吡格列酮對糖尿病大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)影響的實驗研究-圖文

吡格列酮對糖尿病大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)影響的實驗研究郭延軍,石益海,陸淼,劉海燕,高秀麗,李秀梅,王瑩(大慶油田總醫(yī)院,黑龍江大慶163001摘要:目的探討噻唑烷二酮類藥物(TZD吡格列酮對糖尿病大鼠腎臟的保護作用。方法建立STZ(鏈脲佐菌素誘導的糖尿病動物模型,隨機分為正常對照組、正常對照治療組、糖尿病組、糖尿病治療組。結(jié)果糖尿病組腎重/體重顯著高于正常對照組及正常對照治療組(P<0105,而糖尿病治療組顯著低于糖尿病組(P<0105。各組腎小球內(nèi)細胞外基質(zhì)蓄積、基底膜增厚及腎小球系膜細胞增生指標,糖尿病組均高于正常對照組、正常對照治療組和糖尿病治療組(P<0105經(jīng)TZD治療后可減輕。結(jié)論TZD類藥物可以抑制大鼠糖尿病腎小球系膜細胞增生、基底膜基質(zhì)合成以及腎小球內(nèi)細胞外基質(zhì)蓄積,對糖尿病大鼠腎臟有保護作用。關鍵詞:醫(yī)學實驗動物學;噻唑烷二酮類藥物;糖尿病腎病;動物模型學科分類代碼:3101440中圖分類號:R36111文獻標識碼:A文章編號:1004-5775(200503-0180-05ExperimentalStudyonAffectionofUltra-microstructureofRatDiabetesKidneyTreatedwithPioglitazoneGUOYan-jun,SHIYi-hai,LUMiao,etal.(TheGeneralHospitalofDaqingOilfield,Daqing163001,ChinaAbstract:ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectsandthemechanismofthiazolinedineonkidneyofdia2beticrats.MethodsTheanimalmodelwasinducedbySTZ.Wistarratsweredividedintonormalcontrolgroup(Agroup,normaltherapygroup(Bgroup,diabeticcontrolgroup(Cgroupanddiabetictherapygroup(Dgrouprandomly.ResultsThekw/bwingroupCwashigherthangroupAandB(P<0.05.ButitwasloweringroupDthangroupC.Theaccumulationofextracellularstroma,thicknessofbasemembraneandproliferationofmesentericcellingroupCwerehigherthanthoseinothergroupsbutcoulddecreaseafterTZDtreatment.ConclusionTZDdrugscouldinhibitaccumulationofextracellularstroma,thicknessofbasemem2braneandproliferationofmesentericcellsothattoprotecttheratkidney.Keywords:TZD;Diabeticnephropathy;Animalmodel目前,對糖尿病腎病(DN的發(fā)病機制尚不清楚,而且對DN缺乏非常有效地干預手段。有研究表明,胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物(TZD作為PPAR-γ的配體,不但可以改善糖代謝,尚可減輕胰島素抵抗,改善β細胞功能和血脂紊亂〔1,2,3〕,個別報道TZDs對糖尿病慢性并發(fā)癥也有一定療效〔3〕。為此,本實驗采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ誘發(fā)大鼠DN的動物模型,擬觀察DN的大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)改變,為DN的防治提供新方法和實驗依據(jù)。1材料與方法111材料11111主要試劑:鏈脲佐菌素(STZ:購于sigma公司;Wistar大鼠:由吉林大學動物實驗中心提供,全部雄性;TZD(鹽酸吡格列酮:購于北京太平洋藥業(yè)有限公司,每片15mg。11112主要儀器:透射電子顯微鏡:JEM-1200EX型,日本;光學顯微鏡及攝像系統(tǒng):Olympus,日本。112方法11211糖尿病動物模型的建立健康雄性Wistar大鼠購自吉林大學實驗動物中心,鼠齡12周,常規(guī)飼養(yǎng)1周后,稱重。體重182~301g,平均體重235g,按于德民等方法建立STZ糖尿病模型〔4〕。采用0.1mmol/L枸椽緩沖液配成的1%鏈脲佐菌素(STZ溶液,以55mg/kg體重單次腹腔注射STZ,72h后剪斷尾尖用血糖儀測血糖,凡血糖濃度≥16.67mmol/L作為糖尿病大鼠。實驗期間動物自由飲水、飲食,未使用胰島素及其他降血糖藥物。11212動物分組健康雄性大鼠隨機分為兩組,包括正常對照組(NC,正常對照治療組(NCT;雄性成模糖尿病大鼠隨機分為兩組,包括糖尿病組(DM,糖尿病治療組(DMT。每組10只。11213觀察指標各治療組于成模3d后給藥,TZD類藥物成人劑量15~30mg/d,大鼠所用劑量為成人治療劑量的25~50倍。吡格列酮藥物配成溶液,每天15:00灌胃1次。DMT組及NCT組均給予鹽酸毗格列酮3mg/kg,NC組僅給予等量生理鹽水灌胃。每周稱重以及測血糖1次。在實驗12周末,分別將50只大鼠處死后迅速取出雙腎,濾紙吸干稱重,一側(cè)腎臟放入10%福爾馬林固定液中,以備用免疫組織化學檢查;另一側(cè)腎臟取一部分皮質(zhì)放入215%戊二醛固定液,用作電子顯微鏡檢查,剩余部分腎臟置于-180℃液氮中以備提取RNA。11214測定方法1121411腎重/體重(肥大指數(shù):電子稱上面放一濾紙,然后將一腎臟放在上面稱重所得數(shù)據(jù)與大鼠平均體重進行比較,即為腎臟肥大指數(shù)。1121412腎小球平均截面積、基質(zhì)基底膜面密度、毛細血管袢面密度:用PAS染色法,采用腎小球圖象分析腎臟疾病資料管理系統(tǒng)測定。將PAS染色的腎組織切片置光鏡下,放大40倍,圖像攝入醫(yī)用圖像處理系統(tǒng)(TJTY-300。檢測皮質(zhì)區(qū)經(jīng)腎門正切的5個腎小球,計算腎小球截面積。檢測每份標本10個腎小球,計算腎小球基質(zhì)、基底膜與系膜區(qū)面積比為基質(zhì)基底膜面密度。檢測每份標本10個腎小球,計算毛細血管袢與系膜區(qū)面積比為毛細血管袢面密度。以上均取平均值。1121413腎小球細胞總數(shù):用于光鏡的腎組織標本用10%中性甲醛固定,石蠟包埋,4μm切片作PAS染色,選直徑為80~100μm,平均數(shù)為20個腎小球,采用直接計數(shù)法計數(shù)每1個腎小球橫截面陽性細胞核總數(shù)(細胞核數(shù)少于50的腎小球刪除〔5〕,取平均值,但多形核以及一些退變細胞核的碎片除外。1121414基底膜厚度(電鏡下觀察腎臟超微結(jié)構(gòu):(1固定:標本立即放入2.5%戊二醛固定液中,并置入4℃冰箱中進行前固定,前固定4h后,更換成0.05M磷酸緩沖液。最后以1%鋨酸固定液于室溫中進行1h后固定。(2脫水和包埋:①首先依次用50%→70%→95%無水酒精進行脫水,在每種酒精中停留30min;②用氧化丙稀透明3次,每次10~15min;③氧化丙稀與Epon812工作液等量混合,對組織進行浸透;④新鮮配制的Epon812工作液包埋組織數(shù)小時,使之逐漸固化;⑤將包埋組織的Epon812固化塊逐漸加高溫度(不超過60℃,使之聚合變硬,最后呈黃色透明狀。(3切片:LKB-Ⅲ型超薄切片機半薄切片定位后做超薄切片,醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色,JEM-1200型透射電鏡觀察攝片。各組大鼠電鏡圖像攝入醫(yī)用圖像處理系統(tǒng)計算基底膜厚度。113統(tǒng)計學處理應用SPSS10統(tǒng)計軟件做數(shù)據(jù)處理分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示(x±s,多組間比較用方差分析,P<0105有顯著性差異。2結(jié)果211TZD對各組血壓、血糖、腎重/體重(肥大指數(shù)、24h尿蛋白定量的影響(見表1。表1各組大鼠一般資料(x±s組別實驗周期(周鼠數(shù)(只血壓(kPa血糖(mmol/L24h尿蛋白定量(g/L腎重/體重(‰正常對照組12101514±1164197±013601012±010063166±0123正常對照治療組12101512±1175128±013801013±010073160±0153糖尿病組12101512±21426188±319#301026±01013#34177±0125#3糖尿病治療組12101610±11422193±4159#301016±0109#3△3180±0190#3△注:與正常對照組比較,#P<0105;與正常對照治療組比較,3P<0105;與糖尿病組比較,△P<0105212TZD對糖尿病大鼠腎臟病理形態(tài)學的影響21211圖1所示:為正常對照組(NC大鼠腎組織結(jié)構(gòu)PAS染色情況,可見有許多袢狀毛細血管,這些毛細血管盤繞成5個毛細血管小葉或節(jié)段,小葉內(nèi)的毛細血管之間有系膜組織相連接,毛細血管之間的吻合支很少。毛細血管腔無壓迫現(xiàn)象,系膜寬度未超過毛細血管直徑。腎小管細胞的游離面有發(fā)達的刷狀緣,PAS染色呈深紅色,管腔面規(guī)則,胞質(zhì)細顆粒狀,胞核圓形,染色質(zhì)細膩。21212圖2所示:為糖尿病組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)PAS染色情況,可見系膜增生,增生的系膜組織對腎小球毛細血管袢有明顯壓迫現(xiàn)象和破壞作用,受擠壓的毛細血管出現(xiàn)萎陷乃至消失,系膜寬度略超過毛細血管直徑,呈彌漫分布。21213圖3所示:為正常對照組大鼠腎組織電鏡超微結(jié)構(gòu),電鏡下可見足細胞從胞體伸出幾個大的突起,在依次分出次級突起。足突相互形成指狀相嵌的交叉狀,呈薄片狀與基底膜相接觸。足突分布均勻,無融合及假絨毛樣改變現(xiàn)象。腎小球毛細血管基底膜位于內(nèi)皮細胞和上皮細胞之間,是一層連續(xù)的半透膜。可見基底膜均勻一致,內(nèi)疏松層、中間的致密層和外疏松層光滑,無電子致密物沉積。21214圖4及圖5所示:為糖尿病大鼠腎組織電鏡超微結(jié)構(gòu),電鏡下可見系膜區(qū)系膜基質(zhì)增生,系膜細胞輕度增生。圖1正常對照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)PAS(×4002糖尿病組(DM大鼠腎組織結(jié)構(gòu)PAS染色(×400圖3電鏡下正常對照組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)(×60004電鏡下糖尿病組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)a(×5000圖5電鏡下糖尿病組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)(×10000圖6電鏡下糖尿病治療組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)(×10000上皮細胞的足突輕度融合,使原來附于基底的排列有序的足狀突起代之以帶狀結(jié)構(gòu),貼敷于基底膜上。毛細血管基底膜局部增厚,基底膜樣物質(zhì)均勻增多,基底膜的微細結(jié)構(gòu)消失。毛細血管內(nèi)皮細胞核染色質(zhì)趨邊凝聚。21215圖6所示:為糖尿病治療組大鼠腎組織電鏡超微結(jié)構(gòu),電鏡下可見系膜區(qū)無系膜基質(zhì)增生,無系膜細胞增生。上皮細胞的足突融合減輕,毛細血管基底膜無增厚。213各組大鼠腎組織形態(tài)學指標(12周后腎臟病理參數(shù)比較21311各組大鼠腎組織基質(zhì)基底膜面密度、腎小球平均截面積、毛細血管袢面密度比較(見表2表2各組大鼠腎小球形態(tài)學指標(12周后腎臟病理參數(shù)比較(x±s組別鼠數(shù)(只基質(zhì)基底膜面密度腎小球平均截面積毛細血管袢面密度正常對照組100127±010*******±711100173±0105正常對照治療組100125±010*******±61160175±0105糖尿病組100176±0111#3489142±13145#3015±0107#3糖尿病治療組100128±0104△288130±8102△0176±0103△注:與正常對照組比較,#P<0105;與正常對照治療組比較,3P<0105;與糖尿病組比較,△P<010521312各組大鼠腎組織腎小球內(nèi)總細胞數(shù)的比較(見表3表3各組大鼠腎小球內(nèi)總細胞數(shù)(x±s組別鼠數(shù)(只檢測腎小球數(shù)(個腎小球平均細胞總數(shù)(個/腎小球橫截面正常對照組102081180±11102正常對照治療組102072198±9131糖尿病組1020100137±9188#3糖尿病治療組102082116±3145△注:與正常對照組比較,#P<0105;與正常對照治療組比較,3P<0105;與糖尿病組比較,△P<010521313電鏡觀察各組大鼠腎組織腎小球基底膜厚度(見表4表4電鏡觀察各組大鼠腎組織腎小球基底膜厚度(x±s組別鼠數(shù)(只腎小球基底膜厚度(μm正常對照組101162±0124正常對照治療組101176±0112糖尿病組102166±0137#3糖尿病治療組101171±0114△注:與正常對照組比較,#P<0105;與正常對照治療組比較,3P<0105;與糖尿病組比較,△P<01053討論糖尿病腎病(DN的預后多數(shù)不良,已成為糖尿病病人主要的死亡原因。這主要是因為其腎臟病變是慢性進行性損害,臨床癥狀出現(xiàn)較晚,一般出現(xiàn)尿蛋白時,病程多在10年以上。另外,一個重要原因是糖尿病引起腎臟損傷的主要機制尚不清楚,而且目前缺乏有效地防治藥物,以減緩腎臟的損害〔4,5,6〕。有研究表明,形成DN的多種機制可能與以下幾個方面的因素有關。其中包括循環(huán)障礙、腎血流動力學異常,以及遺傳易感因素等。但其確切機制目前未完全明了,仍需實驗,以進一步闡明DN發(fā)病機制。最近新一代噻唑烷二酮類胰島素增敏劑—鹽酸吡格列酮,成為新世紀治療糖尿病的一類新藥。但它是否對DN有防治作用以及其作用機制,目前尚不完全清楚。本實驗采用單次腹腔注射STZ制成1型糖尿病模型〔7〕,經(jīng)用鹽酸毗格列酮給大鼠灌胃治療,觀察治療DN的療效,并探討其作用機制。本實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠腎重/體重之比(腎臟肥大指數(shù)明顯高于正常對照組及正常對照治療組,提示糖尿病腎臟肥大,與文獻報道一致〔8,9〕。經(jīng)PAS染色發(fā)現(xiàn),DN病變主要發(fā)生系膜區(qū)。腎小球系膜擴大,腎小球總數(shù)增多,系膜增生,增生的系膜組織對腎小球毛細血管袢有明顯壓迫現(xiàn)象和破壞作用,受擠壓的毛細血管出現(xiàn)萎陷乃至消失,系膜寬度略超過毛細血管直徑,以上說明腎小球系膜出現(xiàn)病變,為中度系膜增生。毛細血管袢面密度減少,而且腎小球平均截面積增大,電鏡還發(fā)現(xiàn)系膜細胞增生、細胞外基質(zhì)堆積、基底膜增厚。這些形態(tài)學改變的結(jié)果,一方面再次證明DN模型成功,另一方面也證明了DN發(fā)病的機制,可能是由于腎小球系膜細胞增生及細胞外基質(zhì)堆積,腎小球系膜擴大,從而發(fā)生以下幾種情況:(1對腎小球毛細血管袢失去支持和保護作用;(2系膜區(qū)是血漿大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運通道,系膜區(qū)發(fā)生病變后,不能或不易通過濾過屏障的大分子物質(zhì)以及沉淀于毛細血管壁的特殊物質(zhì)(免疫復合物等,均不能通過系膜細胞間隙或系膜通道進入淋巴管和血管,或通過血管壁進入腎小管;(3系膜細胞具有平滑肌細胞的結(jié)構(gòu)和功能,并有血管緊張素Ⅱ(AngiotensionⅡ的受體,使之收縮,而對前列腺素E2也較敏感,使之舒張,系膜細胞增生后,系膜細胞的收縮與舒張失調(diào),調(diào)節(jié)腎小球的血流狀態(tài)發(fā)生紊亂,并使系膜細胞間隙或系膜通道的體積變化受阻,從而影響血漿和大分子物質(zhì)的腎小球內(nèi)移動;(4系膜細胞增生,則產(chǎn)生大量的系膜基質(zhì)或基質(zhì)樣物質(zhì),使基底膜增厚;(5增生的系膜細胞可產(chǎn)生大量的膠原纖維和基質(zhì);(6系膜細胞增生可產(chǎn)生多種細胞因子,使系膜增生及腎小球動脈硬化,最終出現(xiàn)糖尿病腎臟肥大〔10,11〕。經(jīng)TZDs類藥物治療后,腎臟肥大指數(shù)下降,糖尿病組細胞外基質(zhì)明顯減少,腎小球基底膜厚度明顯減少,腎小球總數(shù)減少,腎小球系膜細胞增生減輕。這些形態(tài)學實驗結(jié)果也證明了TZDs類藥物對DN有治療作用,其機制可能是TZDs類藥物直接作用于腎小球細胞,抑制腎小球細胞增生及細胞外基生精沖劑對精索靜脈曲張大鼠睪丸組織抗過氧化損傷的實驗研究安立文,隋勇,侯高峰(黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江哈爾濱150040摘要:目的探討生精沖劑對精索靜脈曲張睪丸中超氧化物歧化酶(SOD、過氧化氫酶(CAT、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE活性及脂質(zhì)過氧化物(LPO、一氧化氮(NO含量的影響。方法測定治療組大鼠睪丸中SOD、CAT、ACE活性及LPO、NO含量與模型組的差別。結(jié)果治療組大鼠睪丸中SOD、CAT、ACE活性高于模型組,LPO、NO含量低于對照組(P<0101。結(jié)論生精沖劑對精索靜脈曲張生成的睪丸脂質(zhì)過氧化損傷具有保護作用。關鍵詞:藥理學;生精沖劑;精索靜脈曲張;睪丸損傷;SOD;CAT;ACE;LPO;NO學科分類代碼:31014410中圖分類號:R285文獻標識碼:A文章編號:1004-5775(200503-0184-02ExperimentalStudyonAnti-peroxidationInjuryofShengjingInstantPowderforTestisTissueofVaricoceleofRatANLi-wen,SHUIYong,HOUGao-feng(TheFirstAffiliatedHospitalofTCMUniversityofHeilongjiang,Harbin150040,ChinaAbstract:ObjectivetostudythechangeoftheactivityofSOD,CAT,ACEandthecontentofLPO,NOinvaricoceletestisinducedbyshengjinginstantpowder.MethodsToassaythecontentofLPO,NOandtheactivityofSOD,CATandACEinvaricoceletestis.ResultsTheactivityofSOD,CATandACEwashigherincure-grouprattestisthanthatinmodel-group.OnthecontrarythecontentofLPOandNOincuregroupwaslower.ConclusionShengjingin2stantpowdermightprotectthetestisfrontheinjuryoflipidperoxidationinvaricocele.Keywords:Shengjinginstantpowder;Varicocele;Testisinjury;SOD;CAT質(zhì)堆積,保護腎小球濾過膜的電荷和分子屏障,阻止蛋白的濾出,從而發(fā)揮降低尿蛋白作用,進而促進腎小球系膜損傷的修復。TZD對人類DN的治療效果還有待于更多的臨床研究。本實驗為臨床的應用提供了可靠的實驗依據(jù)。參考文獻:〔1〕SaltielAR,OlefskyJM.Thiazolidinedionesinthetreatmentofinsulinresistanceandtype2dia2betes〔J〕.Diabetes,1996,45:1661.〔2〕SpencerCM,MarkhamA.Troglitazone〔J〕.Drugs,1997,54:89~101.〔3〕NolanJJ,LudvikB,BeerdsenP,etal.Im2provementinglucosetoleranceandinsulinresistanceinobesssubjectstreatedwithtroglitazone〔J〕.NEnglJMed,1994,331:1188~1193.〔4〕于德民,吳銳,尹濰,等1實驗性鏈脲佐菌素糖尿病動物模型的研究〔J〕1中國糖尿病雜志,1995,3(2:1051〔5〕莫敬渾,王鍵,張凱珍,等1Ⅱ型糖尿病人