋪法。平鋪法：待鋪玻璃板兩邊用玻璃做邊框，將調(diào)配好的吸附劑倒在玻璃板上，然后用玻璃棒刮平，去掉邊框即可。涂鋪法：一般用涂鋪器涂鋪的方法。常用的黏合劑：10－15％的鍛石膏，0.2-10%的羧甲基纖維素鈉，5％聚丙烯酸或5％的淀粉。濕法制板濕法制板可分為平鋪法＆涂鋪法。122鋪板器TD－II型全自動(dòng)薄層鋪板機(jī)

薄層板干燥架

薄層色譜玻璃板

CAMAG手動(dòng)鋪板器

自動(dòng)鋪板器

TLC薄層板存儲(chǔ)盒

鋪板器TD－II型全自動(dòng)薄層鋪板機(jī)

薄層板干燥架

薄層色譜123板的厚度分析薄板：0.25mm;制備薄板：0.5-3mm;由此可計(jì)算制備1mm厚，20x20mm的板需要20－25g硅膠。也有人用高比例的黏合劑制備5－10mm厚的板，但分離能力差，一般用于初步分離；板的厚度分析薄板：0.25mm;124常見(jiàn)的三種薄層斑點(diǎn)圖薄層色譜理論踏板數(shù)：N=16（d/w)D為原定到斑點(diǎn)中心距離，w斑點(diǎn)寬度。常見(jiàn)的三種薄層斑點(diǎn)圖薄層色譜理論踏板數(shù)：N=16（d/w125二、展開(kāi)槽二、展開(kāi)槽126第二節(jié)實(shí)驗(yàn)方法制備好的薄板在自然條件下干燥12－24h,然后在120度活化30min-4h,活化好的板應(yīng)保存在干燥器中?；罨瘻囟瘸^(guò)130度，有可能使石膏脫水。第二節(jié)實(shí)驗(yàn)方法制備好的薄板在自然條件下干燥12－24h,然127上樣前對(duì)薄板預(yù)展開(kāi)目的：除去吸附劑中的雜質(zhì)。方法：用氯仿－甲醇（1：1）或者乙醚（含1％氨水或1％乙酸，根據(jù)后面的展開(kāi)劑含酸或堿來(lái)選擇）在展開(kāi)槽中展開(kāi)，然后取出真空干燥備用。上樣前對(duì)薄板預(yù)展開(kāi)目的：除去吸附劑中的雜質(zhì)。128樣品配制樣品盡可能溶解在揮發(fā)性大的溶劑中，溶劑的極性要盡量?。粯悠返臐舛瓤刂圃谏蠘雍衲芫鶆蜾侀_(kāi)，而不在吸附劑表面結(jié)晶，制備薄層色譜上樣濃度一般為2－10％；樣品配制樣品盡可能溶解在揮發(fā)性大的溶劑中，溶劑的極性要盡量小129鋪板用的勻漿不宜過(guò)稠或過(guò)?。哼^(guò)稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)或停頓造成的層紋；過(guò)稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G:水=1：2～3，硅膠G:羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。

鋪板用的勻漿不宜過(guò)稠或過(guò)?。哼^(guò)稠，板容易出現(xiàn)拖動(dòng)或停頓造成的130一、上樣

上樣量：薄板的容量與薄板的厚度的平方根成正比，如2.5mm厚的板的上樣量是1mm厚的兩倍。實(shí)驗(yàn)表明：20x20cm分析板5mg1mm厚20x20cm制備板5-25mg判斷是否過(guò)載：看斑點(diǎn)有無(wú)拖尾或伸舌或變形。實(shí)驗(yàn)前，反復(fù)實(shí)驗(yàn)?zāi)愁惐“鍖?duì)具體樣品的容量。一、上樣上樣量：薄板的容量與薄板的厚度的平方根成正比，如131上樣位置距離薄板一端約2.5cm，3-5mm條形，條的長(zhǎng)度以兩邊距離板的邊緣1-3mm上樣位置距離薄板一端約2.5cm，3-5mm條形，條的長(zhǎng)度以132上樣時(shí)可以重復(fù)上，但需溶劑揮發(fā)干再上。用強(qiáng)極性溶劑（如甲醇）展開(kāi)1-2cm可壓縮條帶，然后取出揮發(fā)干；上樣不能破壞薄板表面；可在上樣的地方挖一V型槽，槽的上端1-2mm寬，深度為吸附劑的一半；上樣處的吸附劑挖去，用拌有樣品的吸附劑填平；上樣時(shí)可以重復(fù)上，但需溶劑揮發(fā)干再上。用強(qiáng)極性溶劑（如甲醇）133點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣儀134二、展開(kāi)找合適溶劑的方法微量源盤技術(shù)尋找合適的溶劑：將試樣點(diǎn)于薄層板上干燥使其成一圓點(diǎn)，在圓點(diǎn)上滴溶劑，如果被試物留在圓點(diǎn)不動(dòng)，需增加溶劑的極性或增大洗脫量；如被試物隨溶劑跑德太快甚至達(dá)到前沿，則需用更低極性的溶劑。微型薄板：實(shí)驗(yàn)室常用顯微鏡的載玻片來(lái)制薄板，手工涂鋪，一次分離只有幾分鐘。二、展開(kāi)找合適溶劑的方法135StahlE.ThinLayerChromatography.2ndEd,SpringerVerlag/Academicpress.1969被分離物質(zhì)為非極性：用非極性展開(kāi)劑，吸附劑的活性要高。被分離物質(zhì)為強(qiáng)極性：用強(qiáng)極性展開(kāi)劑，選擇強(qiáng)極性吸附劑，此時(shí)吸附劑的活性較低。被分離物質(zhì)為中等極性：選中等極性展開(kāi)劑，用中等活性的吸附劑。選擇展開(kāi)劑，要依據(jù)溶劑極性和他們的混溶性，溶劑對(duì)被分析物的溶解性，以及被分析物的結(jié)構(gòu)。StahlE.ThinLayerChromatogr136化合物極性化合物極性環(huán)已烷-0.2氯仿4.1石油醚（Ⅰ類，30~60℃）、石油醚（Ⅱ類，60~90℃）、正已烷0乙醇4.3甲苯2.4乙酸乙酯4.4二甲苯2.5甲醇5.1苯2.7丙酮5.1二氯甲烷3.1乙腈5.8異丙醇3.